一种水通道蛋白基因在构建与Hpa1_Xoo相互作用的互作载体中的应用的制作方法

专利名称：一种水通道蛋白基因在构建与Hpa1_Xoo相互作用的互作载体中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种水通道蛋白基因在构建与Hpalx。。相互作用的互作载体中的应用。
背景技术：
水通道蛋白(aquaporin，AQP)是指细胞膜上能选择性地高效转运水分子和一些小分子溶质的膜内在蛋白，属于MIP(major intrinsic protein)超家族，分子量在23 31ku。AQPl蛋白就是一个存在于哺乳动物中的只传输水分子的典型水通道蛋白。根据N、 C端序列保守性，相继鉴定出拟南芥水通道蛋白PIPl和PIP2。到目前为止，在拟南芥、烟草、玉米、豌豆、水稻、大麦叶表皮、滨藜、番茄跟、甜菜贮藏组织、西葫芦种子及向日葵下胚轴薄壁细胞等多种植物中都发现了水通道蛋白，并且真细菌、古生菌、真菌和动物等生物中也有AQP的存在。另外，从蛋白数据库中也发现了大量AQP的同源物，它广泛存在于单子叶和双子叶植物、C3和C4代谢植物中。根据氨基酸序列的同源性分析，它们可能也是AQP。 越来越多的研究表明，植物中往往存在多个AQP同源物且含量丰富，有时甚至是细胞膜的一个主要成分。如菜豆子叶中含丰富的α-TIP同源物，约占细胞可抽提总蛋白的2% ；在拟南芥中，PIPl蛋白占叶与根质膜蛋白的以上；菠菜叶肉细胞中含丰富的质膜AQP，占其质膜总蛋白的20%。水通道蛋白有不同的孔结构，能转运活性氧、气体和一些代谢产物。 harpins能激活植物生长和防卫反应信号通路，但是植物中一个harpin蛋白在一个信号通路中是如何被识别的？ 一个特定harpin的植物受体是什么？这个信号是如何被转导到细胞内的？能把细菌效应蛋白，特别是III型效应子从植物细胞外转运到细胞内的植物转位子是什么？目前都还不清楚。近年来，随着分子生物学技术的迅速发展，研究蛋白质与蛋白质互作的方法也越来越多，体内实验如普通的Y2H、MYTH、荧光共振能量转移、BiFC和蛋白质片段互补技术等， 体外实验如免疫共沉淀、Pull-down assay和表面等离子共振等。酵母双杂交系统是一个在生物学领域具有划时代意义的研究方法，由Fields和 Song等首先在研究真核基因的转录调控起始过程中建立的。因其具有简便、灵敏、高效以及能反应不同蛋白质间在活细胞内的相互作用等特点，因此在基因功能的研究中得到了广泛的应用。其基本原理是真核生物转录的起始位点特异转录激活因子通常具有两个彼此可分割开的结构域，即DNA结合域(DNA-binding domain, BD)与转录激活域(Transcriptional activation domain,AD) (Fields and Song，1989)。这两个结构域各具功能，互不影响，单独的BD虽然能和启动子结合，但不能激活转录。一个完整的激活特定基因表达的激活因子必须同时含有这两个结构域，否则无法完成激活功能。所以可将编码已知蛋白质(常称为诱饵蛋白质，bait protein)的基因与BD融合，在酵母中表达产生融合蛋白质称为BD-Bait ； 编码未知蛋白(常称为捕获蛋白质，prey protein)的基因与AD融合，并在酵母中表达产生另一融合蛋白称为AD-Prey。把这两种融合蛋白共表达于宿主细胞中，如果这两个蛋白能发生相互作用，AD与BD就会形成一个完整的转录激活因子，并激活相应的报告基因的表达。反之，如果待测蛋白间不发生相互作用，则BD和AD不能结合，报告基因的转录也就不能被激活。如果将I^rey换成基因文库，即可直接从基因文库中筛选到能与Bait相互作用蛋白的基因。膜酵母双杂交(membrane yeast two hybrid)利用的原理十分巧妙，应用到了分离泛素系统(split-ubiquitin)，将“诱饵”(bait)即一个完整的膜蛋白，融合到泛素的 C末端(这部分的泛素与一个转录激活因子相连)，而“猎物”或靶蛋白(prey or target protein)则融合在泛素的另一半上，bait和prey的相互作用就会让这两部分的泛素重新构成泛素，从而被一种特异性的蛋白酶(泛素专一性蛋白酶，UBPs)剪切，释放出转录激活因子，这个转录因子转移到细胞核上，开启报告基因的表达。