专利名称：载有蛋白大分子的多糖－聚合物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及的是一种生物技术领域的聚合物及其制备方法。特别是一种载有蛋白大分子的多糖-聚合物及其制备方法。
背景技术：
生物兼容性、可降解性聚合物已广泛地用于疾病治疗和其它相关领域。将这类材料与近年来高速发展的生物技术药物相结合有着诱人的应用前景，同时也遇到如何保持结构相对脆弱的生物技术药物在这类材料中稳定性低的技术瓶颈。和化学小分子药物相比，蛋白大分子有着特异性更强、选择性更好的疗效，然而其脆弱易变的结构成为生物医学材料制备中有待解决的问题。特别是包括组织工程材料在内的生物医学材料常常需要根据治疗目的的不同以不同的工艺制备成各种形状或涂层于不同的治疗器械的表面。
关于聚合物包封的蛋白大分子的稳定性，较好的办法是将蛋白分子预先制备成固体微粒，使其构像固定。然而，将蛋白大分子在不改变构像的同时制成固体微粒并不容易，已报道过的方法均有各种不足。比如，将蛋白与小分子糖类或大分子多糖的混合溶液制成冻干粉的方法难以制得粒径小于10μm的颗粒。将蛋白与糖类的溶液喷雾干燥时会遇到喷嘴的高温和高剪切力。将蛋白与糖类的溶液喷入液氮然后冻干也会遇到高剪切力，而且所形成的颗粒为密度低于0.5的多孔结构，不利于对蛋白大分子的保护。将蛋白大分子与二价金属离子作用沉淀为离子键微粒则会造成一些蛋白的不可逆聚集。在蛋白溶液中加入无机盐或PEG，将蛋白盐析出来成为微粒时，前者难以除去盐类，而后者的PEG虽然可以除去但蛋白微粒直接接触聚合物也会引起不可逆沉淀。
在医疗器械表面涂上载药的功能材料膜或组织工程材料中添加药物治疗方案已经有产品上市。但是在医疗器械表面涂上具有生物活性的膜或在组织工程材料里添加具有生物活性的生物治疗试剂至今还没有产品问世，主要是由于生物治疗试剂在制备过程容易失活如蛋白质，在制备过程不可避免要接触到有机试剂、高剪切力、油水界面导致蛋白质的变性失活，在释放过程又要遇到局部过酸导致变性失活，还有不完全释放等一系列问题。目前尽管有在心脏支架的表面用化学的方法把抗体固定在支架的表面来捕获内皮细胞在支架的表面上生长；和在其表面涂上内皮细胞生长因子(VEGF)来刺激内皮细胞在支架的表面上生长防止血管平滑肌细胞增生，但是突释严重和载药量太低，还远达不到临床治疗要求。还有在血管内导入基因，促进内皮细胞增生及血栓溶解，抑制平滑肌细胞的增殖等将有可能达到防治再狭窄的目的和Klugherz.B.D.，等人研究报道了控释DNA-PLGA心脏支架。主要的基因类型有①抗血栓形成的基因，如重组t-PA基因；②血管活性物质的基因，如重组NOS基因；③生长因子和细胞因子的基因，如VEGF基因、PDGF的反意RNA或DNA；④癌基因与抗癌基因，如重组反意Ras癌基因等；⑤细胞周期调节基因，如Cyclin、CDK以及ICE、Bax等。常用的基因治疗方法为转基因治疗(包括；负显性基因治疗、抑制性转基因治疗、药物前体基因治疗)；反义核酸药物治疗(包括反义寡核甘酸、反义mRNA等)。基因涂层支架大多是采用通过基因转录，如以腺病毒、质粒DNA等为载体携带目的基因到病变处，基因表达合成目的蛋白质。但是由于基因的转染效率及安全问题，现在基因治疗还处在实验研究阶段。
经对现有技术文献的检索发现，[Hennink W.E.and Franssen D.(EN)PROCESS FOR THE PREPARATION OF A CONTROLLED RELEASE SYSTEM(FR)PROCEDEDE PREPARATION D’UN SYSTEME A LIBERATION RETARDEE。Publication No.International Application No.PCT/NL1997/000625].(Hennink W.E.andFranssen D.一种制备控释放系统的方法，公开号为WO/1998/022093，国际申请号PCT/NL1997/000625)Hennink W.E.报道了水相-水相两相系统制备多糖颗粒。不过它们使用了可以交联的多糖，而着些交联基团是通过化学修饰得到。这样不仅会改变多糖的本身的性质，有可能增加多糖的免疫原性，同时这些交联基团也可能与蛋白质和多肽发生交联，因为交联基团并没有特殊的选择性。但是还没见载有蛋白质的多糖玻璃体-聚合物的报道。
