龟鳖胶原蛋白及其提取方法
【专利摘要】本发明公开了一种龟鳖胶原蛋白，其是采用龟壳和/或鳖壳为原料经过浸泡、脂肪酶酶解、蛋白酶酶解及分离纯化后得到的胶原蛋白产物。该龟鳖胶原蛋白的提取方法包括：先以经过预处理后的龟、鳖壳为原料，经清洗、粉碎后加入酸性浸泡盐液中进行恒温浸泡；然后置入脂肪酶酶解液中进行酶解处理，将酶解后的原料置入蛋白酶酶解液中进行酶解处理，最后将酶解后的胶液进行高速离心分离，分离后的上层胶原清液经真空浓缩、真空干燥后得到胶原蛋白。本发明的产品纯度较高、杂质少、原料来源广泛、且营养丰富，本发明的提取方法对原料利用充分，工艺成本低，产品产率高、质量好。
【专利说明】龟鳖胶原蛋白及其提取方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种从动物材料中提取出的胶原蛋白及其提取方法，尤其涉及一种从动物的背壳等材料中提取出的胶原蛋白及其提取方法。
【背景技术】
[0002]从我国的中医药历史来看，对龟鳖有“千年王霸万年龟”之称。《本草纲目》、《中国中医药药典》等历史著作中论其功能有治疗疾病和养生益寿的双重功效，具体的，龟鳖之壳可以显著提高机体的免疫能力，对细胞的生长增殖有显著促进作用和抗衰老作用；而且，龟鳖之壳还具有滋阴补肾、养血补心、增强性机能、软坚散结、破癥瘕痃疟、抑制结缔组织增生的作用。
[0003]现代医学研究指出龟鳖之壳富含胶原蛋白、多种氨基酸、不饱和脂肪酸(DHA和EPA)及微量元素，胶原蛋白则以骨胶原、角蛋白为富含的特点，其次还含有甾体类化合物。高级不饱和脂肪酸以DHA (廿二碳六烯酸为主)，它亦是人类生活中具有重要作用的生物活性物质，能改善大脑机能、活化大脑神经细胞，降低血液中胆固醇浓度，防止血栓形成及动脉硬化等症，能很好地改善老年人的痴呆病。此外，龟鳖含有较多的氨基酸、多肽和多糖，它们对人体的生命活性同样具有很重要的功能。国际生命科学会成立年会还指出:激活机体免疫功能的物质，调节人体代谢生理平衡的物质，影响生物钟节律的物质，抑制人体过早衰老及老年病自由基的物质，亲和活化细胞诱导细胞产生干扰素的物质，这些都是生命活动的生物活性物质，而龟鳖之壳经生化处理的产物会不同程度地包含上述物质的作用和功能。可见，如何高效、低成本地从龟鳖之壳中提取出人体所需的各种营养物质，成为本领域技术人员面临的一个技术难题。
[0004]长久以来，我们从各种动物皮(例如猪皮、牛皮等)和制革的废料中提取明胶，再从明胶中分离出胶原蛋白。随着科技的不断发展，人们也开始从大量的鱼鳞废料和鱼皮中提取胶原蛋白。近年来，又发展`出从豆类、薯类及其它高等植物中提取胶原蛋白。然而，如何从海洋生物龟鳖类的废壳中提取胶原蛋白和其他重要成份，这在本领域技术人员中很少涉及和关注。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种纯度较高、杂质少、原料来源广泛、且营养丰富的龟鳖胶原蛋白，还相应提供一种原料利用充分、工艺成本低、产品产率高、质量好的龟鳖胶原蛋白的提取方法。
[0006]为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为一种龟鳖胶原蛋白，所述龟鳖胶原蛋白是采用龟壳和/或鳖壳为原料经过浸泡、脂肪酶酶解、蛋白酶酶解及分离纯化后得到的胶原蛋白产物。
[0007]作为一个总的技术构思，本发明还提供一种上述的龟鳖胶原蛋白的提取方法，包括以下步骤:(1)浸泡:以经过预处理后的龟壳和/或鳖壳为原料，经清洗、粉碎后加入酸性浸泡盐液中进行恒温浸泡；浸泡后的原料漂洗至中性后，可优选加入到含TQ纤维素酶2%~6%的处理液中进行预处理，预处理时可调pH至6.5~7.5，在30°C~50°C温度下进行酶解预处理，冷却后再进入下一步；