DUAL membrane (Stagl jar et al. ,1998 ；Thaminy et al.，2003)体系利用切割-泛素机制来验证一个完整的膜蛋白与另一个蛋白(完整的膜蛋白或可溶性蛋白)的互作。因为自然状态下这种互作是在膜上检测到的，所以与普通的Y2H相比这个方法更符合生理学的状态，普通的Y2H仅仅能验证完整膜蛋白的亚结构域与其他蛋白质的互作，并且互作发生核内。pulldown assay，是研究蛋白质互作的一种体外测定技术，通常用来对Y2H试验结果进行验证，即验证两个已知蛋白之间的互作。这种技术准确可靠，可以弥补Y2H假阳性偏高的缺陷。Pulldown免疫电泳试验的技术关键在于亲和吸附，使用谷胱甘肽亲和树脂吸附两种互作蛋白中的一种蛋白(称为诱饵蛋白)，捕获与之互作的另一种蛋白(称为猎物蛋白)。其基本原理是将诱饵蛋白-GST (谷胱甘肽巯基转移酶，glutathione S-transferase) 融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上，作为与猎物蛋白亲和的支撑物。将猎物蛋白溶液过柱，可从中捕获与之相互作用的猎物蛋白，洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳分析，从而证实两种蛋白间的相互作用或者筛选相应的目的蛋白。“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。此方法简单易行，操作方便。双分子荧光互补(Bimolecular fluorescence complementation，BiFC)是检测生物体内或体外蛋白质互作的一项新技术。研究发现，GFP或YFP序列有10个位点可以任意插入外源片段而不影响荧光活性。根据这一特性，将GFP或YFP在特定位点裂解为无荧光活性的两个片段，即N端片段(GFPn或YFPn)和C端片段(GFPe或YFPe)。将两个可能发生互作的待测蛋白质基因序列分别与GFPn或YFPn和GFPe或YFPe基因序列连接，分别构建到合适的载体上，同时转化生物细胞，在转化的细胞中共同表达，待测的两个蛋白分别与GFPn 或YFPn和GFPe或YFPe形成融合蛋白。如果GFPn或YFPn和GFPe或YFPe能够相互靠近，形成荧光蛋白生色团重新发出荧光，则表明这两个蛋白发生了互作。FM染料是亲脂类复合物，广泛应用于细胞膜和囊泡化的研究。FM染料溶于水之后，对细胞无毒，并且不发荧光，但是与细胞膜结合后，嵌入细胞膜的外层，发出强烈的荧光。这种膜标签的方法已被用于选择性地观测真核细胞和海胆卵的细胞膜，并研究真核细胞和细菌的内吞和胞吞作用，植物细胞的囊泡运输以及枯草杆菌的孢子形成。在积极释放神经递质的神经元中，这些染料嵌入再生的突触囊泡内，神经末梢被染上明亮的颜色。FM4-64[N-(3-triethylammoniumpropyl)~4~(4~diethylaminophenylhexatrienyl)pyridinium dibromide]是一种吡啶二溴化物，属于苯乙烯类染料。FM 4_64与质膜双层结合后不能被动扩散进入细胞内部，必须通过主动运输的方式进行跨膜运输。目前FM 4-64已逐步在动植物、微生物基因的亚细胞定位，胞吞胞吐、囊泡运输等相关研究中得到应用。

发明内容
本发明的目的是提供水通道蛋白基因PIPl ；4的应用。本发明的目的可通过如下技术方案实现SEQ ID NO. 1所示的水通道蛋白基因PIPl ；4在构建其表达产物与Hpalx。。蛋白相互作用的互作载体中的应用。所述的互作载体优选酵母双杂交系统中使用的重组载体pGBKT7::PIPl ；4，该重组载体是通过以拟南芥生态型Col-O基因组DNA为模板，利用特异性上、下游引物SEQ ID No. 6和SEQ ID No. 7克隆SEQ ID NO. 1所示的PIPl ；4基因，经Nde I/BamH I双酶切后插入到PGBKT7质粒的Nde I/BamH I酶切位点之间所得。