发明的内容本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种载有蛋白大分子的多糖-聚合物及其制备方法。使其当蛋白药物需要用于介入治疗时，如何使得这类大分子在不同的工艺条件下始终保持着自然构像，同时蛋白大分子物理混合于这类亲水性多糖微粒的基质中，避免了与用于包封的聚合物的相互作用，不引起蛋白的聚集或其它反应。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明载有蛋白大分子的多糖-聚合物含有多糖、蛋白质、聚合物、保护蛋白质的试剂，在制备具体蛋白质多糖-聚合物时，根据具体需要选择不同的多糖、蛋白质、聚合物、保护试剂；多糖为0.01％-50％、蛋白质为0.01％-50％、聚合物为20％-80％、保护蛋白质的试剂为0％-10％。
所述的多糖包括葡聚糖、淀粉、纤维素及其衍生物、琼脂糖和水溶性高分子多糖。
所述的蛋白质，其蛋白大分子分布在多糖相中形成玻璃体微粒，而蛋白-多糖微粒均匀地分布在脂溶性聚合物基质中。内所述的蛋白质为促红细胞生成素(EPO)、重组人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、疫苗、干扰素(INF)、生长激素(GH)、胰岛素(Insulin)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、转化生长因子(TGF-β)、胰岛素样生长因子(IGF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、血小板生长因子(PDGF)、内皮生长因子(ECGF)、神经生长因子(NGF)、骨衍生性生长因子(BDGF)、骨形成蛋白(BMP)、组织多肽抗原(TPA)、抗体(antibody)、凝血因子VIII(VIII)及IX遗传因子和其他用于治疗的蛋白质或多肽，反义核苷酸(anti-RNA)、小分子RNA(RNAi)、基因(DNA)、抗体、疫苗、或脂质体。
所述的聚合物为具有功能高分子化合物。
所述的功能高分子聚合物为聚酯、聚酸酐、或骨架非肽键的聚氨基酸，其中包括聚乳酸、聚乳酸-聚羟基乙酸及其组合；还包括硅像胶、聚四氟乙烯、聚氯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚碳酸酯、卡波母、透明质酸、明胶、胶原蛋白、聚乙交酯、聚己内酯、聚氰基丙烯酸酯、聚膦腈、聚磷酸酯、纤维蛋白原、纤维蛋白、凝胶包括聚乙二醇-聚乳酸、聚乙二醇-聚羟基乙酸、聚羟基乙酸-聚乙二醇-聚羟基乙酸、聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸温敏型水凝胶和敏感型材料。
所述的微粒，是指蛋白-多糖微粒，其粒径在60纳米-20微米。
所述的保护蛋白质的试剂为小糖、多羟基化合物、氨基酸化合物、金属化合物的一种或任意组合。
所述的小糖，包括海藻糖、蔗糖、乳糖。
所述的多羟基化合物，包括甘露醇、甘油。
所述的氨基酸化合物，包括甘氨酸、精氨酸。
所述的金属化合物，包括锌、铜、镁、铁、钙。
本发明可制成为薄膜、纤维、支架、骨架以及器件表面的涂层；还可用于薄膜、纤维、骨架以及器件的表面涂层当载有治疗性蛋白药物的介入治疗。
本发明载有蛋白大分子的多糖-聚合物的制备方法包括以下步骤①将蛋白加入多糖溶液或将蛋白加入多糖和聚乙二醇混合溶溶；②将所制备的蛋白-多糖溶液6％或6％以上浓度溶液与相同浓度的聚乙二醇溶液在低于室温高于冰点的温度下混合，或将蛋白-多糖6％或6％以上浓度溶液与并含有0.2-2％的聚电解质的聚乙二醇溶液在冰点以上的温度混合，或将蛋白-多糖6％以下浓度溶液与相同浓度聚乙二醇溶液在冰点以上的温度混合；③将所形成的混合溶液或水相-水相乳浊液冷冻干燥；④将所得到的冻干粉加入可溶聚乙二醇的有机溶液洗涤，除去聚乙二醇，得到载有蛋白的多糖玻璃体微粒；⑤将所得到的蛋白-多糖玻璃体微粒加入脂溶性聚合物的溶液混合均匀，并将此悬浊液成型为薄膜、纤维、骨架、涂层或直接喷涂在器械的表面上，使溶剂挥发后待用。
所述的聚电解质为海藻酸钠、羧甲酸纤维素钠带负电荷的聚电解质。
所述的多糖溶液与相同的聚乙二醇溶液在低于室温高于冰点的温度下混合或加聚电解质的，它们的浓度为6％-40％；蛋白质的浓度为0.1％-20％.
