专利名称：含有苹果提取物及胶原蛋白三肽的美容饮料的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于改善皮肤的美容饮料。
背景技术：
近年来，作为真皮组织模型，含胶原蛋白的饮料受到注目。本申请人在专利文献1(日本专利第4388289号公报)中提出了含有明胶分解物、 来自大豆的皂苷、大豆异黄酮、神经酰胺、葡萄糖胺和酒精的饮料及含有大豆胚芽提取物的外用剂所形成的防止·改善皮肤老化及/或防止·改善皮肤粗糙的套装产品。专利文献2(日本专利第4506880号)中公开了如下美容饮料，其特征在于，含有选自胶原蛋白肽、酵母提取物、来自植物的儿茶素、单宁及柚子多酚中的1种以上以及用乳酸菌使琼脂分解物发酵而所得到的发酵组合物。专利文献3(日本专利第4505322号公报)中公开了如下果冻饮料，其具有掩蔽了鱼腥味的良好的风味和口感且高浓度含有作为美容健康食品的来自鱼类的胶原蛋白肽。专利文献4(日本专利第4057163号公报)中公开了如下饮料，其特征在于，含有山白竹和胶原蛋白肽。专利文献5 (日本特开2002-27957号公报)中公开了如下液体组合物，其通过在含有来自茶、葡萄或苹果的植物多酚和胶原蛋白的液体中添加果胶，从而抑制由植物多酚和水溶性蛋白质所引起的白浊物质及/或沉淀物质的生成。专利文献6(日本专利第3802721号公报)中，本申请人提出了含有具有 Gly-Pr0-Hyp的氨基酸序列的三肽的生物体胶原蛋白合成促进剂。现有技术文献专利文献专利文献1日本专利第4388289号公报专利文献2日本专利第4506880号专利文献3日本专利第4505322号公报专利文献4日本专利第4057163号公报专利文献5日本特开2002-027957号公报专利文献6日本专利第3802721号公报
发明内容
本发明的目的在于，开发具有胶原蛋白收缩能力、提高了美容性的胶原蛋白饮料。本发明人以苹果提取物具有胶原蛋白收缩能力为知识依据，进一步发现通过与胶原蛋白三肽并用可增强胶原蛋白收缩能力，从而完成了本发明。而且，不断进行研究的结果，认识到了通过苹果提取物和胶原蛋白三肽并用，具有抑制皱纹形成的功能、抑制DNA损伤的功能、保持角质层水分量的功能、抑制表皮肥厚的功能。1. 一种美容饮料，其为使含有胶原蛋白及纤维芽细胞的胶原蛋白凝胶收缩的胶原蛋白凝胶收缩剂，其特征在于，是以苹果提取物及胶原蛋白三肽为有效成分的美容饮料。2.根据1中所述的美容饮料，其特征在于，苹果提取物为来自苹果的多酚，胶原蛋白三肽为含有平均分子量为400以下的胶原蛋白三肽的胶原蛋白三肽。3.根据1或2中所述的美容饮料，其特征在于，其为用于抑制皱纹形成的美容饮料。4.根据3中所述的用于抑制皱纹形成的美容饮料，其特征在于，抑制被紫外线照射所引起的皱纹形成。5.根据1或2中所述的美容饮料，其特征在于，其为用于抑制DNA损伤的美容饮料。6.根据5中所述的用于抑制DNA损伤的美容饮料，其特征在于，抑制被紫外线照射所引起的DNA损伤。7.根据1或2中所述的美容饮料，其特征在于，其为用于保持角质层水分量的美容饮料。8.根据7中所述的用于保持角质层水分量的美容饮料，其特征在于，抑制被紫外线照射所引起的角质层水分量的减少9.根据1或2中所述的美容饮料，其特征在于，其为用于抑制表皮肥厚的美容饮料。10.根据1或2中所述的美容饮料，其特征在于，其为用于提高皮肤弹性的美容饮料。可证明本发明的美容饮料通过并用苹果多酚和胶原蛋白三肽，在低浓度区域内显著提高使胶原蛋白凝胶收缩的功能。且可证明通过并用苹果提取物和胶原蛋白三肽，具有抑制皱纹形成、抑制DNA损伤、保持角质层水分量、抑制表皮肥厚的效果。这些功能特别是对于以被太阳光等中所包含的紫外线照射为起因的损伤具有有效的效果。通过长期持续服用，可确实感到皮肤的光滑度、干燥得到改善，确认皮肤弹性得到改善，还可抑制痤疮的恶化、发病等的症状，确认化妆品涂布性得到改善，总体上适合美容用饮料。
