专利名称：空肠弯曲杆菌pcr检测试剂盒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域中细菌的分子生物学检测试剂盒，特别是涉及空肠弯曲杆菌PCR检测试剂盒及其应用。
背景技术：
空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)是弯曲杆菌属的一种，是近十几年来受到国内外广泛重视的人畜共患病原菌，主要可引起人体急性肠炎和食物中毒，并伴发反应性关节炎、肝炎、瑞特氏病和格林-巴利综合症等免疫性损伤性疾病。在兽医学上，可引起家畜流产不孕、乳房炎及幼畜禽腹泻和家禽肝炎。该菌通过动物带菌者或患病者的粪便进入环境中，在水环境中可以进入一种称为“活的非可培养”(viable but nonculturerable， VBNC)状态的休眠期，处于VBNC状态的细菌在特定条件下可以复苏且具有致病性 (Vanniasinkam等，1999)。接触畜禽类，或食入受到污染的禽制品、水源和牛奶是该菌感染人体的主要途径。流行病学调查表明，该菌作为肠炎的病因仅次于沙门氏菌和志贺氏菌，在很多地区甚至有超过沙门氏菌而居首位的趋势(Sahin等，2003)。建立空肠弯曲杆菌快速、 特异性的分离和检测方法，是有效控制和预防该类食源性传染病的关键所在。空肠弯曲杆菌为微需氧菌，培养条件苛刻，在25°C不生长，42°C生长良好，容易进入VBNC状态。这些特点使得常规的分离培养和生化鉴定空肠弯曲杆菌耗时费力、灵敏度不高，无法充分满足临床检验的要求，当出现爆发疫情时，更无法满足快速诊断的需要。而已有的空肠弯曲杆菌分子生物学检测方法多使用环介导等温扩增技术或实时荧光定量PCR技术(CN1598544A、 CN101886120A、CN101886133A等)，或多或少也存在设备复杂、操作步骤多的问题。因此提供一种快速、简单、可靠的能定性检测空肠弯曲杆菌试剂盒仍然十分必要。
发明内容
针对背景技术中列举的问题，本发明一方面提供了一种检测空肠弯曲杆菌的试剂盒，其包括一对针对空肠弯曲杆菌马尿酸酶(HipO)基因的保守区域设计的特异性引物上游引物 Hl 5，-ctgaacttgccgattcggata-3，(SEQ ID NO :1)下游引物 H2 5，-aggcaattcccgactggaca-3，(SEQ ID NO :2)进一步的，本发明的试剂盒还包括10XPCR缓冲液、2. 5mmol/L的dNTP、2. 5U/μ L 的Taq酶、25mmol/L的Mg2+等PCR反应中常用的试剂。另一方面，本发明还提供了本发明的试剂盒在检测临床样本里存在的空肠弯曲杆菌中的应用。本发明试剂盒的使用步骤为跟据需要直接检测样品或将样品使用Bolton培养基增菌，然后使用DNA提取试剂盒提取待测样品DNA，制备样品DNA模板。使用本发明提供的试剂盒构建PCR扩增体系，PCR扩增体系(25 μ L)为10XPCR 缓冲液 2. 5μ L、2. 5mmol/L 的 dNTPl. 0μ L、2. 5υ/μ L 的 Taq 酶 0. 4μ L、25mmol/L 的Mg2+2. 0 μ L、l. 5 μ M的引物对1. 0 μ L、样品DNA模板溶液2 μ L、无菌水16. 1 μ L。PCR循环参数为94°C预变性5分钟；随后35个循环，每个循环程序为94°C变性 30秒、65°C退火30秒、72°C延伸30秒；循环结束后72°C延伸10分钟，最后降温至12°C，结束PCR程序。进行电泳并使用凝胶成像仪观察结果，如果能扩增出276bp左右的片段，则表明样品中含有空肠弯曲杆菌。
附图显示了使用本发明公开的方法和试剂盒检测空肠弯曲杆菌ATCC33560(泳道 1)、空肠弯曲杆菌ATCC29428 (泳道2)、埃希氏大肠杆菌ATCC8739 (泳道3)、结肠弯曲杆菌 ATCC43478 (泳道4)、福氏志贺菌ATCC12022 (泳道5)、无菌超纯水(泳道6)的结果。
