专利名称：云红梨1号金属硫蛋白基因PyMT1及其原核表达载体与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及云红梨1号金属硫蛋白基因/>#77及其原核表达载体以及在提高微生物重金属离子耐受性上应用，属于基因工程领域。
背景技术：
金属硫蛋白(Metallothionein，MT)是一类低分子量(6000_9000Da)、高半胱氨酸 (Cys)含量、具有很强的金属结合能力的多肽，且广泛分布于生物界中；金属硫蛋白不但可以参与体内微量元素的储存、转运和代谢，而且具有拮抗电离辐射，清除自由基以及对重金属有解毒作用。研究表明，植物金属硫蛋白可以通过其大量的Cys残基螯合重金属并清除活性氧，使植物免受氧化损伤，同时还参与机体的生长、发育、生殖、衰老、免疫、应激甚至肿瘤的发生等多方面的生理活动。另外，金属硫蛋白也对提高植物应对自然环境中遇到的低温、干旱、重金属、过氧化氢等逆境胁迫发挥着重要的作用。如何提高植物金属硫蛋白的基因表达，利用分子生物学手段提高植物的抗逆性也是人们长期追求的目标。随着工业的发展，土壤，地表水及地下水被工业“三废”污染越来越严重，尤其以重金属如镉，汞，铅等环境污染最为突出。自50年代日本发生由汞引起的水俣病及近年来我国重金属污染水质的事件屡次发生，重金属造成的环境破坏以及对人类健康构成的危害越来越引起重视。由于MT分子中的大量巯基与金属离子尤其是重金属离子具有很强的结合力，且能被金属诱导合成，应用金属硫蛋白提高生物的重金属离子耐受性及消除重金属污染中的作用越来越成为研究和应用的重点。例如，Jin等发现表达的GST-rgMT融合蛋白的 E. coli提高了对Cu2+，Zn2+和Cd2+的耐受性，与对照相比在添加CuCl2, ZnCl2和CdCl2的培养基中培养6h，l ml细胞干重分别增加0.04 mg、0.17 mg和0. 07 mg。Culotta等也证实了 CRS5金属硫蛋白对植物体内的铜离子的稳定和解毒都起到了重要的作用菊芋在Si2+ 和Cu2+重金属的诱导下份iU在不同组织中的表达出现了大幅的提高；拟南芥的AtMT^^P AtMT3对Cd2+具有一定的抗性；转化豌豆基因菌，Cu2+的累积量与对照相比大幅增加，野生西瓜中的C1MT2具有强的氧自由基清除能力，杂交三叶杨PtdMTs在Cd敏感酵母突变体中表达后，酵母则表现出对Cd的抗性。这些例子表明不同植物的MT对重金属离子都有一定的耐受性。但是果树MT基因报道较少，且云红梨1号中的MT基因的鉴定和功能分析至今未有，由于微生物在治理水污染中有着不可替代的作用，那么如何提微生物吸收耐受重金属离子的能力就成为本领域的技术人员尤为关注的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种云红梨1号金属硫蛋白基因，该基因具有如SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列或编码如SEQ ID NO. 4所示的氨基酸序列。本发明的目的在于提供金属硫蛋白基因/>#77的原核表达载体，一种能产生PyMTl蛋白的含云红梨1号金属硫蛋白基因/>#/7的原核表达载体，金属硫蛋白/>#77基因来源于云红梨1号，其GenBank登录号为FJ393460，PyMTl基因的上游是诱导型Iac启动子。本发明中金属硫蛋白基因PyMTl的原核表达载体通过以下具体步骤构建
(1)根据GenBank上发表的云红梨1号外果皮EST全长基因序列，设计如下特异性引
物
PyMT15‘ GAATTCatgtcgtcgtgctgcggtgg PyMT13' CTCGAGatcttgcagttgcatgggttgc
弓丨物PyMT15’含有限制性内切酶feoTP/识别位点，PyMT13’含有限制性内切酶损o/识别位点；
(2)从云红梨1号中提取RNA，并以RNA为模板用反转录酶合成cDNA，再以云红梨1号 cDNA为模板，采用步骤(1)中设计的特异引物，在PCR扩增体系中对PyMTl基因的cDNA进行扩增，回收纯化/>177基因片段，并将其连接到pMDIS-T载体上，通过PCR检测和酶切检测获得重组载体pMDlS-Zym ；