图1表示通过添加苹果多酚而产生的评价样品的胶原蛋白凝胶收缩率的结果。图2表示通过添加胶原蛋白三肽而产生的评价样品胶原蛋白凝胶收缩率的结果。图3表示通过并用苹果多酚和胶原蛋白三肽并用而产生的评价样品胶原蛋白凝胶收缩率的结果。图4表示皱纹体积率。图5表示经皮水分丧失量TEWL。图6表示角质层水分量SC hydration。图7表示表皮厚度。图 8 表示 DNA 损伤(8-0H dG)。图9表示PCNA (细胞增殖标记物)。图10表示皮肤羟基脯氨酸(Hyp)。
图11表示通过服用而产生的感官试验结果。图12 (a)表示测定皮肤粘弹性的结果。图12 (b)表示测定皮肤弹性的结果。
具体实施例方式本发明人首先以苹果提取物具有胶原蛋白凝胶收缩作用为知识依据，进行了涉及以苹果提取物为有效成分的胶原蛋白凝胶收缩剂的专利申请(日本特愿2009-83818号)。 本发明人进一步继续对苹果提取物的胶原蛋白凝胶收缩作用进行研究的结果，发现通过并用胶原蛋白三肽，可飞速增强胶原蛋白凝胶收缩作用。本申请发明涉及可口服摄取的美容饮料。本发明发挥使含有胶原蛋白及纤维芽细胞的胶原蛋白凝胶收缩的胶原蛋白凝胶收缩作用。且是以苹果提取物和胶原蛋白三肽并用的成分为有效成分的、用于抑制皱纹形成的美容饮料、用于抑制DNA损伤的美容饮料、用于保持角质层水分量的美容饮料、用于抑制表皮肥厚的美容饮料。本发明使含有胶原蛋白及纤维芽细胞的胶原蛋白凝胶收缩。胶原蛋白凝胶的收缩是指例如使凝胶的大小变小。作为胶原蛋白凝胶的大小的指标无特别限制，例如可例举胶原蛋白凝胶的直径、表面积、体积等。此外，苹果提取物和胶原蛋白三肽并用的成分在抑制皱纹形成、抑制DNA损伤、保持角质层水分量、抑制表皮肥厚时也为有效成分。特别是作为针对被太阳光等中所包含的紫外线照射而引起的皱纹形成、DNA损伤、角质层水分量减少、表皮肥厚等损伤的抑制作用， 发挥有效作用。通过长期服用，可防止皮肤干燥，增加光滑度，抑制痤疮等的小疙瘩，是改善作为皮肤外用剂的化妆品的涂布性的美容用饮料。〈胶原蛋白凝胶〉本发明中，胶原蛋白凝胶只要是可收缩的形状即可，除了凝胶状以外，例如也可以为固状。胶原蛋白凝胶中所包含的胶原蛋白的种类无特别限制，例如可例举I型、II型、 III型、IV型、V型胶原蛋白等，优选为I型胶原蛋白。另外，胶原蛋白例如也可为将胶原蛋白加工处理后的产物。作为加工处理无特别限制，例如可例举热处理、酶处理等。作为热处理后的胶原蛋白，例如可例举明胶等，作为酶处理后的胶原蛋白，例如可例举去端肽胶原、 胶原蛋白肽等。胶原蛋白凝胶中的所述胶原蛋白浓度无特别限制，例如可根据形状等适当设定。在胶原蛋白凝胶中，纤维芽细胞的来源组织无特别限制，例如可例举皮肤、肺、心脏等，优选为皮肤。纤维芽细胞的来源种无特别限制，例如可例举人、猪、牛、兔、大鼠、小鼠等，优选为人。胶原蛋白凝胶中的纤维芽细胞的细胞密度无特别限制，可适当设定。胶原蛋白凝胶例如也可包含胶原蛋白及纤维芽细胞以外的其他成分。作为其他成分无特别限制，例如可例举培养液、血清等。 <苹果提取物>苹果提取物优选为苹果果实的提取物。特别优选为以苹果幼果提取物中所包含的多酚为主要成分。已知苹果提取物中含有多酚、有机酸、氨基酸等。