一种利用大鲵的蜕皮提取胶原蛋白的方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用大鲵的蜕皮提取胶原蛋白的方法，目的在于解决目前大鲵在生产过程中，所蜕的皮白白浪费掉，造成资源严重浪费的问题。该方法包括如下步骤：预处理、粗提取、脱腥、提取、胶原蛋白提纯。本发明通过对人工养殖大鲵的蜕皮进行处理、酶解、过滤、浓缩、喷雾干燥等步骤，最后得到胶原蛋白，其分子量在3000道尔顿以下。本发明实现了大鲵蜕皮的有效利用，并成功制备出胶原蛋白，具有广阔的市场应用前景和较好的社会、经济价值。
【专利说明】一种利用大鲵的蜕皮提取胶原蛋白的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物领域，尤其是一种利用大鲵的蜕皮提取胶原蛋白的方法。
【背景技术】
[0002]大鲵，俗称娃娃鱼，其是世界濒危动物、国家二级保护动物，目前已经成为我国特有的物种，仅分布于我国少数地区。大鲵肌肉蛋白质中含有17中氨基酸，其中8种是人体必需氨基酸，它的肌肉中EAAI (必需氨基酸指数)大于牛肉和鹿肉。目前，我国国内已经开始大鲵的人工养殖。在大鲵的生长过程中，大鲵会进行多次蜕皮，目前皮作为废物被处理掉，没有得到充分利用。
[0003]当前，国内有许多从鱼皮提取胶原蛋白的方法，然而目前还没发现从人工养殖大鲵的蜕皮中提取胶原蛋白的方法。
【发明内容】
[0004]本发明的发明目的在于:针对目前大鲵在生产过程中，所蜕的皮白白浪费掉，造成资源严重浪费的问题，提供一种利用大鲵的蜕皮提取胶原蛋白的方法。本发明通过对人工养殖大鲵的蜕皮进行处理、酶解、过滤、浓缩、喷雾干燥等步骤，最后得到胶原蛋白，其分子量在3000道尔顿以下。本发明实现了大鲵蜕皮的有效利用，并成功制备出胶原蛋白，具有广阔的市场应用前景和较好的社会、经济价值。
[0005]为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案:
一种利用大鲵的蜕皮提取胶原蛋白的方法，包括如下步骤:
(1)预处理
以大鲵的蜕皮为原料，记为原料蜕皮，将原料蜕皮用酸溶液进行浸泡处理，然后经纯化水清洗后，再经杀菌处理，得杀菌清洁蜕皮；
(2)粗提取
将杀菌清洁蜕皮加入水中，再向其中加入杀菌清洁蜕皮质量0.4-0.8%的复合酶，得到第一溶液，调节第一溶液的PH值至6.5-7.0,并在40-50°C下酶解l_6h，然后升温至100°C以上灭酶，得到胶原蛋白粗提液；
(3)脱腥
将步骤2得到的胶原蛋白粗提液降温后，加入杀菌清洁蜕皮质量3?5%的活性炭，搅拌20min以上，过滤去除活性炭，得到脱腥提取液；
(4)提取
将脱腥提取液进行离心处理，得到离心提取液；
(5)胶原蛋白提纯
取步骤4中离心提取液的上清液，向上清液中加入氯盐进行盐析，盐析后进行离心，收集沉淀，将沉淀用乙酸溶解，得到胶原蛋白溶液，将胶原蛋白溶液用纯化水透析后，得到胶原蛋白提取液，冷冻、干燥，即得成品； 所述步骤2中，杀菌清洁蜕皮与水的质量比为1:4-10，复合酶采用中性蛋白酶与菠萝蛋白酶混合而成，所述中性蛋白酶与菠萝蛋白酶的质量比为3:6-8。
[0006]所述步骤I中，将原料蜕皮用质量百分比为2.0?5.0 %的酸溶液进行浸泡预处理，然后用原料蜕皮重量8?10倍的纯化水洗涤浸泡处理后的蜕皮5?8小时，再将洗涤后的蜕皮绞碎，得到绞碎蜕皮；
将绞碎蜕皮与水按重量比1:0.8?I混合后，再进行加热处理，加热温度为98-100°C，加热时间为30-60min，得杀菌清洁的蜕皮。
[0007]所述步骤I中，加热温度为100°C，加热时间为40min。
