一种从Cohn组分I沉淀分离纤维蛋白原的方法
【专利摘要】一种从Cohn组分Ⅰ沉淀分离纤维蛋白原的方法。使用4:3-1:1的柠檬酸三钠-氯化钠溶液作为纤维蛋白原分离的缓冲液，蛋白质分离过程中的温度不高于0℃,使用不低于5%的蔗糖作为冻干保护剂。
【专利说明】一种从Cohn组分I沉淀分离纤维蛋白原的方法
【技术领域】
[0001]本发明专利涉及人纤维蛋白原的分离方法，属于血液制品领域。
【背景技术】
[0002]1、纤维蛋白原
人纤维蛋白原(fibrinogen，Fg)即凝血因子I，是血浆中含量最高的凝血因子，也是凝血系统中的一个"中心"蛋白质；凝血的最后阶段是凝血酶形成，使纤维蛋白原转变为纤维蛋白；纤维蛋白原除直接参与凝血过程外，还可介导血小板聚集，影响血液粘度，是心、脑血管病发病的重要危险因素。
[0003]纤维蛋白原是一种含2964个氨基酸的大分子糖蛋白，相对分子质量为340 X 103，首先在肝细胞中合成，由两个相同的组分(Αα，Ββ，Υ)2组成六聚体，链间以二硫键相连。Αα,Ββ，Y三条多肽链借助AaCys28、Y Cys8和Cys9构成对称性二聚体。单体中Aa Cys36与另一单体Ββ Cys65组成的二硫键对形成二聚体分子也起到关键作用。Aa,Ββ, Y三条多肽链相对分子质量分别为66Χ103、52Χ103和46Χ103，并分别由610个、461个和411个氨基酸残基组成。
[0004]人纤维蛋白原主要由肝脏实质细胞合成，大部分在血浆中，约15%在血管外，正常人血浆含量为2.4-4.0g/L。平均半寿期为96-144小时。贮存稳定性好，热稳定差，在56°C可形成不可逆沉淀，生理止血需要量为正常水平的25%-50%。
[0005]在凝血共同途径中，凝血酶先裂解纤维蛋白原两条A a链氨基端Argl6.Glyl7释放出一对纤维蛋白肽A，形成纤维蛋白单体I ;再裂解纤维蛋白原两条Ββ链氨基端Argl4*Glyl5释放出一对纤维蛋白肽B，形成纤维蛋白单体II，暴露纤维蛋白单体的聚合部位，通过非共价结合，形成了不稳定的可溶性纤维蛋白单体。在活化的凝血因子XIII及Ca2+的作用下，纤维蛋白单体互相交联，生成稳定的可溶性纤维蛋白，并将血液的有形成分包绕其中，形成牢固的血栓。
[0006]2、纤维蛋白原制备技术概述
在血浆的采集、贮运和生产过程中，均可能产生凝血因子的激活，不利于获得稳定的人纤维蛋白原制品。通常，在关键的生产环节、半成品和成品中均要有针对性的检测这类反应。检出激活的方法包括有检验蛋白酶等。
[0007]目前成熟的人纤维蛋白原的分离原料包括有:新鲜冷冻血浆、冷沉淀、人凝血因子珊生产废弃液。常用的人纤维蛋白原的分离方法包括有硫酸钡沉淀法、乙醇沉淀法、离子交换层析法。由于与纤溶酶原(Plasminogen, PLG)有高度亲和性，故常用的分离方法难以获得高纯度的纤维蛋白原。
[0008]如下是几个具有代表性的乙醇沉淀法的技术要领。
[0009]大田华灿生物科技有限公司的发明《专利纤维蛋白原的制备方法》(ZL201110188019.X)以血浆为原料，使用助剂后S/D病毒灭活，然后进行蛋白质分离。分离过程的温度控制较高，达到了 36?38°C。该发明所采用的助剂，能提高纤维蛋白原制品的质量，在病毒灭活和冷乙醇沉降过程中起到保护纤维蛋白原以及凝血因子XIII的生物学活性的作用。