已知苹果提取物可用于如下物质中，作为可提高改善血管功能的作用的BNP调节剂且含有提取物作为有效成分而形成的BNP调节剂、血流促进剂(日本特开2007-008837 号公报、日本特开2006-265220号公报)、饮料(日本特开2004-305087号公报)、化妆品 (日本特开2001-187724号公报)、消臭剂成分(日本特开平11-319051号公报)、香料成分 (日本特开平08-023939号公报)等。但是，还没有关于苹果提取物及来自苹果的多酚的胶原蛋白凝胶收缩效果的报道。苹果提取物中，苹果(Malus pumlla)的品种例如可例举富士、国光、王林、红玉、乔纳金、蛇果、珊夏、千秋等，无特别限制。苹果的提取部位无特别限制，例如可例举果实、叶、 干、花等，优选为果实。所述果实，例如可为未成熟果实(幼果)，也可为完全成熟果实，无特别限制。提取时所使用的所述果实的部位无特别限制，例如可例举全果、果肉、果皮、种子等。苹果提取物也可将这些部位单独或组合2种以上提取。提取苹果提取物的方法无特别限制，可采用现有公知的方法。作为提取方法的具体例子，例如也可为以下方法。首先，将苹果的全果水洗后，用研磨机等粉碎。也可将该粉碎物进行果胶酶处理，离心分离后，用提取溶剂进行分配过滤来制备苹果提取物。作为所述果胶酶处理无特别限制，例如也可在20 60°C的温度条件下，添加10 50ppm果胶酶来进行。作为提取溶剂无特别限制，例如可例举己烷、氯仿等的有机溶剂。苹果提取物例如可使用市售的苹果提取物，也可从苹果果实中提取制备，无特别限制。胶原蛋白凝胶收缩剂中所包含的苹果提取物含量无特别限制，例如为0. 001 99 重量％，优选为0.001 5重量％。因为通过胶原蛋白和明胶并用，可飞速提高胶原蛋白凝胶收缩能力，所以在0.01以下即很充分。胶原蛋白凝胶收缩剂优选含有来自苹果的多酚的苹果提取物。多酚的分离方法无特别限制，可采用现有公知的方法。多酚例如也可如下分离， 将苹果提取物流入色谱柱后，洗脱色谱柱的吸附物，将该洗脱组分减压蒸馏、浓缩来进行分离。此外，还可以在该浓缩液中添加粉末助剂，进行冷冻干燥或喷雾干燥来制备多酚粉末。多酚例如可使用市售的来自苹果的多酚含有物，也可以从苹果果实中提取及分离而制备，无特别限制。本发明的胶原蛋白凝胶收缩剂中所包含的所述多酚含量无特别限制， 例如为0. 01 99重量％，优选为0. 1 50重量％。〈胶原蛋白三肽〉并用苹果提取物的胶原蛋白三肽为含有平均分子量为400以下的胶原蛋白三肽的三肽，与通常称为普通胶原蛋白的胶原蛋白有所区别。进一步详细地说，优选氨基酸序列为Gly-X-Y(X，Y为氨基酸)的肽(P印tide)，特别优选氨基酸序列为Gly-Pro-Hyp的肽。本发明的胶原蛋白三肽使用来自猪等动物的胶原蛋白三肽、来自鱼的胶原蛋白三肽均可。
本发明的胶原蛋白三肽主要可水解胶原蛋白来制造。胶原蛋白水解物已有市售， 这些酶性水解的胶原蛋白的多数的分子量分布范围为二千 八万。这些水解物以提高在水中的分散性为 目的。相对于此，本发明的胶原蛋白水解物的特征在于，作为特定的有效成分含有分子量为400以下的肽(ρ印tide)。添加量优选为0. 01%以上。因本试验体系的试验中，胶原蛋白凝胶的收缩上限设想为80%左右，所以，胶原蛋白凝胶的收缩为70%左右以上时，即使增加添加浓度，增加效果也较小。因此，从不会减小的意义上来说虽没有上限，但实质上来说1.0%左右即为上限。[试验例1]<有关苹果提取物的胶原蛋白凝胶收缩作用试验>该试验中，作为胶原蛋白凝胶收缩剂，使用苹果提取物(商品名Appl印henonSH ； ASAHI FOOD & HEALTHCARE CO.