专利名称：淡紫拟青霉的液体发酵培养方法
技术领域：
本发明涉及一种真菌的液体发酵培养方法，尤其涉及淡紫拟青霉(P. Iilacinus) 的液体发酵培养方法，属于淡紫拟青霉的液体发酵培养领域。
背景技术：
淡紫拟青霉(P. Iilacinus)属半知菌纲、丝孢菌目、丝孢菌科、拟青霉属，广泛分布于世界各地，具有功效高、寄主广、易培养等优点。淡紫拟青霉是目前防治植物寄生线虫的主要天敌真菌之一，极具研究和开发价值。淡紫拟青霉是南方根结线虫与白色胞囊线虫卵的有效寄生菌，对南方根结线虫的卵寄生率高达60% -70%。对多种线虫都有防治效能， 其寄主有根结线虫、胞囊线虫、金色线虫、异皮线虫、甚至人畜肠道蛔虫，是防治根结线虫的生防制剂。淡紫拟青霉也能分泌毒素对线虫起毒杀作用。此外，还有部分淡紫拟青霉对植物病原菌具有拮抗效能。在淡紫拟青霉的培养过程中，尤其是在液体深层发酵过程中，淡紫拟青霉能分泌大量的对线虫起杀毒作用的毒素(CAYREL JC. et al. Study of the nematocidal properties of the culture filtrate of thenematophagous fungus Paecliomyces lilacimus(J). RevudedNematologie. 1989. 12 :331-336)。现有的淡紫拟青霉的发酵培养和发酵工艺的研究还很不成熟，存在着许多急需解决的问题，例如，随着培养基的组成、碳源、氮源、C/N和湿度、光照、温度等因子的改变而诱发的菌株变异问题，导致菌丝生长速度加快但产孢量下降，其生防效果也随之下降。采取合理的发酵培养基质和发酵工艺，不但可以有效解决菌株变异问题，对于提高孢子产率进而实现规模化生产也十分重要。因此，为了提高液体发酵中淡紫拟青霉的孢子产量，需要对发酵培养基的组成及液体发酵条件等工艺参数进行优化和筛选以最大限度的提高淡紫拟青霉的孢子产量。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，以产孢量为考核指标，对淡紫拟青霉的液体发酵培养过程中的C、N源营养需求，培养温度，PH值条件，溶氧状况等条件进行优化或考察，获得液体发酵培养基的最佳组成或最适宜的发酵条件，有效提高淡紫拟青霉的孢子产量、降低生产成本低，为大规模杀线菌剂的研制和规模化生产提供技术支撑。本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的—种淡紫拟青霉的液体发酵培养方法，包括制备淡紫拟青霉孢子悬浮液；制备淡紫拟青霉的液体发酵培养基；向液体发酵培养基中接种淡紫拟青霉孢子悬浮液，发酵培养，即得；其中，所述的液体发酵培养基的组成成分包括碳源和氮源；所述的碳源包括但不限于葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉或玉米粉中的任一种或多种，优选为葡萄糖、可溶性淀粉或玉米粉，更优选为葡萄糖；其中，所述碳源的用量优选为40. Og/L。所述的氮源包括但不限于硝酸钠、硫酸铵、蛋白胨或黄豆粉中的任一种或多种；优选为硝酸钠、硫酸铵或黄豆粉中的一种或多种；更优选的，所述氮源由硝酸钠、硫酸铵和黄豆粉组成；所述氮源的用量优选为10. 0-20. Og/L ；其中，NaNO3的用量优选为5. 0-10. Og/ L，进一步优选为5. 0-6. Og/L，更优选为5. Og/L ； (NH4)2SO4的用量优选为2. 5-5. Og/L，进一步优选为2. 5-2. 8g/L，更优选为2. 5g/L ；黄豆粉的用量优选为2. 5-5. Og/L，进一步优选为 2. 5-2. 8g/L，更优选为 2. 5g/L。为了达到更好的技术效果，所述液体发酵培养基中还可含有无机盐；其中，所述的无机盐包括但不限于磷酸二氢钾或七水硫酸镁；所述无机盐的用量优选为0. 5-1. 5g/L，更优选为1. 5g/L。本发明通过大量的实验发现，液体发酵培养基的初始PH值对于淡紫拟青霉的孢子产量有着非常显著的影响，当液体发酵培养基的初始PH值为3-9时均能产孢；本发明通过进一步的实验发现，液体发酵培养基的初始PH值在5. 0-7. 0，尤其当初始pH值为 5. 0-5. 5时，淡紫拟青霉的孢子产量相对较高；当液体发酵培养基的初始pH值是5. 0时，淡紫拟青霉的产孢量达到最高，相比于其它PH值的产孢量有显著性差异。淡紫拟青霉对氧的需求有一定的限制，本发明人通过进一步的实验发现，液体培养基在摇瓶中的装液量对于孢子产量也有一定的影响，摇瓶装量对产孢量有显著影响，在发酵过程中，装量应控制在合适的范围内，装量过低、过高不但不适合产孢而且还会造成资源的浪费。