[0010]绿十字(中国)生物制品有限公司的发明专利《人纤维蛋白原的生产方法》(ZL200910237204.6)提供了一种从冷沉淀中提取人纤维蛋白原的方法，生产中采用的S/D法和水浴热处理法双重病毒灭活。生产过程中使用甘氨酸作为稳定剂，通过延长冻干时间约需6-8天，使得产品在冻干过程中温度变化稳定，冻干后产品的结构均一，这时再对制品进行水浴热处理，可以在最短的时间内受热均匀，在达到有效的灭活DNA和RNA非脂包膜病毒的同时保证了人纤维蛋白原的稳定性。该方法的操作温度为20?40°C。通过延长冻干时间来换取了产品的稳定性。
[0011]江西博雅生物制药股份有限公司的发明专利《人纤维蛋白原制剂的制备方法》(ZL200810046747.5)提供了一种从组分沉淀I制作纤维蛋白原的方法。该制备工艺中，使用了低浓度的蔗糖-柠檬酸三钠-氯化钠溶液，最后使用了精氨酸盐酸-柠檬酸三钠-氯化钠作为产品配制过程的保护剂。
[0012]哈尔滨世亨生物工程药业股份有限公司的发明《耐热人纤维蛋白原的生产方法》(CN 200710144516.3)提出了使用4% _6%蔗糖做稳定剂，蛋白质分离过程中的缓冲液一律使用醋酸缓冲液。
[0013]3、现有技术的主要问题
人纤维蛋白原产品的热稳定差，在56°C可形成不可逆沉淀。同时由于生产工艺需要两步法病毒灭活，而产品成型之后的干热病毒灭活是必要的工艺步骤。温度高达100°C，时间也长，为30分钟。为此，选择合适的保护剂品种和使用适当量的保护剂浓度，对于人纤维蛋白原产品的生产来说，是一个关键的因素。
[0014]本发明综合上述的技术优势，研究一种操作简单、管理方便的纤维蛋白原生产工艺。
【发明内容】
[0015]本发明的人纤维蛋白原的生产工艺在生产过程中特别注意了保护剂的使用，经过筛选，选用了不低于5%的蔗糖作为保护剂。在常规的产品冻干工艺中，保护剂的用量为1%-3%。
[0016]生产过程中的乙醇使用:为了减少反应液的体积，组分沉淀的制作使用高浓度(92%-95%)的乙醇，分离纤维蛋白原后的生产中使用低浓度(50%)的乙醇。
[0017]用于纤维蛋白原溶解的缓冲液为一种，不使用醋酸缓冲液,而是使用4:3-1:1的柠檬酸三钠-氯化钠溶液。
[0018]在纤维蛋白原生产的粗分离阶段，使用同一分离方法重复2次。在纤维蛋白原分离过程中，采取0°C以下的工艺温度。不像现有的技术那样，采用20°C以上的工艺温度，虽然不明显的引起蛋白质的变化，但是较高的温度毕竟为蛋白质的不稳定性带来了潜在的影响。
[0019]严格控制工艺温度的变化范围，在生产的一般工艺中的温度波动范围控制为±l°c，而病毒灭活的关键工艺的温度波动范围均为±0.5°C，既保证了产品的工艺要求，又最大限度的保证了产品质量。
[0020]根据上述工艺开发思路，本发明的人纤维蛋白原的制备方法为:
I)原料血浆融化合并，加入乙醇使反应液乙醇浓度为8%，温度控制在-3.5?-2.5°C,蛋白含量控制在40?60g/L，pH 7.0?8.0，后离心分离组分I沉淀。
[0021 ] 2 )组分I沉淀称重后，溶解于10倍?50倍体积的缓冲液I中，按照5g/L的比例加入预处理的硅藻土深滤。(缓冲液I为4:3-1:1的柠檬酸三钠-氯化钠溶液)。
[0022]3)调整澄清液的pH为6.5?7.5，蛋白含量为10?20g/L，计算体积，加入3.3%的TNBP和11%的Tween-80,使其终含量为0.3%和1%，23.5?24.5°C保温6小时。