，LTD.制)，如下测定胶原蛋白凝胶收缩作用。[材料](1)去端肽胶原(商品名=AteloCel 1、去端肽胶原(来自牛真皮)5mg/ml(2)DMEM(粉末)(商品名达尔伯克改良伊格尔培养基(2)、日水)(3) DMEM(液体)(商品名；Gibco)[评价样品](1)苹果提取物(苹果多酚)商品名=ApplephenonSH(ASAHI FOOD & HEALTHCARE CO.，LTD.制)规格；总多酚量98%以上(UV法)[试验方法]将预先继代培养的皮肤纤维芽细胞(来自新生儿)制备成细胞悬浮液 (6X105cells/ml含有溶剂10% FBS的DMEM)。在冰冷中混合去端肽胶原(5mg/ml)4ml、3 倍浓度 DMEM (含有 D-Glcl. 2M 及含有 Apple phenonSHO. 03% )2ml、FBS(牛血清)0. 67ml、 含有10% FBS的DMEM 3. 34ml及细胞悬浮液2ml，在平底12孔板中各添加lml。在37°C、 5% CO2培养箱中培养，5小时后通过去端肽胶原再纤维化，证明已形成了凝胶。从添加开始6小时后，使用灭菌刮刀的柄将凝胶从孔板上剥离后，添加含有10% FBS 的 DMEM 溶液 Iml (含 0. 5%、0. 2%、0. HACP-01)，再次在 37°C>5% CO2 培养箱中培养7天。培养液为隔1天用将评价药剂以任意浓度溶解的含有10 % FBS的DMEM溶液Iml 替换培养基。培养结束后，将培养液完全除去，用PBS洗涤后，用10%中性福尔马林溶液 (Wako)浸润24小时以固定凝胶。其后，置换为1 % (w/v) Triton-X溶液，进行凝胶直径的计算测量。进行在凝胶形成后添加苹果提取物(苹果多酚)时和凝胶包埋时添加苹果提取物 (苹果多酚)时的试验。添加量如表1中记载。表1中记载的添加浓度Al、A2、A3、A4的添加浓度表示在凝胶形成后添加的在含有10% FBS的DMEM溶液Iml中添加苹果提取物的数值。此外，表1中记载的添加浓度Bi、B2、B3表示凝胶包埋时添加了苹果提取物的凝胶容量Iml中的添加浓度。即组成凝胶Iml的各试样的容量由(1)去端肽胶原333. 3 μ 1、 (2)含有1.2Μ D-葡萄糖的3倍浓度的DMEM 166. 7 μ 1, (3) FBS (牛血清)55. 8 μ 1、(4)含有10% FBS的DMEM 277. 5 μ 1、(5)细胞悬浮液166. 7 μ 1构成，评价样品的苹果提取物的添加浓度如下，在(2)3倍浓度DMEM的溶剂中，含有以0. 3%浓度制备的苹果提取物的含有 1. 2M D-葡萄糖的3倍浓度DMEM溶液在凝胶中的添加浓度为0. 3% X (166. 7 μ 1/凝胶容量Iml) =0.05%的Bl所示的添加浓度。同样，Β2及Β3的添加浓度如下，通过分别制备分别含有0. 1 %及0. 03%的苹果提取物的含有1. 2Μ D-葡萄糖的3倍浓度DMEM溶液，在凝胶包埋时添加，分别得到Β2 — 0. 0167%, Β3 — 0. 005%的添加浓度，求出胶原蛋白凝胶收缩率。[凝胶直径的计算测量及凝胶面积的计算] 利用凝胶的形状与孔板同样为正圆形来计算凝胶面积。将根据上述处理方法制备的凝胶从2个方向计算测量直径，计算出2直线的平均值。可由其凝胶直径的平均值计算出凝胶半径，凝胶面积可用下式计算。凝胶面积=(凝胶半径cm) X (凝胶半径cm) X圆周率由进行药剂处理时的胶原蛋白凝胶的凝胶面积与未进行药剂处理的胶原蛋白凝胶的凝胶面积的面积比计算出胶原蛋白凝胶收缩率(% )。