(3)使用和炀οI对质粒pMD18-/^177进行双酶切获得/>1/7基因，将/>177基因与同样经过双酶切的原核表达载体相连接，转化、抽提质粒进行PCR检测和酶切检测，获得原核重组表达载体；
(4)将重组表达载体转入细菌细胞中，形成重组工程菌，重组工程菌经过发酵培养， IPTG诱导表达金属硫蛋白。本发明方法中所述的起始原核表达载体为pET-32a、PGEX-4t-l。本发明方法中所述的/^ΙΗ基因插入位点在起始原核表达载体的MCS位点。本发明所述原核表达载体在微生物耐受重金属中的应用。本发明利用IPTG诱导型启动子Iac构建/>#77基因的原核表达载体，有利于 PyMTl基因在大肠杆菌细胞中过量表达。本发明提供的上述基因序列是一种具有抗重金属的金属硫蛋白基因，用该基因构建原核表达载体，并将表达载体通过热刺激方法导入细菌细胞中，得到能表达PYMTl蛋白的细菌，具有提高表达宿主菌耐受重金属的能力，并克服它们自身对重金属耐受力低的缺点；经实验证明了云南红梨云红梨1号金属硫蛋白基因 PyMTl确实具有提高微生物重金属离子耐受性的特点，云红梨1号PyMTl基因克隆和功能分析的研究将对进一步研究和开发金属硫蛋白及重金属水质污染都具有重要的科学价值和应用价值。
图1是原核表达载体pETSh-zyi/y的构建流程图。图2是原核表达载体pGEX-4t-l-/yi^7的构建流程图。图3是云红梨1号果皮总RNA电泳检测图，其中1为Iul上样量电泳图，2为2ul 上样量电泳图。图4是PyMTl基因扩增后电泳检测图，其中1为Markerlll，2为/>177基因扩增产物。
图5良PyWTl基因扩增产物胶回收电泳图，其中1为MarkerIII，2为PyMTl基因扩增产物。图6是菌落PCR电泳检测图，其中MIII为Markerlll，泳道1、2、3、5和6为菌落 PCR产物。图7是质粒pET_3h和pMD18T-/ym EcoRl和IAoI双酶切电泳检测图，其中1 为质粒pET-3h双切产物，2为pMDlST-ZyiD双酶切产物，3为质粒pET_32a。图8是pETSh-Zyi^^bo/PI和XhoI的双酶切电泳检测图，其中m33为MarkerIII， 3、6、7、8为构建正确的EcoRl禾ΠIAoI的双酶切产物。 图 9 是 pGEX-4T-l_/ym EcoRl 和XhoI 的双酶切检测图，其中 M 为 MarkerIII，1 和2为构建正确的PGEXIT-I-Zyi^MboTPI禾Π IAoI的双酶切产物。图10是原核表达载体pETSh-ZyiD诱导表达后SDS-PAGE电泳检测图，其中M 是蛋白marker-
0431 ；O为IPTG未诱导的总蛋白；2、4和6为ImM IPTG分别诱导2h、4h和6h后的总
蛋白；沉淀、上清和总蛋白是指经超声破碎后蛋白。图11是pGEX-^-l-Zyi/y BL21融合表达工程菌诱导表达后SDS-PAGE电泳检测图，其中M为蛋白marker-0431，箭头所指为目标产物条带；0、2、4、6和8为融合表达工程菌在37°C、IPTG终浓度为0. 5mM/L条件下，诱导0、2、4、6和8小时的总蛋白；ck为 PGEX-4T-1空载体转化子未诱导的总蛋白。图12是在37°C，IPTG 0. 25 mM/L的条件下，1. ImM/L Si2+对融合表达工程菌和对照菌生长影响对比曲线。图13是在37°C，IPTG 0. 25 mM/L的条件下，2. 25 mM/L Cu2+为对融合表达工程菌和对照菌生长影响对比曲线。图14是在37°C，IPTG 0. 25 mM/L的条件下，0. 6 mM/L Cd2+对融合表达工程菌和对照菌生长影响对比曲线。下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，这些实施例仅用于举例说明本发明，而不对本发明的范围构成任何限制。