所述的聚合物的溶液是一种或几种功能高分子聚合物组合，蛋白质也是一种或几种组合，根据具体的蛋白质的性质和治疗需要，甚至可以添加化学药起到联合治疗目的。
本发明可以制成薄膜、纤维、骨架以及其它器件的表面涂层以用于介入治疗或其它用途。本发明具有多种功能，可以根据需要，选择不同的配方达到治疗的目的。制备方法制作的各种支架的涂层、膜、骨架、纤维、组织工程材料的支架可以对药物的活性有保护和缓控释作用。
具体实施实例实例1薄膜控释剂的制备和体外释放行为一、溶液配置1.肌红蛋白溶液制备称取肌红蛋白20.7mg，加入超纯水2ml中涡选溶解，得到肌红蛋白溶液浓度约10mg/ml。
2.葡聚糖溶液制备称取葡聚糖(Mw＝64,000-70,000)1.0g，加超纯水至10.00g，加热搅拌至溶解。得到葡聚糖溶液重量百分比约10％。
3.PEG溶液制备称取葡聚糖(Mw＝8,000)1.0g，加超纯水至10.00g，加热搅拌至溶解。得到葡聚糖溶液重量百分比约10％。
二、模型蛋白-葡聚糖微粒制备1.肌红蛋白葡聚糖微粒制备分别称取肌红蛋白溶液、葡聚糖溶液和PEG溶液0.50g、0.16g和1.00g(注两份)，在0℃的条件下，采用匀浆器E档(22,000rpm)匀浆3×5s。上述乳液在-20℃放过夜，再冷冻干燥24h。干燥物置于二氯甲烷5ml中，12,000rpm离心5min，倾去上层清夜，重复二氯甲烷洗涤过程三次。将最后得到的肌红蛋白葡聚糖微粒保存在1ml二氯甲烷中。
2.空白对照葡聚糖微粒制备分别称取葡聚糖溶液和PEG溶液0.15g和1.00g，按上面制备方法同法制备。
(注将上述两种微粒在PCS测定其粒径分布和大小及扫描电镜观察形态和大小如
图1，2，微粒大多数粒径在1～2um左右。)三、薄膜控释制剂的制备1:5薄膜控释制剂制备称取PLGA(75/253A)15.1mg、二氯甲烷1ml，涡选溶解。加入700ul摇匀的肌红蛋白葡聚糖微粒混悬液，涡选使分散均匀。采用喷笔将上述溶液喷到载玻片上或金属片上，将制备的金属片减压去除二氯甲烷。干燥后从载玻片上或金属片上小心的收集膜，我们可以清楚的看到膜中有分散均匀的葡聚糖微粒。
四、释放液测定
释放液样品采用micro-BCA试剂盒测定。以肌红蛋白标准蛋白制备标准曲线。肌红蛋白-葡聚糖膜释放液吸收值减除同法制备的空白膜释放液吸收值进行校正，带入上述标准曲线中计算释放液肌红蛋白浓度。依次绘制不同葡聚糖/PLGA比例涂层中肌红蛋白的释放曲线。可以看出其释放行为良好，无明显突释行为。
这些薄膜可以直接用于临床，起到治疗效果。还可以把它固定在其它支架上，起到缓控释和治疗作用。
实例2支架涂层模型控释剂的制备和体外释放行为一、模型蛋白-葡聚糖微粒制备按照实例1制备二、模型蛋白(肌红蛋白)涂层制备15涂层制备称取PLGA(50/502A)15.1mg、二氯甲烷1ml，涡选溶解。加入700ul摇匀的肌红蛋白葡聚糖微粒混悬液，涡选使分散均匀。采用喷笔将上述溶液喷到316L不锈钢金属片，将制备的金属片减压去除二氯甲烷。
110涂层制备称取PLGA(50/502A)29.9mg，按上面方法同法制备涂层。
115涂层制备称取PLGA(50/502A)45.6mg，按上面方法同法制备涂层。
空白涂层制备同上述三种涂层分别称取PLGA(50/502A)适量、二氯甲烷1ml，涡选溶解。采用喷笔将上述溶液喷到316L不锈钢金属片，将制备的金属片减压去除二氯甲烷。
三、涂层释放试验按照实例1进行释放液测定；其释放曲线如图6这些医疗器械的涂层可以直接用于临床，起到治疗效果。