(2)脂肪酶酶解:将经步骤(1)浸泡后的原料清洗，然后置入脂肪酶酶解液中进行酶解处理，再灭酶漂洗至中性；
(3)蛋白酶酶解:将经步骤(2)酶解后的原料置入蛋白酶酶解液中进行酶解处理，再灭酶活处理；
(4)分离纯化:将经步骤(3)酶解后的胶液以4000r/min~8000r/min转速进行高速离心分离，分离后的上层胶原清液经真空浓缩、真空干燥后得到胶原蛋白。
[0008]上述的提取方法，所述步骤(1)中优选的，所述酸性浸泡盐液中含有NaCl和乙酸，所述酸性浸泡盐液中NaCl的质量分数为2%~4%，所述酸性浸泡盐液中乙酸的质量浓度为
.0.5%~1.5%。酸性浸泡盐液的用量优选为所述原料质量的2倍~4倍。
[0009]上述的提取方法，所述步骤(1)中优选的，恒温浸泡的温度为30°C~40°C，恒温浸泡时间不少于12h。
[0010]上述的提取方法，所述步骤(2)中优选的，所述脂肪酶酶解液主要由脂肪酶(TZF)和水配制而成，所述脂肪酶的用量为初始原料质量(即指浸泡前的原料质量，下同)的
.0.2%~0.6%，所述水的用量为初始原料质量的2倍~4倍。
[0011]上述的提取方法，所述步骤(2)中优选的，酶解处理的温度为30°C~50°C，酶解处理的pH值为6.5~8.0，酶解处理的时间为8h~12h。
[0012]上述的提取方法，所述步骤(3)中优选的，所述蛋白酶酶解液主要由碱性蛋白酶(TJD )、酸性蛋白酶(TSD )、胃蛋白酶和水配制而成，所述碱性蛋白酶的用量为初始原料质量的0.08%~1.0%，所述酸性蛋白酶的用量为初始原料质量的0.4%~1.0%，所述胃蛋白酶的用量为初始原料质量的0.02%~0.08%，所述水的用量为初始原料质量的2倍~4倍。
[0013]上述的提取方法，所述步骤(3)中优选的，酶解处理的温度为40°C~60°C，酶解处理的pH值为6.0~7.5，酶解处理的时间为8h~10h。
[0014]上述的提取方法，所述步骤(1)中的预处理优选包括以下步骤:取龟壳和/或鳖壳经清洗、干燥后粉碎成原料小块，将原料小块加入至预处理液中进行浸泡预处理(加入预处理液浸泡前可先置于醋酸溶液中浸泡)，所述预处理液中含有NaCl和Na2CO3,所述预处理液中NaCl的质量分数为2%~4%，所述预处理液中Na2CO3的质量分数为10%~20% ;浸泡预处理的温度控制在30°C~50°C，浸泡预处理的时间不少于12h，浸泡预处理后的原料小块经过滤、漂洗、干燥后得到步骤(1)中的原料。通过采用以上的预处理，主要是使龟鳖壳的骨质软化，有利于骨胶原、角蛋白等被下一步的蛋白酶酶解，同时除去杂蛋白提高酶解率?’另外还可防止少数胶原蛋白纤维化。
[0015]与现有技术相比，本发明的优点在于:
本发明提供了一种龟鳖胶原蛋白产品，该产品主要是从龟壳和/或鳖壳中，不仅原料来源广泛，而且提取步骤简便易行，提取后所得的胶原蛋白产品不仅纯度较高，杂质少，而且营养丰富。另外，本发明的提取方法不仅操作简单，而且设备投入小，通过增加预处理、浸泡等操作使得后续工艺的酶解效率大大提高；整个提取工艺不仅原料利用充分，工艺成本低，且产品产率高，为胶原蛋白的工业化生产应用提供了前提和基础。
【具体实施方式】
[0016]以下结合说明书具体实施例对本发明的优选实施方案作进一步的描述。
[0017]一种本发明的龟鳖胶原蛋白，该龟鳖胶原蛋白是采用龟壳和/或鳖壳为原料经过浸泡、脂肪酶酶解、蛋白酶酶解及分离纯化后得到的胶原蛋白产物。
[0018]上述本发明的龟鳖胶原蛋白的提取方法，具体包括以下步骤。
[0019]1.原料预处理:
以无霉变且经晒干(或烘干)后的整体龟壳和/或鳖壳为原材料，取IOOkg用水清洗干净，烘干或晒干后粉碎成Icm~2cm的原料小块，将原料小块加入至200kg的预处理液中于控温罐内进行浸泡预处理，预处理液中含有NaCl和Na2CO3,预处理液中NaCl的质量分数为2%~4%，预处理液中Na2CO3的质量分数为10%~20% ;浸泡预处理的温度控制在30°C~50°C，恒温下浸泡预处理的时间不少于12h，浸泡预处理后的原料小块经过滤、漂洗，再进行烘干或晒干后完成对原料的预处理过程。
[0020]2.浸泡 :
以经过上述预处理后的龟壳和/或鳖壳为初始原料，经清水漂洗后烘干，再研磨粉碎成粗粉粒并盛入保温罐内，向保温罐中加入2倍于初始原料质量的酸性浸泡盐液进行恒温浸泡；酸性浸泡盐液中含有NaCl和乙酸(CH3COOH),酸性浸泡盐液中NaCl的质量分数为2%~4%，酸性浸泡盐液中乙酸的浓度为0.5%~1.5% ;恒温浸泡的温度为30°C~40°C，恒温浸泡至少12h过夜。
[0021]3.脂肪酶酶解:
将经步骤2的浸泡液过滤，对浸泡后的原料用清水漂洗三次，然后置入酶解罐的脂肪酶酶解液中进行酶解处理，脂肪酶酶解液主要由脂肪酶(TZF)和温水配制而成，脂肪酶的用量为初始原料质量的0.2%~0.6%，温水的用量为初始原料质量的2倍~4倍；酶解处理的温度控制在30°C~50°C，酶解处理的pH值约为6.5~8.0，酶解处理的间隔搅拌反应的总时间为8h~12h ;酶解处理完成后再灭酶，过滤清水漂洗至中性。
[0022]4.蛋白酶酶解:
将经步骤3脂肪酶酶解后的原料再次置入酶解罐内于蛋白酶酶解液中进行酶解处理，蛋白酶酶解液主要由TJD碱性蛋白酶、TSD酸性蛋白酶、胃蛋白酶和温水配制而成，碱性蛋白酶的用量为初始原料质量的0.08%~1.0%，酸性蛋白酶的用量为初始原料质量的0.4%~
1.0%，胃蛋白酶的用量为初始原料质量的0.02%~0.08%，温水的用量为初始原料质量的2~4倍；酶解处理的温度控制在40°C~60°C，酶解处理的pH值为6.0~7.5，酶解处理的间隔搅拌反应时间为8h~IOh ;酶解处理完成后再灭酶活处理。
[0023]5.分离纯化:
将经步骤4蛋白酶酶解后的胶液以4000r/min~8000r/min转速进行高速离心分离，分离后的上层胶原清液再经真空浓缩、真空干燥后得到胶原蛋白。该胶原蛋白再经生化处理分离纯化后可得到胶原蛋白精粉。
[0024]实施例1:
一种本发明的龟鳖胶原蛋白，该龟鳖胶原蛋白是采用龟壳和鳖壳为原料经过浸泡、月旨肪酶酶解、蛋白酶酶解及分离纯化后得到的胶原蛋白产物。
[0025]上述本发明的龟鳖胶原蛋白的提取方法，具体包括以下步骤。
[0026]1.原料预处理:
以无霉变且经晒干(或烘干)后的整体龟壳和鳖壳为初始原料，取IOOkg用水清洗干净，烘干或晒干后粉碎成Icm~2cm的原料小块，将原料小块加入至200kg的预处理液中于控温罐内进行浸泡预处理，预处理液中含有NaCl和Na2CO3,预处理液中NaCl的质量分数为2%，预处理液中Na2CO3的质量分数为15% ;浸泡预处理的温度控制在50°C，恒温下浸泡预处理的时间不少于12h，浸泡预处理后的原料小块经过滤、漂洗，再进行烘干或晒干后完成对原料的预处理过程。
[0027]2.浸泡:
以经过上述预处理后的龟壳和鳖壳为原料，经清水漂洗后烘干，再研磨粉碎成粗粉粒并盛入保温罐内，向保温罐中加入2倍于原料质量的酸性浸泡盐液进行恒温浸泡；酸性浸泡盐液中含有NaCl和乙酸(CH3COOH),酸性浸泡盐液中NaCl的质量分数为2%，酸性浸泡盐液中乙酸的浓度为0.5% ;恒温浸泡的温度为30°C，恒温浸泡12h过夜。
[0028]3.脂肪酶酶解: 将经步骤2的浸泡液过滤，对浸泡后的原料用清水漂洗三次，然后置入酶解罐的脂肪酶酶解液中进行酶解处理，脂肪酶酶解液主要由脂肪酶(TZF)和温水配制而成，脂肪酶的用量为初始原料质量的0.4%，温水的用量为初始原料质量的2倍；酶解处理的温度控制在40°C，酶解处理的pH值约为7.0，酶解处理的间隔搅拌反应的总时间为8h~12h ;酶解处理完成后再灭酶，过滤清水漂洗至中性。