[0008]所述步骤2中，杀菌清洁蜕皮与水的质量比为1:6，调节第一溶液的pH值至6.8，并在45°C下酶解2h，然后升温至118°C灭酶15min，得到胶原蛋白粗提液。
[0009]所述中性蛋白酶与菠萝蛋白酶的质量比为3:7。
[0010]所述步骤3中，将步骤2得到的胶原蛋白粗提液降温至60°C后，加入杀菌清洁蜕皮质量3?5%的活性炭,搅拌40min。
[0011]所述步骤4中，将脱腥提取液进行离心处理,转速为3000-6000rpm/min,离心时间为l_5min，得到离心提取液。
[0012]所述氯盐为NaCl或KCl。
[0013]所述步骤5中，向上清液中加入氯盐,至氯盐为0.9mol/L后,再以3000-6000rpm/min离心10-35min,收集沉淀,将沉淀用乙酸溶解，Ig沉淀中添加20mL乙酸,重复前述盐析和溶解步骤一次，得到胶原蛋白溶液，将胶原蛋白溶液用纯化水透析后，得到胶原蛋白提取液。
[0014]所述步骤5中，将胶原蛋白溶液用纯化水透析，每天更换透析水3次，透析3天，得到胶原蛋白提取液。
[0015]大鲵的蜕皮中含有大量的胶原蛋白，但目前没有相应的提纯方法，只能白白浪费掉的问题，本发明提供一种利用大鲵的蜕皮提取胶原蛋白的方法。大鲵皮肤中含有41%-61.3%的胶原蛋白，胶原蛋白含量较高。胶原蛋白作为人体的美容物之一，其对人体没有排异性，具有美白、嫩肤、祛皱容颜、预防老年痴呆和防治癌症的功效。本发明以大鲵蜕皮为原料，而大鲵机体中含有70多种天然活性生物，这些生物活性物有食用、药物、化妆品、健康食品等方面有着独特的研发价值，其还含有一种抗癌因子，能软化癌细胞，抑制癌细胞转移，激活能活人体产生抗癌因子，从而达到防癌、抗癌的目的。本发明的大鲵胶原蛋白能促进人体生理活性，改善人体细胞代谢水平，促进人体蛋白质合成，提高人体免疫功能，增强人体抗病能力。
[0016]本发明通过收集健康人工养殖大鲵的正常蜕皮，以此来提取胶原蛋白。本发明中，利用中性蛋白酶与菠萝蛋白酶(南宁庞博生物工程有限公司)混合物(其重量比为中性蛋白酶:菠萝蛋白酶=3:7)对人工养殖大鲵的蜕皮进行水解，混合酶加量为蜕皮重量的0.4%-0.8%，该方法作用条件温和，提取的胶原蛋白纯度高，水溶性好，理化性质稳定。在某些条件下，催化水解胶原的端肽非螺旋区，而对螺旋区无作用，这样溶解的胶原仍有完整的螺旋区段，同时又减少了抗原性，本发明利用该特性，成功制备出理化性质稳定的胶原蛋白。本发明中，最佳酶处理条件为巾11值6.8，酶处理温度451:，酶处理时间211，固液比1:6时，胶原蛋白提取率最高可以达到71.0 %，具有显著的进步意义。
[0017]本发明受此提出利用养殖大鲵的蜕皮进行胶原蛋白的提取，其能够结合企业大鲵养殖的优势，充分利用这一资源，将为后续国家大鲵产业发展奠定基础，具有重要的价值和显著的进步意义。
【具体实施方式】
[0018]本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。
[0019]本说明书中公开的任一特征，除非特别叙述，均可被其他等效或具有类似目的的替代特征加以替换。即，除非特别叙述，每个特征只是一系列等效或类似特征中的一个例子而已。
[0020]实施例1
(I)预处理
以大鲵的蜕皮为原料，记为原料蜕皮。将原料蜕皮用质量百分比为2.0%的稀盐酸溶液进行浸泡预处理，然后用原料蜕皮重量8倍的纯化水洗涤浸泡处理后的蜕皮5.5小时，再将洗涤后的蜕皮绞碎，得到绞碎蜕皮。将绞碎蜕皮与水按重量比1:1混合后，再进行加热处理，加热温度为98-100°C，加热时间为30min，得杀菌清洁的蜕皮。