所述的互作载体优选酵母双杂交系统中使用的重组载体pGADT7: :PIP1 ；4，该重组载体是通过以拟南芥生态型Col-O基因组DNA为模板，利用特异性上、下游引物SEQ ID No. 6和SEQ ID No. 7克隆SEQ ID NO. 1所示的PIPl ；4基因，经Nde I/BamH I双酶切后插入到pGADT7质粒的Nde I/BamH I酶切位点之间所得。所述的互作载体优选膜酵母双杂交系统中使用的重组载体pBT3-N: :PIP1 ；4，该重组载体是通过以所述的重组载体pGADT7::PIPl ；4为模板，利用特异性上、下游引物SEQ ID No. 12和SEQ ID No. 13克隆得到PIPl ；4基因，Sfi I酶切后连接到pPR3_N质粒的Sfi I酶切位点所得。所述的互作载体优选膜酵母双杂交系统中使用的重组载体pBT3-N: :PIP1 ；4，该重组载体是通过以所述的重组载体pGADT7::PIPl ；4为模板，利用特异性上、下游引物SEQ ID No. 14和SEQ ID No. 15克隆得到PIPl ；4基因，Sfi I酶切后连接到pBT3_STE质粒的 Sfi I酶切位点所得。所述的互作载体优选Pull-down assay中使用的表达水通道蛋白PIPl ；4的重组载体pPICZ-A: :PIP1 ；4，该重组载体是通过以权利要求3所述的重组载体pGADT7 :PIP1 ；4 为模板，利用特异性上、下游引物SEQ ID No. 16和SEQ ID No. 17克隆得到PIPl ；4基因，经 EcoR Ι/Κρη I酶切后连接到酵母胞内表达载体pPICZ_A上的EcoR Ι/Κρη I酶切位点之间所得。所述的互作载体为Pull-down assay中使用的表达水通道蛋白PIPl ；4的重组载体pPICZci -A: :PIP1 ；4，该重组载体是通过以所述的重组载体pGADT7: :PIP1 ；4为模板，利用特异性上、下游引物SEQ ID No. 18和SEQ ID No. 19克隆得到PIPl ；4基因，经EcoR I/ Kpn I酶切后连接到酵母胞外分泌表达载体pPICZ α-A上的EcoR Ι/Κρη I酶切位点之间所得。所述的互作载体优选BiFC杂交系统中使用的重组载体pCAMBIA1301::PIPl ； 4::YN，该重组载体是以pPLV17为模板，以SEQ ID No. M和SEQ ID No. 25为引物扩增黄色荧光蛋白氮末端序列YN，将所得的YN使用)(ba I和I^st I进行酶切并插入到pCAMBIA1301 相应的酶切位点获得PCAMBIA1301: :YN载体；以拟南芥生态型Col-O基因组DNA为模板，以 SEQ ID No.沘和SEQ ID No.四为引物扩增PIPl ；4，将扩增的到得PIPl ；4基因使用Kpn I 和BamH I双酶切后插入到pCAMBIA1301 YN载体的Kpn I和BamH I酶切位点间得到的。
有益效果本发明通过酵母双杂交系统、膜酵母双杂交、pulldown assay、双分子荧光互补等蛋白质互作技术，得到植物水通道蛋白PIPl ；4与Hpaix00之间的相互作用关系。因此SEQ ID NO. 1所示的水通道蛋白基因PIPl ；4可应用于构建其表达产物与HpalX00 相互作用的互作载体。已有的研究证明，harpins能激活植物生长和防卫反应信号通路，但是植物中一个 harpin蛋白在一个信号通路中是如何被识别的？ 一个特定harpin的植物受体是什么？这个信号是如何被转导到细胞内的？能把细菌效应蛋白，特别是III型效应子从植物细胞外转运到细胞内的植物转位子是什么？目前都还不清楚。通过筛选拟南芥的cDNA库，发现 HpalXoo可以与水通道蛋白具有互作关系。而水通道蛋白与植物体的很多生理反应相关。 本发明试图通过构建PIPl ；4与Hpalxoo的互作载体，来揭示这两种蛋白的相互关系，也为 PIPl ；4以后的研究提供物质条件。


