粘蛋白和胶原蛋白的分级提取方法
【专利摘要】本发明的课题是提供从一种原料即水母中分别分级提取粘蛋白和胶原蛋白的分级提取方法，该粘蛋白和胶原蛋白的分级提取方法的特征在于，具有蛋白质分离工序(A)和分级工序(B)，所述蛋白质分离工序(A)：通过将下述混合物进行固液分离而得到固体成分，该混合物是将粉碎水母而成的含水粉碎物进行固液分离而得的液体成分与碳原子数为1～4的水溶性醇以碳原子数为1～4的水溶性醇的浓度相对于整体至少成为50容量％的方式混合而得到的，所述分级工序(B)：通过将上述蛋白质分离工序(A)中得到的固体成分与醇浓度为10～40质量％的碳原子数为1～4的水溶性醇水溶液混合，接着进行固液分离，从而固液分级成含粘蛋白的液体成分和含胶原蛋白的固体成分。
【专利说明】粘蛋白和胶原蛋白的分级提取方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及粘蛋白和胶原蛋白的分级提取方法，更详细而言，涉及能够从一种原 料即水母中分别有效地分级提取粘蛋白和胶原蛋白的粘蛋白和胶原蛋白的分级提取方法。
【背景技术】
[0002] 以往，专利文献1中公开了"一种水生物的有用物质的提取方法，其特征在于，具 备将水生物粉碎?切碎成碎片并使酶从上述水生物中游离的第1工序，使上述酶作用于 该碎片中的蛋白质而将上述碎片分解成液体物质的第2工序，以及从上述液体物质中提 取有用物质的第3工序。"。该专利文献1中记载的水生物包括水母（参照专利文献1的 [0027]?[0038]段）。另外，例示了该专利文献1中提取的有用物质为"碱性蛋白酶、胶原 蛋白等"（参照专利文献1的[0020]段），但作为有用物质没有例示"粘蛋白"。
[0003] 专利文献2中，公开了一种粘蛋白型糖蛋白，其特征在于，具有包含3?2000次由 特定的8个氨基酸序列构成的重复单元的重复结构，在该结构中的1个以上的氨基酸残基 上键合有由1个以上的单糖构成的糖链（参照专利文献2的权利要求1)。根据该专利文 献2,该粘蛋白型糖蛋白可以利用如下的方法制造，所述方法包括将水母的固体部分切断的 工序、用盐溶液提取所切断的水母的工序、通过离心分离和透析从提取物中分离粗粘蛋白 的工序、以及将粘蛋白型糖蛋白进行精制的工序。粘蛋白型糖蛋白的具体制造方法可以通 过如下方式得到，即，用水使切断水母而得的碎片溶胀，对溶胀的碎片用浓度低的食盐水溶 液进行振荡提取，向得到的提取液投入3倍量的乙醇而得到凝胶状的沉淀物，将含有沉淀 物的物质进行离心分离而分离出沉淀物，分离将沉淀物溶解于水而生成的上清液，将该上 清液通过透析处理进行精制，再冷冻干燥（参照专利文献2的[0088]段）。该专利文献2 中，公开了得到粘蛋白型糖蛋白的方法，但完全未发现公开胶原蛋白及其制造方法。
[0004] 专利文献3中，公开了"一种从水母类中回收胶原蛋白的方法，其特征在于，具有 将水母类冷冻的冷冻工序，为了将水母类自身具有的内源性酶活化而引发水母类的分解反 应，将上述冷冻的水母类解冻的解冻工序，为了使水母类具有的胶原蛋白以未变性的状态 溶化而生成含有上述未变性的胶原蛋白的中性盐溶液，将上述解冻的水母类搅拌的搅拌工 序，从上述中性盐溶液中回收上述未变性的胶原蛋白的回收工序。"（参照专利文献3的权 利要求）。但专利文献3中没有关于粘蛋白的分离回收的记载。
[0005] 专利文献4中，公开了"一种从水母类中回收胶原蛋白的方法，其特征在于，为了 使水母类自身具有的内源性酶活化而引发水母类的分解反应，并使水母类具有的胶原蛋白 以未变性的状态溶化而生成含有上述未变性的胶原蛋白的中性盐溶液，具有将水母类在规 定的低温下储藏的低温储藏工序和从上述中性盐溶液中回收上述未变性的胶原蛋白的回 收工序"（参照专利文献4的权利要求1)。专利文献4中公开的胶原蛋白回收方法基于"水 母在低温储藏时溶化胶原蛋白的酶发挥作用"这一发现（参照专利文献4的[0019]段）。 公开了低温储藏时的低温"优选为-2°C?25°C的温度范围"（参照专利文献4的[0021] 段）。