[0023]4)调整溶液的pH为6.5?7.5，降温，加50%乙醇至反应液乙醇浓度为8%，温度控制在-3?-1°C，离心分离沉淀物，得粗制纤维蛋白原沉淀。
[0024]5)粗制纤维蛋白原沉淀称重后，按沉淀重量加10倍体积的缓冲液I溶解沉淀，力口硅藻土 (按5g/L的比例)澄清过滤。
[0025]6)调整滤液的pH为6.5?7.5，蛋白含量为10?20g/L，降温，加50%乙醇至反应液乙醇浓度为8%，温度控制在-3?-1 °C，离心分离沉淀物，得精制纤维蛋白原沉淀。
[0026]7)精制纤维蛋白原沉淀称重后，按沉淀重量加5倍体积的缓冲液II溶解，澄清过滤，取样进行原液检定。(缓冲液II为8:13:51-9:14:50的氯化钠-柠檬酸三钠-蔗糖溶液)。
[0027]8)配制、除菌过滤、灌装、冻干。
[0028]9)冻干后制品100°C ±0.5°C干热灭活处理30分钟；成品检验合格后包装。
[0029]本发明的纤维蛋白原的制备方法，其原料可以是原料血浆、Cohn组分沉淀及其他含有纤维蛋白原的废弃沉淀。
【具体实施方式】
[0030]下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0031 ] 实施例1:以原料血浆分离纤维蛋白原
I)原料血浆融化合并，加入乙醇使反应液乙醇浓度为8%，温度控制在-3.5?-2.5°C,蛋白含量控制在40?60g/L，pH 7.0?8.0，后离心分离组分I沉淀。
[0032]2)组分I沉淀称重后，溶解于30倍体积的缓冲液I中，按照5g/L的比例加入预处理的硅藻土过滤。(缓冲液I为4:3-1:1的柠檬酸三钠-氯化钠溶液)。
[0033]3)调整澄清液的pH为6.5?7.5，蛋白含量为10?20g/L，计算体积，加入3.3%的TNBP和11%的Tween-80,使其终含量为0.3%和1%，23.5?24.5°C保温6小时。
[0034]4)调整溶液的pH为6.5?7.5，降温，加50%乙醇至反应液乙醇浓度为8%，温度控制在-3?-1°C，离心分离沉淀物，得粗制纤维蛋白原沉淀。
[0035]5)粗制纤维蛋白原沉淀称重后，按沉淀重量加15倍体积的缓冲液I溶解沉淀，力口硅藻土 (按5g/L的比例)澄清过滤。
[0036]6)调整滤液的pH为6.5?7.5，蛋白含量为10?20g/L，降温，加50%乙醇至反应液乙醇浓度为8%，温度控制在-3?-1 °C，离心分离沉淀物，得精制纤维蛋白原沉淀。
[0037]7)精制纤维蛋白原沉淀称重后，按沉淀重量加5倍体积的缓冲液II溶解，澄清过滤，取样进行原液检定。(缓冲液II为8:13:51-9:14:50的氯化钠-柠檬酸三钠-蔗糖溶液)。
[0038]8)配制、除菌过滤、灌装、冻干。
[0039]9)冻干后制品100°C ±0.5°C干热灭活处理30分钟；成品检验合格后包装。
[0040]实施例2:以Cohn组分沉淀或废弃沉淀为原料分离纤维蛋白原
DCohn组分沉淀或废弃沉淀称重后，溶解于40倍体积的缓冲液I中，按照5g/L的比例加入预处理的硅藻土过滤。(缓冲液I为4:3-1:1的柠檬酸三钠-氯化钠溶液)。
[0041]2)调整澄清液的pH为6.5?7.5，蛋白含量为10?20g/L，计算体积，加入3.3%的TNBP和11%的Tween-80,使其终含量为0.3%和1%，23.5?24.5°C保温6小时。
[0042]3)调整溶液的pH为6.5?7.5，降温，加50%乙醇至反应液乙醇浓度为8%，温度控制在-3?-1°C，离心分离沉淀物，得粗制纤维蛋白原沉淀。