图 lpGADT7 :PIP1 ；4、pGBKT7: :PIP1 ；4 载体示意图ADHl promoter =ADHl 基因启动子，SV40 NLS :SV40 核定位信号，GAL4 AD GAL4激活序列；T7 promoter :T7启动子序列；ADHl terminator =ADHl基因终止子；T7 terminator :T7基因终止子；GAL4 DNA-BD :GAL4基因DNA结合序列。图2酵母双杂交系统PIPl ；4与Hpalx。。验证。A. pGADT7: PIPl ;4 与 pGBKT7: Hpalxoo 杂交结果；B. pGBKT7 PIPl ； 4 与 pGADT7: Hpalxoo 杂交结果；C. pGADT7: :PIP1 ；4 与 pGBKT7: ΔΝΤ 杂交结果； C. pGBKT7: :PIP1 ；4 与 pGADT7: Δ NT 杂交结果；PCLl 阳性对照；T71am 阴性对照；Hpal Hpalx。。。蓝色代表具有相互作用，无色代表不具有相互作用。图 3pBT3-N: :PIP1 ；4，pBT3_STE: :PIP1 ；4 载体示意图ρΒΤ3-Ν-ΡΙΡ1 ；4 :pBT3_N::PIP1 ；4 ；pBT3_SET_PIPl ；4 :pBT3_SET::PIP1 ；4 ； pBT3-N-HpalXoo/ANT :pBT3-N: Hpalxoo/Δ NT ；LEU2 :LEU2 gene from S. cerevisiae ；KanR 卡那霉素抗性基因；LexA-VP16 :LexA-VP16转录因子；CUB :泛素炭末端序列；sfi I :sfi I 酶切位点；Amp 氨苄青霉素抗性基因；NubG 突变泛素氮末端序列；HA-tag 六个组氨酸标签。图4膜酵母双杂交验证PIPl ；4与Hpalx。。的互作验证SD-trp-leu 色氨酸和亮氨酸缺失SD培养基；SD-trp-leu-his 色氨酸、亮氨酸和组氨酸缺失SD培养基；SD-trp-leu-his-ade 色氨酸、亮氨酸、组氨酸和腺嘌呤缺失SD培养基；Cub，泛素的C端部分；NubG，泛素N端部分NubI的突变体，即NubI的3 ‘端异亮氨酸替换为甘氨酸。PIPl ；4-Cub与NubG以及APP-Cub与NubG-Hpalx。。组合后，没有酵母菌落的生长；Hpal :Hpalx。。蛋白。图 5pPICZ-A: :PIP1 ；4 和 pPICZ α -A: :PIP1 ；4 载体示意a表示以GST标记的Hpalx。。及其N-末端缺失的ΔΝΤ为诱饵，构建 pET41: :Hpalx。。和 pET41: Δ NT 的示意图；图b 表示以 PIPl ；4 为猎物，构建 pPICZ-A: :PIP1 ；4、pPICZ α -A: :PIP1 ；4、的示意图，并且PIPl ；4的后面加有His-tag。
图 6Pull_down assay 验证 Hpalx。。与 PIPl ；4 的互作“ + ”洗脱液中含有这种物质，“_”代表不含有这种物质，条带代表洗脱液中含有这种物质并可以被His抗体检测出，出现两个条带代表PIPl ；4与Hpalx。。具有互作效应。图 7pCAMBIA1301 PIPl ；4: YN, pCAMBIA1301 Hpalxoo: YC 禾口 PCAMBIA1301: Δ NT: :YC 载体示意图，pCAMBIA1301-PIPl ；4_YFPN :pCAMBIA1301 PIPl ；4: :YFPN ；pCAMBIA1301_Hpalx。。/ Δ NT-YFPc :pCAMBIA1301: =Hpal5i00: YFPC/pcAMBIA1301 ΔΝΤ: :YFPC ；35SP :CaMV35S 启动子；RSIAT 连接肽；YFPn 黄色荧光蛋白氮末端序列；YFPe 绿色荧光蛋白碳末端序列； Nostmt :N0S基因终止子序列；Kpn I, BamH I, Xba I，Pst I 限制性内切酶。图8拟南芥原生质上的BiFC验证Hpalx。。与PIPl ；4的互作拟南芥原生质体上BiFC验证Hpalx。。和PIPl ;4进行互作，表现出绿色荧光， Visible light 可见光；545-580 波长为545-580nm的发射光波长；583 激发光波长 583nm ；527 激发光波长 527nm ；460-490 发射光波长 460_490nm。