[0006] 现有技术文献
[0007] 专利文献
[0008] 专利文献1:日本特开2001 - 178492号公报
[0009] 专利文献2:国际公开公报W02007/020889号公报
[0010] 专利文献3:日本特开2007 - 051191号公报
[0011] 专利文献4:日本特开2008 - 31106号公报
【发明内容】
[0012] 本发明要解决的课题在于提供从一种原料即水母中分级提取粘蛋白和胶原蛋白 的分级提取方法。
[0013] 用于解决上述课题的方式如下：
[0014] (1) 一种粘蛋白和胶原蛋白的分级提取方法，其特征在于，具有蛋白质分离工序 (A)和分级工序（B)，
[0015] 上述蛋白质分离工序（A):将下述混合物进行固液分离而得到固体成分，上述混 合物是将粉碎水母而成的含水粉碎物进行固液分离而得的液体成分与碳原子数为1?4的 水溶性醇以碳原子数为1?4的水溶性醇的浓度相对于整体至少成为50容量％的方式混 合而得到的，
[0016] 上述分级工序（B):通过将上述蛋白质分离工序（A)中得到的固体成分与醇浓度 为10?40质量％的碳原子数为1?4的水溶性醇水溶液混合，接着进行固液分离，从而固 液分级成含粘蛋白的液体成分和含胶原蛋白的固体成分，
[0017] (2)根据上述（1)所述的粘蛋白和胶原蛋白的分级提取方法，其特征在于，将用碳 原子数为1?4的水溶性醇和/或水清洗上述蛋白质分离工序（A)中的通过固液分离而得 的固体成分而成的清洗固体成分作为上述蛋白质分离工序（A)中得到的固体成分，供于上 述分级工序（B)，
[0018] (3)根据上述（2)所述的粘蛋白和胶原蛋白的分级提取方法，上述碳原子数为1? 4的水溶性醇和/或水以相对于上述蛋白质分离工序（A)中的通过固液分离而得的固体成 分的质量为1?4倍质量的比例与上述固体成分混合。
[0019] 根据本发明，能够提供能够从水母中分别分级提取粘蛋白和胶原蛋白的方法。根 据本发明，能够提供能够以比以往更多的粘蛋白提取量从水母中分离出粘蛋白的分级提取 粘蛋白和胶原蛋白的方法。
【专利附图】
【附图说明】
[0020] 图1是表示本发明的分级提取方法的一个例子的工序流程图。
【具体实施方式】
[0021] 本发明中的"水母"是属于刺胞动物门的水母。作为这样的水母，可举出海月水母、 红色水母、水螅水母、越前水母、灯水母、海蜇、波布水母等。优选的水母是确认了对人体安 全的水母，是已经供于食用的海月水母、海蜇、越前水母等。
[0022] 提供给本发明的方法中的水母的形态没有特别限制，例如可以使用生的水母、冷 冻水母、干燥水母、盐渍水母等。
[0023] 用本发明的方法分离出的粘蛋白具有重复单元结构，该重复单元结构包含3次以 上的由下述式（I)(序列编号1)表示的氨基酸序列构成的重复单元。
[0024] Val - Xaa - Glu - Thr - Thr - Ala - Pro (I)
[0025] (式⑴中，Xaa 为 Val 或者 lie。）
[0026] 粘蛋白是分子量不定的高分子化合物。对于上述单元的重复次数，即使是利用以 属于同种的水母为原料的本发明的方法得到的粘蛋白，也根据各个分子而不同。凝胶过滤 分析的结果是利用作为本发明方法的一个例子的具体方法得到的粘蛋白的分子量使用氨 基酸序列解析中得到的数平均修正凝胶过滤的解析时为10?1400kDa，因此若与后述的糖 链的结构一起研究，则预测利用本发明的方法得到的分子量（重复次数为3?700次左右） 的3倍左右的大小的高分子也存在于自然界，由于不认为该粘蛋白的物性、功能大幅变化， 所以本发明中的粘蛋白的重复次数为约3?2000次左右，优选为3?700次。在此，假设 在全部苏氨酸（Thr)残基上键合糖链，且糖链部分为最典型的一 GalNac - Gal,则例如分子 量为约4. 5kDa时,上述单元的重复次数为约3次,分子量为约750kDa时,上述单元的重复 次数为约40次。应予说明，本说明书中由分子量计算重复次数时，只要没有特殊说明就采 用相同的假定。