[0043]4)粗制纤维蛋白原沉淀称重后，按沉淀重量加30倍体积的缓冲液I溶解沉淀，加硅藻土 (按5g/L的比例)澄清过滤。
[0044]5)调整滤液的pH为6.5?7.5，蛋白含量为10?20g/L，降温，加50%乙醇至反应液乙醇浓度为8%，温度控制在-3?-1 °C，离心分离沉淀物，得精制纤维蛋白原沉淀。
[0045]6)精制纤维蛋白原沉淀称重后，按沉淀重量加5倍体积的缓冲液II溶解，澄清过滤，取样进行原液检定。(缓冲液II为8:13:51-9:14:50的氯化钠-柠檬酸三钠-蔗糖溶液)。
[0046]7)配制、除菌过滤、灌装、冻干。
[0047]8)冻干后制品100°C ±0.5°C干热灭活处理30分钟；成品检验合格后包装。
【权利要求】
1.一种从Cohn组分I沉淀分离纤维蛋白原的方法，其特征在于其分离过程为: 1)原料血浆融化合并，加入乙醇使反应液乙醇浓度为8%，温度控制在-3.5?-2.5°C,蛋白含量控制在40?60g/L，pH 7.0?8.0，后离心分离组分I沉淀； 2)组分I沉淀称重后，溶解于10倍?50倍体积的缓冲液I中，按照5g/L的比例加入预处理的硅藻土过滤；(缓冲液I为4:3-1:1的柠檬酸三钠-氯化钠溶液)； 3)调整澄清液的pH为6.5?7.5，蛋白含量为10?20g/L，计算体积，加入3.3%的TNBP (磷酸三丁酯)和11%的Tween-80,使其终含量为0.3%和1%，23.5?24.5°C保温6小时； 4)调整溶液的pH为6.5?7.5，降温，加50%乙醇至反应液乙醇浓度为8%，温度控制在-3?-1°C，离心分离沉淀物，得粗制纤维蛋白原沉淀； 5)粗制纤维蛋白原沉淀称重后，按沉淀重量加10倍体积的缓冲液I溶解沉淀，加硅藻土 (按5g/L的比例)澄清过滤； 6)调整滤液的pH为6.5?7.5，蛋白含量为10?20g/L，降温，加50%乙醇至反应液乙醇浓度为8%，温度控制在-3?-1 °C，离心分离沉淀物，得精制纤维蛋白原沉淀； 7)精制纤维蛋白原沉淀称重后，按沉淀重量加5倍体积的缓冲液II溶解，澄清过滤，取样进行原液检定；(缓冲液II为8:13:51-9:14:50的氯化钠-柠檬酸三钠-蔗糖溶液)； 8)配制、除菌过滤、灌装、冻干； 9)冻干后制品100°C±0.5°C干热灭活处理30分钟；成品检验合格后包装。
2.根据权利要求1所述的一种从Cohn组分I沉淀分离纤维蛋白原的方法，其特征在于纤维蛋白原分离工艺的特点为，在组分沉淀分离阶段的所用乙醇浓度为92?95%，在蛋白质分离、精制阶段所用乙醇浓度为50%。
3.根据权利要求1所述的一种从Cohn组分I沉淀分离纤维蛋白原的方法，其特征在于纤维蛋白原的分离工艺中，除了温度要求较高的工艺步骤外，组分沉淀分离及蛋白质精制纯化的工艺温度控制在0°c以下，优选为-3V?-l°c。
4.根据权利要求3所述的一种从Cohn组分I沉淀分离纤维蛋白原的方法，纤维蛋白原分离使用的缓冲液为使用4:3-1:1的柠檬酸三钠-氯化钠溶液,优选为4:3的柠檬酸三钠-氯化钠溶液。
【文档编号】C07K14/75GK104387466SQ201410629847
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年11月11日 优先权日:2014年11月11日
【发明者】张庭喜, 孔维权, 王连群, 侯彩霞, 石正国 申请人:贵州中泰生物科技有限公司