一种多手段协同提取大分子活性胶原蛋白的方法
【专利摘要】本发明公开了一种多手段协同提取大分子活性胶原蛋白的方法，包括以下步骤：1）新鲜鱼皮的预处理；2）活性胶原蛋白的提取：将预处理的鱼皮投入去离子水中，加入如0.5～1.0M的乙酸，在冰浴条件下，进行超声1；然后加入复合蛋白酶，酶解5～8h，离心处理后取上清液，得到胶原蛋白溶液；3）活性胶原蛋白的纯化：将上述胶原蛋白溶液进行盐析和沉淀后，得到的沉淀再次用乙酸溶解，离心并取上清液，并进行脱盐处理，最后得到浓度为20～50%的大分子活性胶原蛋白溶液。本发明通过超声波、乙酸和复合酶的协同作用提取胶原蛋白，并综合运用盐析、透析和超滤技术制得大分子活性胶原蛋白溶液，并能稳定存在。
【专利说明】一种多手段协同提取大分子活性胶原蛋白的方法
[0001]
【技术领域】
[0002]本发明属于生物化学领域，尤其涉及胶原蛋白的提取方法。
【背景技术】
[0003]胶原蛋白是具有独特结构的一族蛋白质，广泛存在于哺乳动物组织中，约占总蛋白质的30%以上。胶原蛋白为骨、皮肤、肌腱和韧带提供生物力学性能、控制发育中的细胞基因表型。胶原蛋白的结构呈三股螺旋结构，由三条多肽链组成，每一条胶原链都是左手螺旋构型，三条左手螺旋α-链又互相缠成右手螺旋结构一即超螺旋结构。单个α-链含有至少一个Gly-X-Y序列。每三个氨基酸就有一个甘氨酸残基。胶原蛋白的特有结构和化学组成使其具有许多独特性质和功能。这些性质和功能使其在各个领域得到了广泛应用，如生物医学材料、药物输送载体、组织工程、化妆品和食品等领域。
[0004]目前，国内活性胶原蛋白虽有科研单位进行了研究和开发，并有一些活性胶原蛋白提取工艺方面的专利与报道，但目前离产业化水平仍有一定差距，只限于少数几家公司能够进行中试或小规模试生产。由于活性胶原蛋白产业化水平较低，限制了它的下游产品开发与应用。目前，活性胶原蛋白在保健食品、化妆品领域中的应用有大量报道和销售，但对于医用级大分子量活性胶原蛋白的提取技术仅处于小规模水平。
【发明内容】
[0005]发明目的:针对上述现有存在的问题和不足，本发明的目的是提供了一种大分子活性胶原蛋白的制备方法，其特点是通过超声波、乙酸和复合酶的协同作用提取胶原蛋白，并综合运用盐析、透析和超滤技术制得大分子活性胶原蛋白溶液，并能稳定存在。
[0006]技术方案:为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案:一种多手段协同提取大分子活性胶原蛋白的方法，包括以下步骤:
O新鲜鱼皮的预处理:取100重量份的鱼肉水洗后，加入NaCl和TriS-HCl的溶液中均质5~1min ;并用高速冷冻离心机离心10~25min,取衬垫,重复上述步骤直到没哟浮游脂肪和气泡产生，然后用去离子水清洗；
2)活性胶原蛋白的提取:将预处理的鱼皮投入去离子水中，加入如0.5~1.0M的乙酸，在冰浴条件下，进行超声10~25min ;然后加入0.1~0.5重量份的复合蛋白酶，进行酶解
5~8h，离心处理后取上清液，得到胶原蛋白溶液；
3)活性胶原蛋白的纯化:将上述胶原蛋白溶液进行盐析和沉淀后，得到的沉淀再次用乙酸溶解，离心并取上清液，并进行脱盐处理，最后用超滤膜去除小分子物质和多肽，得到浓度为20~50%的大分子活性胶原蛋白溶液。
[0007]作为优选，步骤3)选孔径为10_50nm的超滤膜浓缩上述胶原蛋白溶液，加入NaCl至终浓度为0.5-1.3M，盐析过夜，然后离心10-30min，取沉淀；沉淀再次用0.5-1M乙酸溶解后，离心1-2h，取上清，对0.1-0.2M乙酸透析脱盐，用100-200nm孔径的超滤膜去除小分子物质和多肽，得到浓度为20-50%的大分子活性胶原蛋白溶液。
[0008]作为优选，步骤I)所述NaCl和Tris-HCl的溶液中NaCl浓度为20~30%，pH为7~8，其中鱼肉与该溶液的重量比为1:20~40。
[0009]作为优选，步骤2)中立新处理后得到的沉淀加入去离子水，并条pH为中性，加入复合蛋白酶酶解3~6h后，离心，获得第二份上清液，该上清液与之前获得的上清液合并进入到后续步骤。
[0010]作为优选，所述复合蛋白酶为胃蛋白酶、酸性酶3350和木瓜蛋白酶中的一种或多种的混合。
[0011]有益效果:与现有技术相比，本发明具有以下优点:本发明通过超声波、乙酸和复合酶的协同作用提取胶原蛋白，并综合运用盐析、透析和超滤技术制得大分子活性胶原蛋白溶液，并能稳定存在。
【具体实施方式】