胶原蛋白凝胶收缩率(％ ) = 100X {(未进行药剂处理的凝胶面积)_(进行药剂处理时的凝胶面积)} / (未进行药剂处理的凝胶面积)对于一个数据用η = 3孔板评价，用平均士标准偏差(mean士S. D.)标记于图表中。[试验结果]表1及图1中表示单独添加苹果提取物的试验例的胶原蛋白凝胶收缩率(％ )的结果。证实在凝胶形成后添加苹果提取物时和在凝胶包埋时添加时的任一种情况下，胶原蛋白凝胶收缩能力均依赖于浓度。且显示在添加0.005% (w/v)时的凝胶收缩能力分别为15. 2士6. 9%U6. 3士6. 5%的非常接近的值。表1苹果提取物(苹果多酚)
在凝胶形成后添加在凝胶包埋时添加 Al A2 A3 A4 Bl B 2 B 3%(wA0S 0.060 0.018 0.006 0.005 0.050 0.017 0.005
^疑)目交 82.1 47.1 24.1 15.2 49.5 29.2 16.3 s. D.1.1 4.7 9.7 6.9 7.4 12.6 6.5〔试验例2〕<有关胶原蛋白三肽的胶原蛋白凝胶收缩作用试验>在该试验中，作为胶原蛋白凝胶收缩剂使用胶原蛋白三肽，如下测定胶原蛋白凝胶收缩作用。[材料]
(1)去端肽胶原(商品名=AteloCel 1、去端肽胶原(来自牛真皮)5mg/ml(2)DMEM(粉末)(商品名达尔伯克改良伊格尔培养基(2)、日水)(3) DMEM(液体 )(商品名；Gibco)[评价样品](2)胶原蛋白三肽商品名HACP-01 (JELLICE株式会社制)规格；含有三肽(G-X_Y;X、Y为任意的氨基酸)15%以上[试验方法]将预先继代培养的皮肤纤维芽细胞(来自新生儿)制备为细胞悬浮液 (6X105cells/ml含有溶剂10% FBS的DMEM)。在冰冷中混合去端肽胶原(5mg/ml)4ml、3 倍浓度 DMEM (含有 D-Glcl. 2M 及含有 Apple phenonSHO. 03% )2ml、FBS(牛血清)0. 67ml、 含有10% FBS的DMEM 3. 33ml及细胞悬浮液2ml，在平底12孔板中各添加lml。在37°C、 5% CO2培养箱中培养，5小时后通过去端肽胶原再纤维化，证明形成了凝胶。从添加开始6小时后，使用灭菌刮刀的柄将凝胶从孔板上剥离后，添加含有10% FBS 的 DMEM 溶液 Iml (含 0. 5%、0. 2%、0. HACP-01)，再次在 37°C>5% CO2 培养箱中培养7天。培养液为隔1天用将评价药剂以任意浓度溶解的含有10 % FBS的DMEM溶液Iml 替换培养基。培养结束后，将培养液完全除去，用PBS洗涤后，用10%中性福尔马林溶液 (Wako)浸润24小时以固定凝胶。其后，置换为(WZV)Triton-X溶液，进行凝胶直径的计算测量。进行在凝胶形成后添加胶原蛋白三肽时和凝胶包埋时添加胶原蛋白三肽时的试验。添加量如表2中记载。表2中记载的添加浓度A1、A2、A3的添加浓度表示在凝胶形成后添加的含有10% FBS的DMEM溶液Iml中添加胶原蛋白三肽的数值。此外，表2中记载的添加浓度B1、B2、B3表示凝胶包埋时添加了胶原蛋白三肽的凝胶容量Iml中的添加浓度。即组成凝胶Iml的各试样的容量由⑴去端肽胶原333. 3 μ 1、(2)含有 1. 2Μ D-葡萄糖的 3 倍浓度 DMEM 166. 7 μ 1,(3) FBS (牛血清)55. 8 μ 1、(4)含有 10% FBS 的 DMEM 277. 5 μ 1、(5)细胞悬浮液166. 