具体实施例方式实施例中所涉及的试剂主要分为分子生物学实验试剂、植物遗传转化所需的培养基以及转基因植物鉴定和检测所需的各种试剂。各种限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、 反转录酶、RNA酶抑制剂、dNTP等为日本宝生物工程有限公司(大连)产品，质粒提取试剂盒购自博大泰克生物技术有限公司，TRIzoL Reagent RNA提取试剂购自invitrogen公司， 其余试剂均为国产分析纯；仪器均为分子生物学以及基因工程实验室常用仪器。所有引物序列均在大连宝生物公司合成。本发明实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。实施例1 原核表达载体pGEX-^-l-Zyi/y和pET-SZa-ZyiD的构建
原核表达载体pGEX-4t-l-/yi^7、/7ET-32a-/y#^i的构建流程如图1和图2所示， 首先根据GenBank中云红梨1号外果皮EST的全长基因序列，设计一对引物，并以云红梨1号第一链cDNA为模板扩增，得到尸譯的全长cDNA序列，回收并纯化/>177全长基因片段后，将其连接到PMD18-T载体上获得pMD18-/ym ；用EcoRl和炀ο I双酶切 pMDX^-PyMTl,pGEX-4t-1和pET3h_乃汝，回收纯化/>177基因片段以及载体大片段pET_3h 和pGEX-4t-l，然后连接、获得重组质粒pGEX-4t-1-/^177和pET3h_PyMTl，它含有启动子 lac，其后紧接/>#77基因。具体构建过程如下
一、云红梨1号金属硫蛋白基因的cDNA扩增及TA克隆 1、RNA粗提
根据云红梨1号金属硫蛋白基因/^ΙΗ (FJ393460)全长序列，设计如下一对引物 PyMT15' GAATTCatgtcgtcgtgctgcggtgg,划线处为酶切位点 EcoRY PyMT13' CTCGAGatcttgcagttgcatgggttgc,划线处为酶切位点损οI 并以云红梨1号红色果皮为材料，使用异硫氰酸胍法提取云红梨1号总RNA，具体操作如下用液氮将0. Ig红色果皮研磨成粉末以后，加入Iml RNA提取液，再研磨后，转入aiil 离心管中，再加入1/10体积的2 M醋酸钠(pH4.0-4.2)；颠倒EP管数次，混勻之后，接着加入等体积的氯仿和异戊醇混合液(氯仿异戊醇=24:1)，盖紧离心管盖，剧烈摇动aiiin，冰上静置5 min后，4 °C、12000rpm离心15 min ；取上清于新离心管中，加入等体积的氯仿，盖紧离心管盖，剧烈摇动anin，冰上静置5 min后，4 °C、12000rpm离心15 min ；取上清于新的EP管，加入等体积异丙醇在_20°C沉淀RNA 30 min, 4 "C、12000rpm离心15 min,让RNA 沉淀在管底；DEPC水配制的75%乙醇清洗RNA沉淀两次；4 V、13000rpm离心5 min ；用移液枪尽量吸去75%乙醇；真空干燥aiiin后，加入30 μ IDEPC处理水使RNA完全溶解；使用 1. 2%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA (见图3)。
2、除去粗提液中DNA基因组及RNA的纯化
在1. 5 ml离心管中依次加入总RNA 20 μ g, 10*DNA酶I缓冲液5 μ 1，DNase I (5U/ μ 1) 2 μ 1，RNA酶抑制剂(40U/μ 1)0. 5 μ 1，使用DEPC水处理补足50 μ 1 ;37 °C反应30 min ；加入250μ 1 DEPC水处理后，加入等量苯酚、氯仿和异戊醇混合液(苯酚氯仿异戊醇 =25 : :1)，充分混勻；4 0C ,13000 rpm离心10 min ；取上清于新的离心管，加入等体积氯仿和异戊醇混合液(氯仿异戊醇=24 :1)，充分混勻；4 0C ,13000 rpm离心10 min ；取上清于新的离心管，加入1/10体积的3 M醋酸钠(pH5. 2)，混勻，再加入等量的异丙醇，-20 °C沉淀30 min ；4 °C ,13000 rpm离心15 min回收沉淀，用70%乙醇清洗两次；真空干燥； 用适量DEPC水处理充分溶解后，取2 μ 1进行琼脂糖凝胶电泳检测是否除去基因组，其余的-20 °C保存。3、cDNA 的合成