[0021](2)粗提取
将杀菌清洁蜕皮加入水中，再向其中加入杀菌清洁蜕皮质量0.6%的复合酶，得到第一溶液，调节第一溶液的PH值至6.6，并在40°C下酶解4h，然后升温至115°C以上灭酶，得到胶原蛋白粗提液。其中，杀菌清洁蜕皮与水的质量比为1:5，复合酶采用中性蛋白酶与菠萝蛋白酶混合而成，所述中性蛋白酶与菠萝蛋白酶的质量比为3:6。
[0022](3)脱腥
将步骤2得到的胶原蛋白粗提液降温后，加入杀菌清洁蜕皮质量3?5%的活性炭，搅拌50min，过滤去除活性炭，得到脱腥提取液。
[0023](4)提取
将脱腥提取液进行离心处理，转速为3000rpm/min,离心时间为4min,得到离心提取液。
[0024](5)胶原蛋白提纯
取步骤4中离心提取液的上清液，向上清液中加入氯化钠进行盐析，至氯化钠为0.9mol/L为止,完成盐析。盐析后进行3000rpm/min离心15min,收集沉淀,将沉淀用乙酸溶解，Ig沉淀中添加20mL乙酸，完成溶解步骤。再重复前述盐析和溶解步骤一次，得到胶原蛋白溶液。将胶原蛋白溶液用纯化水透析后，得到胶原蛋白提取液，冷冻、干燥，即得成品。
[0025]经测定，采用本实施例得到的胶原蛋白提取率为66.3%。
[0026]实施例2 (I)预处理
以大鲵的蜕皮为原料，记为原料蜕皮。将原料蜕皮用质量百分比为5.0 %的稀盐酸溶液进行浸泡预处理，然后用原料蜕皮重量10倍的纯化水洗涤浸泡处理后的蜕皮8小时，再将洗涤后的蜕皮绞碎，得到绞碎蜕皮。将绞碎蜕皮与水按重量比1:0.9混合后，再进行加热处理，加热温度为98-100°C，加热时间为40min，得杀菌清洁的蜕皮。
[0027](2)粗提取
将杀菌清洁蜕皮加入水中，再向其中加入杀菌清洁蜕皮质量0.8%的复合酶，得到第一溶液，调节第一溶液的pH值至6.9，并在45°C下酶解3h，然后升温至118°C灭酶15min，得到胶原蛋白粗提液。其中，杀菌清洁蜕皮与水的质量比为1:9，复合酶采用中性蛋白酶与菠萝蛋白酶混合而成，所述中性蛋白酶与菠萝蛋白酶的质量比为3:8。
[0028](3)脱腥
将步骤2得到的胶原蛋白粗提液降温至60°C后，加入杀菌清洁蜕皮质量5%的活性炭，搅拌30min，过滤去除活性炭，得到脱腥提取液。
[0029](4)提取
将脱腥提取液进行离心处理，转速为5500rpm/min,离心时间为2min,得到离心提取液。
[0030](5)胶原蛋白提纯
取步骤4中离心提取液的上清液，向上清液中加入氯化钠进行盐析，至氯化钠为0.85mol/L为止,完成盐析。盐析后进行5000rpm/min离心15min,收集沉淀,将沉淀用乙酸溶解，Ig沉淀中添加ISmL乙酸，完成溶解步骤。再重复前述盐析和溶解步骤一次，得到胶原蛋白溶液。将胶原蛋白溶液用纯化水透析后，得到胶原蛋白提取液，冷冻、干燥，即得成品。
[0031]经测定，采用本实施例得到的胶原蛋白提取率为68.2%。
[0032]实施例3
(I)预处理
以大鲵的蜕皮为原料，记为原料蜕皮。将原料蜕皮用质量百分比为4.0 %的稀盐酸溶液进行浸泡预处理，然后用原料蜕皮重量8倍的纯化水洗涤浸泡处理后的蜕皮7小时，再将洗涤后的蜕皮绞碎，得到绞碎蜕皮。将绞碎蜕皮与水按重量比1:1混合后，再进行加热处理，加热温度为98-100°C，加热时间为40min，得杀菌清洁的蜕皮。
[0033](2)粗提取
将杀菌清洁蜕皮加入水中，再向其中加入杀菌清洁蜕皮质量0.8%的复合酶，得到第一溶液，调节第一溶液的PH值至6.8，并在45°C下酶解2h，然后升温至118°C以上灭酶，得到胶原蛋白粗提液。其中，杀菌清洁蜕皮与水的质量比为1:6，复合酶采用中性蛋白酶与菠萝蛋白酶混合而成，所述中性蛋白酶与菠萝蛋白酶的质量比为3:7。