[0012]下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。
[0013]实施例1:
选取新鲜鱼皮，100重量份，水洗去肉后，加入20% NaCI (0.05M Tris-HCI,pH7.5)溶液中(1:20, w/v)均质5min,用转速为1000rpm高速冷冻离心机离心1min,取沉淀,重复上述操作，直到没有浮游脂肪和气泡产生，然后用去离子水清洗。将预处理后的鱼皮加入预冷的去离子水中(1: 50，w/v)，冰浴，加入乙酸至0.5M超声1min,超声波功率300W。加入0.1重量份胃蛋白酶，酶解5h，离心，取上清。所得沉淀加去离子水(1:50)，调pH值至中性，加入0.1重量份中性蛋白酶，酶解3h，离心，取上清。合并两份上清，得胶原蛋白溶液。选孔径为1nm的超滤膜浓缩上述胶原蛋白溶液，加入NaCl至终浓度为0.5M，盐析过夜，然后离心1min,取沉淀。沉淀再次用0.5M乙酸溶解后，离心Ih,取上清,对0.1M乙酸透析脱盐，用10nm孔径的超滤膜去除小分子物质和多肽，得到浓度为20%的大分子活性胶原蛋白溶液。
[0014]实施例2:
选取新鲜鱼皮，100重量份，水洗去肉后，加入30% NaCI (0.05M Tris-HCI,pH7.5)溶液中(1:40, w/v)均质1min,用转速为15000rpm高速冷冻离心机离心25min,取沉淀,重复上述操作，直到没有浮游脂肪和气泡产生，然后用去离子水清洗。
[0015]2.活性胶原蛋白的提取
将预处理后的鱼皮加入预冷的去离子水中(1: 100，w/v)，冰浴，加入乙酸至1.0M超声25min，超声波功率600W。加入0.5重量份胃木瓜蛋白酶，酶解8h，离心，取上清。所得沉淀加去离子水(1:100)，调pH值至中性，加入0.5重量份菠萝蛋白酶，酶解6h，离心，取上清。合并两份上清，得胶原蛋白溶液。选孔径为50nm的超滤膜浓缩上述胶原蛋白溶液，加ANaCl至终浓度为1.3M，盐析过夜，然后离心30min，取沉淀。沉淀再次用IM乙酸溶解后，离心2h，取上清，对0.2M乙酸透析脱盐，用200nm孔径的超滤膜去除小分子物质和多肽，得到浓度为50%的大分子活性胶原蛋白溶液。
【权利要求】
1.一种多手段协同提取大分子活性胶原蛋白的方法，包括以下步骤: 1)新鲜鱼皮的预处理:取100重量份的鱼肉水洗后，加入NaCl和TriS-HCl的溶液中均质5~1min ;并用高速冷冻离心机离心10~25min,取衬垫,重复上述步骤直到没哟浮游脂肪和气泡产生，然后用去离子水清洗； 2)活性胶原蛋白的提取:将预处理的鱼皮投入去离子水中，加入如0.5~1.0M的乙酸，在冰浴条件下，进行超声10~25min ;然后加入0.1~0.5重量份的复合蛋白酶，进行酶解5~8h，离心处理后取上清液，得到胶原蛋白溶液； 3)活性胶原蛋白的纯化:将上述胶原蛋白溶液进行盐析和沉淀后，得到的沉淀再次用乙酸溶解，离心并取上清液，并进行脱盐处理，最后用超滤膜去除小分子物质和多肽，得到浓度为20~50%的大分子活性胶原蛋白溶液。
2.根据权利要求1所述多手段协同提取大分子活性胶原蛋白的方法，其特征在于:步骤3)选孔径为10-50nm的超滤膜浓缩上述胶原蛋白溶液，加入NaCl至终浓度为0.5-1.3M，盐析过夜，然后离心10-30min，取沉淀；沉淀再次用0.5-1M乙酸溶解后，离心l_2h，取上清，对0.1-0.2M乙酸透析脱盐，用100-200nm孔径的超滤膜去除小分子物质和多肽，得到浓度为20-50%的大分子活性胶原蛋白溶液。
3.根据权利要求1或2所述多手段协同提取大分子活性胶原蛋白的方法，其特征在于:步骤I)所述NaCl和Tris-HCl的溶液中NaCl浓度为20~30%，pH为7~8，其中鱼肉与该溶液的重量比为1:20~40。
4.根据权利要求3所述多手段协同提取大分子活性胶原蛋白的方法，其特征在于:步骤2)中立新处理后得到的沉淀加入去离子水，并条pH为中性，加入复合蛋白酶酶解3~6h后，离心，获得第二份上清液，该上清液与之前获得的上清液合并进入到后续步骤。
5.根据权利要求1所述多手段协同提取大分子活性胶原蛋白的方法，其特征在于:所述复合蛋白酶为胃蛋白酶、酸性酶3350和木瓜蛋白酶中的一种或多种的混合。
【文档编号】C07K14/78GK104073536SQ201310096758
【公开日】2014年10月1日 申请日期:2013年3月25日 优先权日:2013年3月25日
【发明者】程张军, 郁帅陆, 黄荣醒, 陈美娟 申请人:林琳