实例3心脏支架涂层控释剂的制备和体外释放行为一、模型蛋白-葡聚糖微粒制备按照实例1制备；二、心脏支架涂层按照实例1制备15涂层制备称取PLGA(75/253A)15.1mg、二氯甲烷1ml，涡选溶解。加入700ul摇匀的肌红蛋白葡聚糖微粒混悬液，涡选使分散均匀。采用喷笔将上述溶液喷到心脏支架表面上，将制备的心脏支架减压去除二氯甲烷。心脏支架的表面通过扫描电镜可以清楚的看到其表面光滑平整，没有毛刺，支架涂层适合临床应用。
三、心脏支架涂层释放试验按照实例1进行释放液测定；其体外释放曲线可以看出其释放行为良好，无明显突释行为。
这些医疗器械的涂层可以直接用于临床，起到治疗效果，这种支架不仅有支撑作用，还有缓控释作用和治疗效果。
实例4骨架控释剂的制备和体外释放行为模型蛋白-葡聚糖微粒制备按照实例1制备；二、骨架控释剂的制备15骨架控释剂的制备称取PLGA(75/253A)300.1mg、二氯甲烷5ml，涡选溶解。加入60mg肌红蛋白葡聚糖微粒上诉PLGA溶液中，涡悬使其分散均匀。采用喷笔将上述溶液喷到或浇灌到模器中，然后一边用氮气吹干，再继续溶液喷到或浇灌到模器中，然后再继续吹干，直到满足需要为止。清楚的看到有微粒分散在里面。
三、骨架控释剂的释放试验按照实例1进行释放液测定；通过优化制备处方，可以清楚的看到没有明显突释释放曲线。
这种骨架不仅有支撑作用，还有缓控释治疗作用。
实例5本发明方法对β-半糖乳糖苷酶蛋白的保护作用为了验证本发明对生物活性物质有较好的保护作用，设计如下实验有机溶液存在条件下葡聚糖微粒对结构易变的蛋白大分子的保护作用，把β-半糖乳糖苷酶(一个具有四级结构、分子量为500KD的酶)载进葡聚糖微粒进行了测试。先将蛋白质以0.67mg/ml β-半糖乳糖苷酶溶于葡聚糖溶液，按照1∶20的比例，然后将其加入实例1所描述的PEG溶液中乳化。冷冻干燥后，用二氯甲烷反复洗涤几遍除去PEG。接下来的步骤中，将所回收的载着蛋白质的葡聚糖微粒在缓冲液中重新溶解，加入o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside(ONPG)，测试对底物-ONPG的水解催化活性。如图13中所示，酶的催化作用在经历了从实例1到实例2所描述的操作过程(包括乳化、冷冻干燥以及二氯甲烷洗涤)后，只是下降了不到10％。此10％的活性下降还包括了由于在乳化过程中被分配在PEG相的部分蛋白以及冷冻干燥过程中损失的蛋白活性。也就是说，在与微囊包过程所用的有机溶液-二氯甲烷的接触中，葡聚糖微粒有效地保存了蛋白酶的活性。
权利要求
1.一种载有蛋白大分子的多糖-聚合物，其特征在于，含有多糖、蛋白质、聚合物、保护蛋白质的试剂，在制备具体蛋白质多糖-聚合物时，根据具体需要选择不同的多糖、蛋白质、聚合物、保护试剂；多糖为0.01％-50％、蛋白质为0.01％-50％、聚合物为20％-80％、保护蛋白质的试剂为0％-10％。
2.根据权利要求1所述的载有蛋白大分子的多糖-聚合物，其特征是，所述的多糖包括葡聚糖、淀粉、纤维素及其衍生物、琼脂糖和水溶性高分子多糖。
3.根据权利要求1所述的载有蛋白大分子的多糖-聚合物，其特征是，所述的蛋白质，其蛋白大分子分布在多糖相中形成玻璃体微粒，而蛋白-多糖微粒均匀地分布在脂溶性聚合物基质中。
4.根据权利要求1所述的载有蛋白大分子的多糖-聚合物，其特征是，所述的聚合物为功能高分子化合物包括聚酯、聚酸酐、或骨架非肽键的聚氨基酸，其中包括聚乳酸、聚乳酸-聚羟基乙酸及其组合；还包括硅像胶、聚四氟乙烯、聚氯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚碳酸酯、卡波母、透明质酸、明胶、胶原蛋白、聚乙交酯、聚己内酯、聚氰基丙烯酸酯、聚膦腈、聚磷酸酯、纤维蛋白原、纤维蛋白、凝胶包括聚乙二醇-聚乳酸、聚乙二醇-聚羟基乙酸、聚羟基乙酸-聚乙二醇-聚羟基乙酸、聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸温敏型水凝胶和酶感型材料。