[0034](3)脱腥
将步骤2得到的胶原蛋白粗提液降温至60°C后，加入杀菌清洁蜕皮质量3?5%的活性炭，搅拌40min，过滤去除活性炭，得到脱腥提取液。
[0035](4)提取
将脱腥提取液进行离心处理，转速为4500rpm/min,离心时间为2min,得到离心提取液。
[0036](5)胶原蛋白提纯
取步骤4中离心提取液的上清液，向上清液中加入氯化钠进行盐析，至氯化钠为
0.9mol/L为止,完成盐析。盐析后进行4500rpm/min离心15min,收集沉淀,将沉淀用乙酸溶解，Ig沉淀中添加20mL乙酸，完成溶解步骤。再重复前述盐析和溶解步骤一次，得到胶原蛋白溶液。将胶原蛋白溶液用纯化水透析，每天更换透析水3次，透析3天，得到胶原蛋白提取液，冷冻、干燥，即得成品。
[0037]经测定，采用本实施例得到的胶原蛋白提取率为71.0%。
[0038]实施例4
(I)预处理
以大鲵的蜕皮为原料，记为原料蜕皮。将原料蜕皮用质量百分比为3.0 %的稀盐酸溶液进行浸泡预处理，然后用原料蜕皮重量8.5倍的纯化水洗涤浸泡处理后的蜕皮9小时，再将洗涤后的蜕皮绞碎，得到绞碎蜕皮。将绞碎蜕皮与水按重量比1:0.9混合后，再进行加热处理，去除活性酶，加热时间为50min，得杀菌清洁的蜕皮。
[0039](2)粗提取
将杀菌清洁蜕皮加入水中，再向其中加入杀菌清洁蜕皮质量0.8%的复合酶，得到第一溶液，调节第一溶液的PH值至6.6，并在40°C下酶解6h，然后升温至115°C以上灭酶，得到胶原蛋白粗提液。其中，杀菌清洁蜕皮与水的质量比为1:8，复合酶采用中性蛋白酶与菠萝蛋白酶混合而成，所述中性蛋白酶与菠萝蛋白酶的质量比为3:7。
[0040](3)脱腥
将步骤2得到的胶原蛋白粗提液降温后，加入杀菌清洁蜕皮质量4%的活性炭，搅拌60min，过滤去除活性炭，得到脱腥提取液。
[0041](4)提取
将脱腥提取液进行离心处理，转速为5500rpm/min,离心时间为1.5min,得到离心提取液。
[0042](5)胶原蛋白提纯
取步骤4中离心提取液的上清液，向上清液中加入氯盐进行盐析，盐析后进行离心，收集沉淀，将沉淀用乙酸溶解，得到胶原蛋白溶液，将胶原蛋白溶液用纯化水透析后，得到胶原蛋白提取液，冷冻、干燥，即得成品；
向上清液中加入氯盐，至氯盐为0.9mol/L后,静置10-40h,再以3000-6000rpm/min离心10-35min，收集沉淀，将沉淀用乙酸溶解，Ig沉淀中添加20mL乙酸，重复前述盐析和溶解步骤一次，得到胶原蛋白溶液，将胶原蛋白溶液用纯化水透析后，得到胶原蛋白提取液。
[0043]将胶原蛋白溶液用纯化水透析，每天更换透析水3次，透析3天，得到胶原蛋白提取液。
[0044]取步骤4中离心提取液的上清液，向上清液中加入氯化钠进行盐析，完成盐析过程。盐析后进行5000rpm/min离心1min,收集沉淀,将沉淀用乙酸溶解，Ig沉淀中添加20mL乙酸，完成溶解步骤。再重复前述盐析和溶解步骤一次，得到胶原蛋白溶液。将胶原蛋白溶液用纯化水透析，每天更换透析水2次，透析5天，得到胶原蛋白提取液，冷冻、干燥，即得成品O
[0045]经测定，采用本实施例得到的胶原蛋白提取率为69.5%。
[0046]本发明并不局限于前述的【具体实施方式】。本发明扩展到任何在本说明书中披露的新特征或任何新的组合，以及披露的任一新的方法或过程的步骤或任何新的组合。
【权利要求】