具体实施例方式实施例1检测空肠弯曲杆菌的引物设计参照GeneBank收录的空肠弯曲杆菌基因组序列，将其和与之基因组结构相似结肠弯曲杆菌序列比对，选择马尿酸酶(HipO)基因的保守区域，使用软件Primer Premier设计一对引物，序列如下上游引物 Hl 5，-ctgaacttgccgattcggata-3，(SEQ ID NO :1)下游引物 H2 5，-aggcaattcccgactggaca-3，(SEQ ID NO :2)。实施例2空肠弯曲杆菌PCR检测方法的建立使用本领域常规方法合成实施例1中设计的探针H1、H2。根据需要直接检测样品或将样品使用Bolton培养基增菌，然后使用DNA提取试剂盒提取待测样品DNA，制备样品DNA模板。PCR 扩增体系(25 μ L)为10 X PCR 缓冲液 2. 5 μ L、2. 5mmol/L 的 dNTPl. 0 μ L、 2. 5U/ μ L 的 Taq 酶 0. 4 μ L、25mmol/L 的 Mg2+2. 0 μ L、1· 5 μ M 的引物对 1. 0 μ L、样品 DNA 模板溶液2 μ L、无菌水16. 1 μ L0PCR循环参数为94°C预变性5分钟；随后35个循环，每个循环程序为94°C变性 30秒、65°C退火30秒、72°C延伸30秒；循环结束后72°C延伸10分钟，最后降温至12°C，结束PCR程序。电泳并使用凝胶成像仪观察结果，如果能扩增出276bp左右的片段，则表明样品中含有空肠弯曲杆菌。实施例3空肠弯曲杆菌PCR检测试剂盒的特异性提取空肠弯曲杆菌ATCC33560、空肠弯曲杆菌ATCC29428、埃希氏大肠杆菌 ATCC8739、结肠弯曲杆菌ATCC43478、福氏志贺菌ATCC12022 (上述菌种均购买自美国标准菌种收藏所ATCC)的DNA作为模板，按照实施例2中的PCR检测方法检测，以验证该检测方法的特异性。检测结果如说明书附图所示，仅空肠弯曲杆菌ATCC33560(泳道1)、空肠弯曲杆菌ATCC29428(泳道2)扩增出预期大小的片段(276bp)，几种近似的菌株埃希氏大肠杆菌ATCC8739、结肠弯曲杆菌ATCC43478、福氏志贺菌ATCC12022和无菌超纯水(泳道6)均未扩增出任何片段，说明本发明提供的检测方法具备良好的特异性。
实施例4空肠弯曲杆菌PCR检测方法的灵敏度将空肠弯曲杆菌ATCC33560加入Bolton培养基中增菌48小时。使用增菌液制备浓度为 18. 7ng、1. 87ng、187pg、18. 7pg、1. 87pg、187fg、18. 7fg、1. 87fg 的 DNA 模板，按照实施例2的检测方法分别对这些模板进行检测。结果18. 7ng、l. 87ng、187pg、18. 7pg、l. 87pg、 187fg的模板均能扩增出276bp的清晰条带，而18. 7fg、l. 87fg的模板则未能扩增出可以清楚辨别的条带(灵敏度试验的电泳图未显示)。试验证明本发明的试剂盒检测灵敏度可达 187fg/DNA模板以上，基本可以满足临床检测的需要。从上述实施例可以看出，相比现有的分子生物学检测方法，本发明提供的空肠弯曲杆菌PCR检测试剂盒成分简单、检测操作方便(仅需一次简单的PCR扩增即可进行电泳判断)；而且具备良好的特异性，能够有效区分空肠弯曲杆菌和常见的类似菌种；还具备 187fg/DNA模板以上的检测灵敏度。
权利要求
1.一种检测空肠弯曲杆菌的试剂盒，包括一对空肠弯曲杆菌特异性引物 Hl 5' -ctgaacttgccgattcggata-3‘ (SEQ ID NO 1),H2 5' -aggcaattcccgactggaca-3‘ (SEQ ID NO :2)。
2.权利要求1所述试剂盒，进一步包括10XPCR缓冲液、2.5mmol/L的dNTP、2. 5U/μ L 的 Taq 酶、25mmol/L 的 Mg2+。
3.权利要求2所述的试剂盒在检测临床样本里存在的空肠弯曲杆菌中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种空肠弯曲杆菌PCR检测试剂盒，其包括一对针对空肠弯曲杆菌马尿酸酶(Hip0)基因的保守区域设计的特异性引物上游引物H1 5’-ctgaacttgccgattcggata-3’(SEQID NO1)、下游引物H2 5’-aggcaattcccgactggaca-3’(SEQ ID NO2)；还提供了本发明的试剂盒在检测临床样本里存在的空肠弯曲杆菌中的应用。本发明的空肠弯曲杆菌PCR检测试剂盒成分简单、检测操作方便；具备良好的特异性，能够有效区分空肠弯曲杆菌和常见的类似菌种；还具备较高的检测灵敏度。
文档编号C12Q1/68GK102329865SQ20111027655
公开日2012年1月25日 申请日期2011年9月9日 优先权日2011年9月9日
发明者吕爱杰, 朱丽萍, 颜世敢 申请人:山东轻工业学院