图9拟南芥叶片上的BiFC验证Hpalx。。与PIPl ；4的互作拟南芥叶片上BiFC验证Hpalx。。和PIPl ；4进行互作，表现出黄色荧光，Visible light 可见光；545-580 波长为545-580nm的发射光波长；583 激发光波长583nm ；527 激发光波长527nm ；460-490 发射光波长460_490歷。图IOFM 4-64产生的荧光与互作蛋白产生荧光的叠加膜特异性染料FM4-64产生的荧光与互作蛋白产生荧光的叠加验证Hpalx。。和 PIPl ;4互作，并且互作发生在细胞膜上。叠合后的荧光表现出橙色荧光，Visible light 可见光；545-580 波长为545-580nm的发射光波长；583 激发光波长583nm ；527 激发光波长 527nm ；460-490 发射光波长 460_490nm。
具体实施例方式下面结合附图对本发明做进一步说明，将有助于本领域的普通技术人员理解本发明，但不以任何形式限制本发明。实施例1酵母双杂交系统载体构建用ExTaq酶(takara购买)从水稻细菌性条斑病菌基因组DNA中用PCR方法扩增Hpalx。。及其HpalX00蛋白N末端53个氨基酸缺失后的序列——Δ NT,从拟南芥生态型 Col-O (种子在http://www. arabidopsis. orR-购买，生长至两片叶)基因组DNA中扩增 PIPl ；4(SEQ ID No. 1)，扩增引物见表 1，扩增条件如下:HpalXoo :95°C，5min ；95°C,30sec, 55 "C，45sec, 72 "C，1. 5min, 30cycles ；72 °C，IOmin ； Δ NT :95 "C，5min ；95 "C，30sec, 55 "C， 45sec, 72 "C，lmin, 30cycles ；72 "C，IOmin ；PIPl ；4 95 "C，5min ；95 "C，Imin, 57 "C，45sec, 72°C，2min,30cycles ；72°C,IOmin0利用TA 克隆的方法，把 Hpalx。。、Δ NT 和 PIPl ；4 克隆到 pMD19_T simple vector (takara公司购买)上，挑选阳性克隆，送样测序并保存阳性克隆，测序正确后，提取阳性克隆的质粒，用Nde I和BamH I (takara购买)双酶切质粒，获得Hpalx。。、ΔNT和PIPl ； 4片段，切胶回收目的片段；同时提取PGBKT7和pGADT7质粒(Clontech Laboratories, Inc.公司购买)JSNde I/BamH I酶切，切胶回收载体片段，T4连接酶(takara购买)分别连接为 PGADT7: PIPl ；4、pGBKT7: :Hpalx。。、pGBKT7: ΔΝΤ、pGADT7: :Hpalx。。、pGADT7: Δ NT 和pGBKT7::PIPl ；4(如图1)，转化DH5a (生兴公司购买)，37°C过夜培养，挑取单克隆摇菌培养，提质粒，酶切验证，保存阳性克隆。

表1基因克隆的相关参数和条件
权利要求
1.SEQ ID NO. 1所示的水通道蛋白基因PIPl ；4在构建其表达产物与Hpalx。。相互作用的互作载体中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的互作载体为酵母双杂交系统中使用的重组载体pGBKT7: :PIP1 ；4，该重组载体是通过以拟南芥生态型Col-O基因组DNA为模板，利用特异性上、下游引物SEQ ID No. 6和SEQ ID No. 7克隆SEQ ID NO. 1所示的PIPl ； 4基因，经Nde I/BamH I双酶切后插入到pGBKT7质粒的Nde I/BamH I酶切位点之间所得。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的互作载体为酵母双杂交系统中使用的重组载体pGADT7: :PIP1 ；4，该重组载体是通过以拟南芥生态型Col-O基因组DNA为模板，利用特异性上、下游引物SEQ ID No. 6和SEQ ID No. 7克隆SEQ ID NO. 1所示的PIPl ； 4基因，经Nde I/BamH I双酶切后插入到pGADT7质粒的Nde I/BamH I酶切位点之间所得。