1.一种利用大鲵的蜕皮提取胶原蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)预处理 以大鲵的蜕皮为原料，记为原料蜕皮，将原料蜕皮用酸溶液进行浸泡处理，然后经纯化水清洗后，再经杀菌处理，得杀菌清洁蜕皮； (2)粗提取 将杀菌清洁蜕皮加入水中，再向其中加入杀菌清洁蜕皮质量0.4-0.8%的复合酶，得到第一溶液，调节第一溶液的邱值至6.5-7.0，并在40-501下酶解1-61！，然后升温至1001以上灭酶，得到胶原蛋白粗提液； (3)脱腥 将步骤2得到的胶原蛋白粗提液降温后，加入杀菌清洁蜕皮质量3?5%的活性炭，搅拌20-=以上，过滤去除活性炭，得到脱腥提取液； (4)提取 将脱腥提取液进行离心处理，得到离心提取液； (5)胶原蛋白提纯 取步骤4中离心提取液的上清液，向上清液中加入氯盐进行盐析，盐析后进行离心，收集沉淀，将沉淀用乙酸溶解，得到胶原蛋白溶液，将胶原蛋白溶液用纯化水透析后，得到胶原蛋白提取液，冷冻、干燥，即得成品； 所述步骤2中，杀菌清洁蜕皮与水的质量比为1:4-10,复合酶采用中性蛋白酶与菠萝蛋白酶混合而成，所述中性蛋白酶与菠萝蛋白酶的质量比为3:6-8。
2.根据权利要求1所述利用大鲵的蜕皮提取胶原蛋白的方法，其特征在于，所述步骤1中，将原料蜕皮用质量百分比为2.0?5.0%的酸溶液进行浸泡预处理，然后用原料蜕皮重量8?10倍的纯化水洗涤浸泡处理后的蜕皮5?8小时，再将洗涤后的蜕皮绞碎，得到绞碎蜕皮； 将绞碎蜕皮与水按重量比1:0.8?1混合后，再进行加热处理，加热温度为98-1001，加热时间为30-60111111，得杀菌清洁的蜕皮。
3.根据权利要求2所述利用大鲵的蜕皮提取胶原蛋白的方法，其特征在于，所述步骤1中，加热温度为1001，加热时间为40111111。
4.根据权利要求1-3任一项所述利用大鲵的蜕皮提取胶原蛋白的方法，其特征在于，所述步骤2中，杀菌清洁蜕皮与水的质量比为1:6，调节第一溶液的邱值至6.8，并在451下酶解2匕然后升温至1181灭酶15-！！，得到胶原蛋白粗提液。
5.根据权利要求1所述利用大鲵的蜕皮提取胶原蛋白的方法，其特征在于，所述中性蛋白酶与菠萝蛋白酶的质量比为3:7。
6.根据权利要求1-5任一项所述利用大鲵的蜕皮提取胶原蛋白的方法，其特征在于，所述步骤3中，将步骤2得到的胶原蛋白粗提液降温至601后，加入杀菌清洁蜕皮质量3?5%的活性炭，搅拌40111111。
7.根据权利要求1所述利用大鲵的蜕皮提取胶原蛋白的方法，其特征在于，所述步骤4中，将脱腥提取液进行离心处理，转速为3000-600011)111/111111，离心时间为1-5111111，得到离心提取液。
8.根据权利要求1所述利用大鲵的蜕皮提取胶原蛋白的方法，其特征在于，所述氯盐为 NaCl 或 KCl。
9.根据权利要求1-8任一项所述利用大鲵的蜕皮提取胶原蛋白的方法，其特征在于，所述步骤5中，向上清液中加入氯盐,至氯盐为0.9mol/L后,再以3000-6000rpm/min离心10-35min,收集沉淀，将沉淀用乙酸溶解，Ig沉淀中添加20mL乙酸，重复前述盐析和溶解步骤一次，得到胶原蛋白溶液，将胶原蛋白溶液用纯化水透析后，得到胶原蛋白提取液。
10.根据权利要求9所述利用大鲵的蜕皮提取胶原蛋白的方法，其特征在于，所述步骤5中，将胶原蛋白溶液用纯化水透析，每天更换透析水3次，透析3天，得到胶原蛋白提取液。
【文档编号】C07K1/14GK104357522SQ201410630235
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年11月11日 优先权日:2014年11月11日
【发明者】邱平, 阳爱生, 田宇 申请人:四川龙王洞生态农业开发有限公司