[0029]4.蛋白酶酶解:
将经步骤3脂肪酶酶解后的原料再次置入酶解罐内于蛋白酶酶解液中进行酶解处理，蛋白酶酶解液主要由TJD碱性蛋白酶、TSD酸性蛋白酶、胃蛋白酶和温水配制而成，碱性蛋白酶的用量为初始原料质量的0.08%，酸性蛋白酶的用量为初始原料质量的0.4%，胃蛋白酶的用量为初始原料质量的0.02%，温水的用量为初始原料质量的2倍；酶解处理的温度控制在40°C~60°C，酶解处理的pH值为7.0~7.5，酶解处理的间隔搅拌反应时间为8h~IOh ;酶解处理完成后再灭酶活处理。
[0030]5.分离纯化:
将经步骤4蛋白酶酶解后的胶液以8000r/min转速进行高速离心分离20min,分离后的上层胶原清液再经真空浓缩、真空干燥后得到胶原蛋白。该胶原蛋白再经生化处理分离纯化后可得到胶原蛋白精粉。
[0031]实施例2:
一种本发明的龟鳖胶原蛋白，该龟鳖胶原蛋白是采用龟壳和鳖壳为原料经过浸泡、月旨肪酶酶解、蛋白酶酶解及分离纯化后得到的胶原蛋白产物。
[0032]上述本发明的龟鳖胶原蛋白的提取方法，具体包括以下步骤。
[0033]1.原料预处理:
以无霉变且经晒干(或烘干)后的整体龟壳和鳖壳(质量比为1:1)为初始原料，取Ikg用水清洗干净，烘干或晒干后粉碎成1_的原料小块，加入2kg~3kg清水，再加入食醋Ikg煮沸，冷却到室温过滤弃去滤液；将过滤后的Ikg原料小块再加入至3L的预处理液中于控温罐内进行浸泡预处理，预处理液中含有NaCl和Na2CO3,预处理液中NaCl的质量分数为4%，预处理液中Na2CO3的质量分数为10% ;浸泡预处理的温度控制在30°C，恒温下浸泡预处理12h，浸泡预处理后的原料小块经过滤、漂洗，再进行烘干或晒干后完成对原料的预处理过程。
[0034]2.浸泡:
以经过上述预处理后的龟壳和鳖壳为原料，经清水漂洗后烘干，再研磨粉碎成粗粉粒并盛入保温罐内，向保温罐中加入2倍于原料质量的酸性浸泡盐液进行恒温浸泡；酸性浸泡盐液中含有NaCl和乙酸(CH3COOH),酸性浸泡盐液中NaCl的质量分数为4%，酸性浸泡盐液中乙酸的浓度为1% ;恒温浸泡的温度为35°C，恒温浸泡12h过夜；浸泡后的原料漂洗至中性，再加入含TQ纤维素酶2%~6%的处理液2L，调pH6.5~7.5，在30°C~50°C温度下酶解6h，冷却至30°C过滤弃去滤液。
[0035]3.脂肪酶酶解:
将经步骤2的原料用清水漂洗三次，然后置入酶解罐的脂肪酶酶解液中进行酶解处理，脂肪酶酶解液主要由脂肪酶(TZF)和温水配制而成，脂肪酶的用量为初始原料质量的
0.6%，温水的用量为初始原料质量的3倍左右；酶解处理的温度控制在40°C，酶解处理的PH值约为7.0，酶解处理的间隔搅拌反应的总时间为8h ;酶解处理完成后再升温至70°C~85°C灭酶处理5min~15min,冷却至30°C,过滤清水漂洗至中性。
[0036]4.蛋白酶酶解:
将经步骤3脂肪酶酶解后的原料再次置入酶解罐内于蛋白酶酶解液中进行酶解处理，蛋白酶酶解液主要由TJ`D碱性蛋白酶、TSD酸性蛋白酶、胃蛋白酶和温水配制而成，碱性蛋白酶的用量为初始原料质量的0.08%，酸性蛋白酶的用量为初始原料质量的0.4%，胃蛋白酶的用量为初始原料质量的0.02%，温水的用量为初始原料质量的3倍；酶解处理的温度控制在40°C~60°C，酶解处理的pH值为7.0~7.5，酶解处理的间隔搅拌反应时间为8h ;酶解处理完成后再升温至70°C~85°C灭酶活处理5mirT20min，灭酶完成后降温至40°C立即进入下一步的处理。
[0037]5.分离纯化:
将经步骤4蛋白酶酶解后的胶液以2%~5%活性炭脱色(或5%~10%硅藻土脱色)，再以6000r/min转速进行高速离心分离30min，分离后的上层胶原清液再经真空浓缩、真空干燥后得到胶原蛋白。该胶原蛋白再经生化处理分离纯化后可得到胶原蛋白精粉。
【权利要求】
1.一种龟鳖胶原蛋白，其特征在于:所述龟鳖胶原蛋白是采用龟壳和/或鳖壳为原料经过浸泡、脂肪酶酶解、蛋白酶酶解及分离纯化后得到的胶原蛋白产物。
2.一种如权利要求1所述的龟鳖胶原蛋白的提取方法，包括以下步骤: (1)浸泡:以经过预处理后的龟壳和/或鳖壳为原料，经清洗、粉碎后加入酸性浸泡盐液中进行恒温浸泡； (2)脂肪酶酶解:将经步骤(1)浸泡后的原料清洗，然后置入脂肪酶酶解液中进行酶解处理，再灭酶漂洗至中性； (3)蛋白酶酶解:将经步骤(2)酶解后的原料置入蛋白酶酶解液中进行酶解处理，再灭酶活处理； (4)分离纯化:将经步骤(3)酶解后的胶液以4000r/min~8000r/min转速进行高速离心分离，分离后的上层胶原清液经真空浓缩、真空干燥后得到胶原蛋白。
3.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于:所述步骤(1)中，所述酸性浸泡盐液中含有NaCl和乙酸，所述酸性浸泡盐液中NaCl的质量分数为2%~4%，所述酸性浸泡盐液中乙酸的浓度为0.5%~1.5%。
4.根据权利要求3所述的提取方法，其特征在于:所述步骤(1)中，酸性浸泡盐液的用量为所述原料质量的2倍~4倍。
5.根据权利要求2、3或4所述的提取方法，其特征在于:所述步骤(1)中，恒温浸泡的温度为30°C~40°C，恒温浸泡时间不少于12h。
6.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于:所述步骤(2)中，所述脂肪酶酶解液主要由脂肪酶和水配制而成，所述脂肪酶的用量为初始原料质量的0.2%~0.6%，所述水的用量为初始原料质量的2倍~4倍。
7.根据权利要求2或6所述的提取方法，其特征在于:所述步骤(2)中，酶解处理的温度为30°C~50°C，酶解处理的pH值为6.5~8.0，酶解处理的时间为8h~12h。
8.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于:所述步骤(3)中，所述蛋白酶酶解液主要由碱性蛋白酶、酸性蛋白酶、胃蛋白酶和水配制而成，所述碱性蛋白酶的用量为初始原料质量的0.08%~1.0%，所述酸性蛋白酶的用量为初始原料质量的0.4%~1.0%，所述胃蛋白酶的用量为初始原料质量的0.02%~0.08%，所述水的用量为初始原料质量的2倍~4倍。
9.根据权利要求2或8所述的提取方法，其特征在于:所述步骤(3)中，酶解处理的温度为40°C~60°C，酶解处理的pH值为6.0~7.5，酶解处理的时间为8h~10h。
10.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，所述步骤(1)中的预处理包括以下步骤:取龟壳和/或鳖壳经清洗、干燥后粉碎成原料小块，将原料小块加入至预处理液中进行浸泡预处理，所述预处理液中含有NaCl和Na2CO3,所述预处理液中NaCl的质量分数为2%~4%，所述预处理液中Na2CO3的质量分数为10%~20% ;浸泡预处理的温度控制在30°C~50°C，浸泡预处理的时间不少于12h，浸泡预处理后的原料小块经过滤、漂洗、干燥后得到步骤(I)中的原料。
【文档编号】C07K1/14GK103739704SQ201310748889
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2013年12月31日 优先权日:2013年12月31日
【发明者】李高霖 申请人:李高霖, 任晓洁