以RNA为模板，用M-MLV反转录酶合成cDNA，具体步骤为取1. 5ml洁净离心管，分别加入总 RNA 5μ1 (约 5Pg)、01igo (d Τ) 18^lU0mM dNTP W1、DEPC 处理水补足总体积 10μ1 ； 65°C处理5min后，转至冰上IOmin ；向EP管中加入5*RT缓冲液4μ1、25πιΜ MgCl2 4μ1、0. IM DTT 2μ1、RNA酶抑制剂 μ1，25 处理^iiin ；然后向EP中加入 μ 反转录酶(BioDev)； 25°C处理20min，42°C反应70min后；70°C 5min使反转录酶失活，得到cDNA序列。4、扩增/yj/Π 的 cDNA 序列
以cDNA为模板、使用引物PYMT1-T5'禾ΠΡΥΜΤ1-Τ3'进行PCR扩增/^m。PCR的25μ1 体系为:Ex-Taq 缓冲液(10*) 2. 5μ1、Ex-TaqO. 3μ1、cDNA 模板 2μ1、IOmM dNTP 0·4μ1、10μΜ ΡΥΜΤ1-Τ5'引物 μ1、10μΜ ΡΥΜΤ1-Τ3'引物 μ 、使用 ddH20 补足 25μ1。反应条件为94°C2min，30 个循环，94°C变性 45s，55°C退火 45s，72°C有延伸 lmin, 72°C反应 5min。将 PCR 产物在1%的琼脂糖凝胶上进行琼脂糖凝胶电泳检测(如图4)。电泳后，发现目的条带很微弱而非目的条带亮度却很强，使用液氮法重新处理回收/>#77基因片段，具体步骤为切下包含目的基因的凝胶，并放入2 ml离心管中；向离心管中加入Iml脱色液(0. 3M醋酸钠和ImM EDTA)，放在脱色摇床上进行20min脱色；取出凝胶于保鲜膜上，用滤纸吸干胶周围的水分，并用手术刀将其切成小块，移入用注射器针头穿孔、底部放少许石英棉的0. 5ml离心管中；用镊子夹着离心管浸入液氮中，直至小管中无气泡产生，然后将其放入1. 5ml离心管中；室温IOOOrpm离心IOmin ；回收1. 5ml离心管底部的溶胶液，扔掉0.5ml EP;向离心管中加入1/50体积的混合液(0.5M MgCl2 + 5%乙酸)，然后加入等体积的异丙醇；_20°C沉淀30min后，4°C、12000 rpm离心25min ；真空干燥2 min ； 加入适量8μ1的1*ΤΕ (ρΗ8. 0)溶解DNA ；取1 μ 1用于琼脂糖凝胶电泳检测(如图5)。5、PyMTl基因的TA克隆
采用PMD18-T vector kit (TaKaRa)将回收片段连接到pMD18_T载体上，其具体步骤为向 1. 5 ml 离心管中分别加入-.PyMTl cDNA 2. 5 μ (约 250ng)、pMD18T 载体 0. 5 μ (50 ng/μ ),Ligation Solution I (连接液1)3 μ ，用封口膜封好；置于金属浴中16 °C过夜连接。使用热刺激转化方法转化大肠杆菌，具体步骤为将感受态大肠杆菌五C^i DH5 α 100 μ 1加入6μ 1质粒体系中，混合，混合液冰浴20min，42 °C热刺激45s，再冰浴 2min，加入900μ1 SOC液体培养基，37°C、200rpm摇床培养60min ；然后10000 rpm离心 Imin ；在超净台上吸去上清，剩余约100 μ 1时，用枪吸打混勻，转入带有Amp抗性、IPTG、 X-Gal的LB平板上，用无菌三角玻璃棒涂布均勻；37°C过夜培养。挑取白色菌落，接种到带有Amp抗性的LB液体培养基中培养12h，采用碱裂解法提取质粒，其具体步骤为收集3ml菌液于1. 5ml离心管中，常温12000 rpm离心lmin，加入ΙΟΟμΙ溶液I，振荡至彻底悬浮菌体；加入150 μ 溶液II，立即轻柔颠倒离心管数次，使菌体充分裂解，随后将离心管置于冰上Ι-aiiin ；加入150 μ 溶液III，立即温和颠倒离心管数次，室温放置5min ； 12000 rpm离心12min ；向吸附柱中加入420μ1的结合缓冲液，将上步的上清加入吸附柱中，盖上收集管的盖子，混勻；常温12000 rpm离心15 s ；倒掉收集管中的废液，向吸附柱中加入750μ1的漂洗液，常温12000 rpm离心30 s ；倒掉收集管中的废液，向吸附柱中加入750μ1的漂洗液，常温12000 rpm离心30 s ；倒掉收集管中的废液，常温 12000 rpm离心2 min ；将吸附柱转入新的1. 