7 μ 1构成，评价样品的胶原蛋白三肽的添加浓度如下， 在(2)3倍浓度DMEM的溶剂中，含有以6. 0%浓度制备的胶原蛋白三肽的含有1. 2Μ D-葡萄糖的3倍浓度DMEM溶液在凝胶中的添加浓度为0. 3% X (166. 7 μ 1/凝胶容量lml) = 1. 0%的 Bl所示的添加浓度。同样，B2及B3的添加浓度如下，通过分别制备分别含有3. 0%及0. 6% 的胶原蛋白三肽的含有1. 2M D-葡萄糖的3倍浓度DMEM溶液，在凝胶包埋时添加，分别得到 B2 — 0. 0167%,B3 — 0. 005%的添加浓度，求出胶原蛋白凝胶收缩率。[凝胶直径的计算测量及凝胶面积的计算]利用凝胶的形状与孔板同样为正圆形从而计算出凝胶面积。参照图4所示的表示胶原蛋白凝胶收缩剂的胶原蛋白凝胶收缩状态的图。将根据上述处理方法制备的凝胶从2个方向上计算测量直径，计算出2直线的平均值。可由其凝胶直径的平均值计算出凝胶半径，凝胶面积可用下式计算。凝胶面积=(凝胶半径cm) X (凝胶半径cm) X圆周率
由进行药剂处理时胶原蛋白凝胶的凝胶面积与未进行药剂处理的胶原蛋白凝胶的凝胶面积的面积比计算出胶原蛋白凝胶收缩率(％ )。胶原蛋白凝胶收缩率(％ ) = 100X {(未进行药剂处理的凝胶面积)_(进行药剂处理时的凝胶面积)} / (未进行药剂处理的凝胶面积)对于一个数据用η = 3孔板评价，用平均士标准偏差(mean士S. D.)标记于图表中。[试验结果]表2及图2中表示单独添加胶原蛋白三肽的试验例中的胶原蛋白凝胶收缩率 (%)的结果。证实在凝胶形成后添加胶原蛋白三肽时和在凝胶包埋时添加胶原蛋白三肽时的任一种情况下，胶原蛋白凝胶收缩能力均依赖于浓度。且显示在添加0. 1% (w/v)时的凝胶收缩能力分别为20. 1 士 1. 0%、24. 2士 15. 5%的非常接近的值。表权利要求
1.一种美容饮料，其为使含有胶原蛋白及纤维芽细胞的胶原蛋白凝胶收缩的胶原蛋白凝胶收缩剂，其特征在于，是以苹果提取物及胶原蛋白三肽为有效成分的美容饮料。
2.根据权利要求1中所述的美容饮料，其特征在于，苹果提取物为来自苹果的多酚，胶原蛋白三肽为含有平均分子量为400以下的胶原蛋白三肽的胶原蛋白三肽。
3.根据权利要求1或2中所述的美容饮料，其特征在于，其为用于抑制皱纹形成的美容饮料。
4.根据权利要求3中所述的用于抑制皱纹形成的美容饮料，其特征在于，抑制被紫外线照射所引起的皱纹形成。
5.根据权利要求1或2中所述的美容饮料，其特征在于，其为用于抑制DNA损伤的美容饮料。
6.根据权利要求5中所述的用于抑制DNA损伤的美容饮料，其特征在于，抑制被紫外线照射所引起的DNA损伤。
7.根据权利要求1或2中所述的美容饮料，其特征在于，其为用于保持角质层水分量的美容饮料。
8.根据权利要求7中所述的用于保持角质层水分量的美容饮料，其特征在于，抑制被紫外线照射所引起的角质层水分量的减少。
9.根据权利要求1或2中所述的美容饮料，其特征在于，其为用于抑制表皮肥厚的美容饮料。
10.根据权利要求1或2中所述的美容饮料，其特征在于，其为用于提高皮肤弹性的美容。
全文摘要
本发明提供美容饮料。其为使含有胶原蛋白及纤维芽细胞的胶原蛋白凝胶收缩的胶原蛋白凝胶收缩剂，是以苹果提取物及胶原蛋白三肽为有效成分的美容饮料。
文档编号A23L2/52GK102415597SQ20111027497
公开日2012年4月18日 申请日期2011年9月16日 优先权日2010年9月16日
发明者川越大, 朝日直子, 落合优, 金辰也, 鱼津伸夫 申请人:株式会社芳珂