[0027] 上述重复单元可以直接键合，另外，也可以介由连接键键合。上述连接键没有特别 限制，作为上述连接键的具体例，可举出利用了半胱氨酸的S - S键。
[0028] 利用本发明的方法得到的粘蛋白除包含上述重复结构之外，还可以包含对其作为 粘蛋白的功能（例如，粘性、抗菌性、保湿性等）没有影响的程度的其它氨基酸。并且，重复 结构中的重复单元有时发生转变。即，来自红色水母的粘蛋白的重复单元为VEXXAAPV，这是 由式（I)表示的重复单元仅1个氨基酸发生转变而成的。因此，利用本发明的方法分离出 的粘蛋白还包含因缺失存在于重复结构N末端的1个或者数个氨基酸而其结果是重复单元 发生转变的粘蛋白，这样重复单元发生转变的粘蛋白中优选的粘蛋白是缺失存在于重复结 构N末端的Val的粘蛋白。
[0029] 另外，本发明中的粘蛋白有时是在上述重复结构的1个以上、尤其是1?5个的氨 基酸残基上键合由1个以上、尤其是1?5个的单糖构成的糖链。糖链键合的氨基酸残基 的种类没有特别限定，但优选在苏氨酸残基（Thr)上键合糖链。例如，对于利用本发明的方 法分离出的粘蛋白而言，有时糖链键合的氨基酸残基整体的98%?100%为苏氨酸（Thr)。 另外，如上所述，由于粘蛋白型糖蛋白的性质是分子量不定的高分子化合物，所以糖链键合 的氨基酸残基的数目根据各个分子而不同。然而，预测在上述重复结构中的2个苏氨酸残 基几乎全部键合了糖链。因此，利用本发明的方法分离出的粘蛋白中的键合糖链的数目根 据上述单元的重复次数而不同。
[0030] 构成糖链的单糖是在一般的粘蛋白中发现的单糖，例如，可例示N-乙酰半乳糖 胺、半乳糖、N-乙酰葡萄糖胺、唾液酸、阿拉伯糖、岩藻糖等，大多数情况下是由N-乙酰半乳 糖胺和/或半乳糖构成的糖链，具体而言，在上述重复单元中的苏氨酸残基（Thr)上键合 N-乙酰半乳糖胺和半乳糖而形成Thr-GalNAc-Gal的结构，或者，仅键合N-乙酰半乳糖胺而 形成Thr-GalNAc的结构。例如,这样的粘蛋白可以由下述式（II)表示。
[0031]
【权利要求】
1. 一种粘蛋白和胶原蛋白的分级提取方法，其特征在于，具有蛋白质分离工序（A)和 分级工序（B)， 所述蛋白质分离工序（A):将下述混合物进行固液分离而得到固体成分，所述混合物 是将粉碎水母而成的含水粉碎物进行固液分离而得的液体成分与碳原子数为1?4的水溶 性醇以碳原子数为1?4的水溶性醇的浓度相对于整体至少成为50容量％的方式混合而 得到的， 所述分级工序（B):通过将所述蛋白质分离工序（A)中得到的固体成分与醇浓度为 10?40质量％的碳原子数为1?4的水溶性醇水溶液混合，接着进行固液分离，从而固液 分级成含粘蛋白的液体成分和含胶原蛋白的固体成分。
2. 根据权利要求1所述的粘蛋白和胶原蛋白的分级提取方法，其特征在于，将用碳原 子数为1?4的水溶性醇和/或水清洗所述蛋白质分离工序（A)中的通过固液分离而得的 固体成分而成的清洗固体成分作为所述蛋白质分离工序（A)中得到的固体成分，供于所述 分级工序（B)。
3. 根据权利要求2所述的粘蛋白和胶原蛋白的分级提取方法，其中，所述碳原子数为 1?4的水溶性醇和/或水以相对于所述蛋白质分离工序（A)中的通过固液分离而得的固 体成分的质量为1?4倍质量的比例与所述固体成分混合。
【文档编号】C07K1/14GK104379593SQ201380031849
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2013年8月15日 优先权日:2012年8月23日
【发明者】马场崇行 申请人:株式会社海月研究所, 丸和油脂株式会社