5 ml离心管中，向吸附柱中央加入50 μ 的洗脱缓冲液，常温静置5min;常温12000 rpm离心1 min后收集到纯化的质粒，使用1%琼脂糖凝胶电泳检测(图6)。通过酶切检测获得的重组质粒pMD18-/yi^7，具体方法为向0. 5 ml的离心管中分别加入质粒 DNA (50ngM) 2μ I, EcoRl (Takara) 0. 5 μ l.JAol 0. 5 μ IUOXbuffer (H) 2 μ 1，使用ddH20补足15 μ 1 ；37°C反应8h ；使用1. 2%琼脂糖凝胶电泳检测(图7)。对菌液进行/>177的测序和在NCBI中进行核苷酸比对。二、构建原核表达载体
测序和比对验证所扩增基因的正确性后，使用万⑶們和损ol对质粒pMDlS-Zym和 pGEX-4t-l、pET32a-xyk进行双酶切分别获得PyMTl基因和pET3h、pGEX_4t_l载体，电泳回收纯化后，分别在16 °C连接16h，获得原核表达载体pGEXIt-l-Zyi/y、ρΕ 32 -ΡχΜΓ10具体操作如下向0. 5 ml的离心管中分别加入质粒DNA (50ngM) 2 μ I, EcoRl (Takara) 0. 5 μ I, Xhol 0. 5 μ IUOXbuffer (H) 2 μ 1，使用 ddH20 补足 15 μ 1 ；37°C 反应他；使用1. 琼脂糖凝胶电泳检测，胶回收/>1/7和pET3h (或pGEX-4t-l)载体，将回收片段进行连接，其具体步骤为向1. 5 ml离心管中分别加入-.PyMTl DNA 3 μ (约300ng)、 pET32a (或 pGEX-4t-l)载体 1 μ (lOOng/μΙ),Ligation Solution I 3μ1，用封口膜封好; 置于金属浴中16°C过夜连接。使用热刺激法将pET3h_PyMTl、pGEX_4t_I-PyMTl转入大肠杆菌BL21中，具体步骤为将感受态大肠杆菌五coli BL21 100 μ 1加入6 μ 1质粒体系中；混合液冰浴20 min, 42 °C热刺激45 s，冰浴2 min;加入900 μ 1 SOC液体培养基，37 °C >200 rpm摇床培养60 min ；然后10000 rpm离心Imin ；在超净台上吸去上清，剩余约100 μ 1时，用枪吸打混勻，转入带有^ρ抗性、IPTG、X-Gal的LB平板上，用无菌三角玻璃棒涂布均勻；37 ！过夜培养； 挑取白斑于加有^^抗性液体LB培养基中37 0CUSO rpm摇床培养12 h;提取质粒，进行电泳检测。通过酶切检测获得重组质粒或pGEXIt-l-Zyi/y)，具体方法为 向 0. 5 ml 的离心管中分别加入质粒 DNA (50ngM) 2μ I, EcoRl (Takara) 0. 5 μ I, Xhol 0.5 μ IUOXbuffer⑷2 μ 1，使用ddH20补足15 μ 1 ；37°C反应8h ；使用1. 2%琼脂糖凝胶电泳检测(图7、8和9)。实施例2 原核表达载体pGEX-4t_ 1-/^177、ρΕ -32 ~ΡχΜΓ1的原核表达
取500 μ 1融合表达工程菌菌液加入50ml LB液体培养基中，37°C、180 rpm摇床培养 2 h;培养结束后，取出1 1111，测定菌液00600值，00600达到0.6-0.8即可，取出2管(21111/ 管)菌液，作为未诱导的样品，在锥形瓶中剩余的菌液加入0. IM的IPTG (终浓度为1 mM和 0. 5mM)进行诱导，37°C、ISOrpm摇床培养2h，取出2管(2ml/管)菌液，为诱导池的样品； 同样在诱导4h、6h、》!时分别取2管样品。取样完成后，诱导0、2、4、6、》!的样品各取一管，用于总蛋白分析。具体步骤为 40C >12000 rpm离心2 min ；弃上清，加入100 μ 1细菌蛋白抽提缓冲液，再加入25 μ 1 5*蛋白上样缓冲液(Loading Buffer)；然后煮沸5 min, -20 °C保存。对样品进行SDS-PAGE电泳检测分析。具体步骤为制备分离胶、浓缩胶，每种样品上样10μ 1，电泳后，取出分离胶，置于固定液中，摇床固定30min ；弃固定液，加入染色液染色30 min ；弃染色液，加入脱色液，脱色60 min ；弃脱色液，加入ddH20，摇床45 rpm过夜； 取出胶体，置于胶板上进行拍照(图10和11)。取诱导0、2、4、6、》!的样品中的另一管，用于蛋白分析。具体步骤为4°C、12000 rpm离心2 min ；弃上清，加入100 μ IddH2O,悬菌，进行超声破碎(工作4s，暂停9s，反复处理，直到菌液变为澄清)。使用Bradford法测定蛋白浓度，具体方法为