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的互作载体为膜酵母双杂交系统中使用的重组载体ρΒΤ3-Ν::ΡΙΡ1 ；4，该重组载体是通过以权利要求3所述的重组载体 PGADT7: :PIP1 ；4为模板，利用特异性上、下游引物SEQ ID No. 12和SEQ ID No. 13克隆得到PIPl ；4基因，Sfi I酶切后连接到PBT3-N质粒的Sfi I酶切位点所得。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的互作载体为膜酵母双杂交系统中使用的重组载体PBT3-STE: :PIP1 ；4，该重组载体是通过以权利要求3所述的重组载体 PGADT7: :PIP1 ；4为模板，利用特异性上、下游引物SEQ ID No. 14和SEQ ID No. 15克隆得到PIPl ；4基因，Sfi I酶切后连接到pBT3-STE质粒的Sfi I酶切位点所得。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的互作载体为Pull-downassay中使用的表达水通道蛋白PIPl ；4的重组载体pPICZ-A::PIPl ；4，该重组载体是通过以权利要求 3所述的重组载体pGADT7: :PIP1 ；4为模板，利用特异性上、下游引物SEQ ID No. 16和SEQ ID No. 17克隆得到PIPl ；4基因，经EcoR I/Kpn I酶切后连接到酵母胞内表达载体pPICZ_A 上的EcoR Ι/Κρη I酶切位点之间所得。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的互作载体为Pull-downassay中使用的表达水通道蛋白PIPl ；4的重组载体pPICZa-A::PIPl ；4，该重组载体是通过以权利要求3所述的重组载体pGADT7: :PIP1 ；4为模板，利用特异性上、下游引物SEQ ID No. 18和 SEQ ID No. 19克隆得到PIPl ；4基因，经EcoR I/Kpn I酶切后连接到酵母胞外分泌表达载体pPICZ α -A上的EcoR Ι/Κρη I酶切位点之间所得。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的互作载体为BiFC杂交系统中使用的重组载体pCAMBIA1301: :PIP1 ；4: :YN，该重组载体是以pPLV17为模板，以SEQ ID No. 24 和SEQ ID No. 25为引物扩增黄色荧光蛋白氮末端序列YN，将所得的YN使用)(ba I和Pst I进行酶切并插入到PCAMBIA1301相应的酶切位点获得pCAMBIA1301 YN载体；以拟南芥生态型Col-O基因组DNA为模板，以SEQ ID No. 28和SEQ ID No. 29为引物扩增PIPl ；4， 将扩增的到得PIPl ；4基因使用Kpn I和BamH I双酶切后插入到pCAMBIA1301 :YN载体的 Kpn I和BamH I酶切位点间得到的。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，公开了一种水通道蛋白基因在构建与Hpa1Xoo相互作用的互作载体中的应用。本发明通过酵母双杂交系统、膜酵母双杂交、pulldown assay、双分子荧光互补等蛋白质互作技术，得到植物水通道蛋白PIP1；4与Hpa1Xoo之间的相互作用关系。因此SEQ ID NO.1所示的水通道蛋白基因PIP1；4可应用于构建其表达产物与Hpa1Xoo相互作用的互作载体。
文档编号C12N15/81GK102304542SQ201110275929
公开日2012年1月4日 申请日期2011年9月16日 优先权日2011年9月16日
发明者刘昌来, 尤真真, 徐衡, 桑素玲, 董汉松 申请人:南京农业大学