5.根据权利要求2所述的载有蛋白大分子的多糖-聚合物及其制备方法，其特征是，是指蛋白-多糖微粒，其粒径在60纳米-20微米。
6.根据权利要求1或者3所述的载有蛋白大分子的多糖-聚合物及其制备方法，其特征是，所述的蛋白质为促红细胞生成素、重组人粒细胞集落刺激因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、疫苗、干扰素、生长激素、胰岛素、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、转化生长因子、胰岛素样生长因子、血管内皮细胞生长因子、血小板生长因子、内皮生长因子、神经生长因子、骨衍生性生长因子、骨形成蛋白、组织多肽抗原、抗体、凝血因子VIII及IX遗传因子和其他用于治疗的蛋白质或多肽，反义核苷酸、小分子RNA、基因、抗体、疫苗、或脂质体。
7.根据权利要求2所述的载有蛋白大分子的多糖-聚合物及其制备方法，其特征是，所述的保护蛋白质的试剂为小糖、多羟基化合物、氨基酸化合物、金属化合物的一种或任意组合。。
8.根据权利要求2所述的载有蛋白大分子的多糖-聚合物及其制备方法，其特征是，所述的小糖，包括海藻糖、甘露醇、蔗糖、乳糖；所述的多羟基化合物，包括甘油；所述的氨基酸化合物，包括甘氨酸、精氨酸；所述的金属化合物，包括锌、铜、镁、铁、钙。
9.一种根据权利要求1所述的载有蛋白大分子的多糖-聚合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤①将蛋白加入多糖溶液或将蛋白加入多糖和聚乙二醇混合溶溶；②将所制备的蛋白-多糖溶液6％或6％以上浓度溶液与相同浓度的聚乙二醇溶液在低于室温高于冰点的温度下混合，或将蛋白-多糖6％或6％以上浓度溶液与并含有0.2-2％的聚电解质的聚乙二醇溶液在冰点以上的温度混合，或将蛋白-多糖6％以下浓度溶液与相同浓度聚乙二醇溶液在冰点以上的温度混合；③将所形成的混合溶液或水相-水相乳浊液冷冻干燥；④将所得到的冻干粉加入可溶聚乙二醇的有机溶液洗涤，除去聚乙二醇，得到载有蛋白的多糖玻璃体微粒；⑤将所得到的蛋白-多糖玻璃体微粒加入脂溶性聚合物的溶液混合均匀，并将此悬浊液成型为薄膜、纤维、骨架或器械涂层，使溶剂挥发后待用。
10.根据权利要求9所述的载有蛋白大分子的多糖-聚合物及其制备方法，其特征是，所述的聚电解质为海藻酸钠、羧甲酸纤维素钠带负电荷的聚电解质，所述的多糖溶液与相同的聚乙二醇溶液在低于室温高于冰点的温度下混合或加聚电解质的，它们的浓度为6％-40％；蛋白质的浓度为0.1％-20％.所述的聚合物的溶液是一种或几种功能高分子聚合物组合，蛋白质也是一种或几种组合。
全文摘要
本发明涉及的是一种生物技术领域的载有蛋白大分子的多糖－聚合物及其制备方法。根据具体需要选择不同的多糖、蛋白质、聚合物、保护试剂；多糖为0.01％－50％、蛋白质为0.01％－50％、聚合物为20％－80％、保护蛋白质的试剂为0％－10％。制备方法包括①将蛋白加入多糖溶液；②将蛋白－多糖与聚乙二醇溶液混合；③将所形成的混合溶液或水相－水相乳浊液冷冻干燥；④将所得到的冻干粉加入可溶聚乙二醇的有机溶液洗涤，除去聚乙二醇，得到微粒；⑤将所得到的微粒加入脂溶性聚合物的溶液混合均匀，并将此悬浊液成型待用。本发明用于蛋白药物介入治疗，避免了与用于包封的聚合物的相互作用，不引起蛋白的聚集。
文档编号C08L83/00GK1903939SQ20061002913
公开日2007年1月31日 申请日期2006年7月20日 优先权日2006年7月20日
发明者金拓, 袁伟恩, 吴飞 申请人:上海交通大学