使用 Bradford Solution(BIO-RAD)测定蛋白含量，使用标样0. 1 μ g/μ 1 BSA(Takara) 配制反应体系
Protein content (μ g)0246810BSA (μ 1)020406080100ddH20 (μ 1)800778756734712690
每管中加入200 μ 1 Bradford Solution，室温放置^iin ；使用分光光度计测定0D595。
获得标准曲线y=8. 2204X - 7.1953。样品的反应体系为798μ 1 ddH20 + 200 μ 1 Bradford Solution + 2μ 1 蛋白样品；对照为800 μ 1 ddH20 + 200 μ 1 Bradford Solution，测定OD595，代入标准曲线计算样品的蛋白浓度。实施例3 融合表达工程菌pGEX-^-l-Zym BL21与对照菌pGEX_4t_l BL21重金属耐受性实验
实验在37°C，IPTG 0. 25 mM/L的诱导条件下对融合表达工程菌pGEX-4t-l_/yi^7 BL21和对照菌pGEX-4t-l BL21进行了重金属耐受性实验，实验结果显示融合表达工程菌 pGEX-4t-1-/^177 BL21在1. 1 mM/L Si2+处理时，/yi/77融合表达工程菌与转空载体的负对照菌在0-5 h没有差异，而5 h小时后/>#777转化菌生长加速(图12)。 在使用2. 25 mM CuCl2处理后，在0-4 h内,PyMTll转化菌和负对照都生长，在5_9 h内PyMTll转化菌仍缓慢生长，而负对照则出现生长停滞现象(图13)。用0.6 mM CdCl2处理后，出现了与2. 25 mM CuCl2处理相类似的结果(图14)。根据以上结果说明融合表达工程菌pGEX-4t-l-/yi^7 BL21对重金属具有的一定的抗性。从而证明了云南红梨的云红梨1号金属硫蛋白基因 PyMTl (GenBank登录号为FJ393460)，具有典型的金属硫蛋白基因重金属离子耐受性的功能。
权利要求
1.云红梨1号金属硫蛋白基因，其特征在于金属硫蛋白基因具有如SEQID NO. 3所示的核苷酸序列或编码如SEQ ID NO. 4所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所示的基因，其特征在于金属硫蛋白基因来源于云南红梨的云红梨 1号。
3.一种含有权利要求1所述金属硫蛋白基因的原核表达载体。
4.根据权利要求3所述的原核表达载体，其特征在于原核表达载体为和 pGEX-4t-l-/W7。
5.权利要求1的所述的金属硫蛋白基因在微生物耐受重金属中的应用。
全文摘要
本发明公开了云红梨1号金属硫蛋白基因PyMT1及其原核表达载体，该原核表达载体是含有云红梨1号金属硫蛋白基因PyMT1的原核表达载体。本发明从云红梨1号克隆出PyMT1基因，用T7启动子、乳糖操纵子在IPTG诱导下控制该基因在细菌细胞中过量表达，合成PyMT1蛋白并分泌到细胞质中，通过SDS-PAGE检测其表达水平，实验结果表明在37℃、1mMIPTG诱导4h时和37℃、0.5mMIPTG诱导4hPyMT1蛋白表达量达到最大，本发明采用的载体能成功大量表达云红梨1号的金属硫蛋白，并证明了云南红梨的云红梨1号金属硫蛋白基因PyMT1，具有典型的金属硫蛋白基因重金属离子耐受性的功能，为进一步研究PyMT1的功能和金属硫蛋白基因在微生物耐受重金属中的应用奠定基础。
文档编号C12R1/19GK102311959SQ201110275008
公开日2012年1月11日 申请日期2011年9月16日 优先权日2011年9月16日
发明者张晓东, 李昆志, 樊磊, 陈丽梅 申请人:昆明理工大学