500mL的摇瓶中培养基的装量为IOOmL和200mL时较适合产孢，装量在50mL时产孢量较低，装量在300mL和400mL时产孢量也显著降低，最终，本发明通过试验发现液体培养基的摇瓶装量为200mL(500mL的摇瓶)(占摇瓶体积的40% (ν/ν))时，产孢子量为最尚ο孢子悬液的接种量对产孢量也有一定影响，本发明发现当接种量相对较低时，增加接种量产孢量明显增加，当接种量由1. 0%增加至2. 0%时，产孢量增加近1倍，而当接种量由3. 0%增加至5. 0%时，产孢量增长趋势相对减弱。因此，在发酵过程中选择3. 0% 5. 0%的接种量，尤其为4. 5% 5. 0%的接种量较为适宜，最有利于提高孢子产量。淡紫拟青霉在-30°C范围内均能生长产孢，但随着温度的升高，产孢高峰出现的时间相应推迟，所以温度过低或过高均不适宜孢子的产生。本发明通过试验发现，在发酵培养中，发酵培养温度为25°C _27°C较适宜产孢，进一步的试验发现，当发酵培养温度为 260C时最适宜产孢，在此温度下进行发酵培养产孢量接近60 X IO7个/ml。此外，本发明人通过试验发现，在发酵培养过程转速的高低对产孢量有非常显著的影响。本发明通过优化试验发现，摇床转速为80-250r/min时都可产孢。为了摸索出最适宜的转速条件以最大限度的提高孢子产量，本发明对转速进行了反复优选，最终发现当摇床转速为180-M0r/min时较为适宜产孢，进一步的试验发现，当摇床转速为220r/min时， 产孢量达到最高。本发明对淡紫拟青霉的发酵培养的各工艺参数，包括培养基的组成成分和用量、 培养基的初始PH值、孢子悬液的接种量、发酵培养的温度和转速等，进行了筛选和优化，最终摸索出了最适宜产孢的各工艺参数，本发明发酵培养方法孢子产量高、生产成本相对较低。
图1基础培养基试验各组产孢量比较结果。图2基础培养基试验各组生物量比较结果。图3试验各组发酵终点PH值比较结果。图4复合培养基条件下产孢量结果。图5无机盐对产孢量的影响。图6摇瓶装量对产孢量的影响。图7接种量对产孢量的影响。图8温度对产孢量的影响。
具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实验例淡紫拟青霉液体发酵培养各工艺参数的优化筛选实验1、实验方法1. 1基础培养基的选项1. 1. 1 菌种淡紫拟青霉(P. Iilacinus)菌株购自中国林业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号为:cfcc 86080。1.1.2 材料C源葡萄糖，蔗糖，麦芽糖，可溶性淀粉，玉米粉；N源硝酸钠，硫酸铵，蛋白胨，黄豆粉；无机盐磷酸二氢钾，硫酸镁；1.1.3 方法培养基组合对以上碳源，氮源进行全排列组合，组成20种培养配方(见表1)。培养基配比(克/升，g/L)碳源40，氮源20，无机盐0. 5。菌种制备取15mL质量浓度为0. 005g/L的吐温80倒入经PDA培养5d的淡紫拟青霉平板中，用无菌水洗下孢子，振荡，混勻制成孢子悬浮液。培养条件500mL三角瓶中装入培养基200mL，121 °C湿热灭菌30min，冷却至室温， 用体积浓度为0. 5mol/L的HCl和NaOH调节初始pH值为6. 0。在无菌条件下，接种孢子悬浮液，接种量为2% (ν/ν)，置25°C摇床160r/min培养，每处理设3次重复。表1 20组培养基C、N源配合
权利要求
1.一种淡紫拟青霉(p. Hlacinus)的液体发酵培养方法，包括制备淡紫拟青霉孢子悬浮液；制备淡紫拟青霉的液体发酵培养基；向液体发酵培养基中接种淡紫拟青霉孢子悬浮液，发酵培养；其特征在于所述的液体发酵培养基的组成成分包括碳源和氮源；所述的碳源选自葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉或玉米粉中的任一种或多种；所述的氮源选自硝酸钠、硫酸铵、蛋白胨或黄豆粉中的任一种或多种。
2.按照权利要求1所述的液体发酵培养方法，其特征在于所述的碳源是葡萄糖；所述氮源由硝酸钠、硫酸铵和黄豆粉组成。
3.按照权利要求1或2所述的液体发酵培养方法，其特征在于所述碳源的用量为 40. 0 g/L ；所述氮源的用量为10. 0-20. Og/L。
4.按照权利要求2所述的液体发酵培养方法，其特征在于所述NaNO3的用量为 5. 0-10.0 g/L，优选为 5.0-6. 0 g/L ；所述(NH4) 2S04 的用量为 2. 5_5. Og/L，优选为 2. 5-2. 8 g/L ；所述黄豆粉的用量为2. 5-5. 0 g/L，优选为2. 5-2. 8g/L。
5.按照权利要求1-4任何一项所述的液体发酵培养方法，其特征在于所述液体发酵培养基中含有无机盐。
6.按照权利要求5所述的液体发酵培养方法，其特征在于所述的无机盐是磷酸二氢钾或七水硫酸镁；优选的，所述无机盐的用量为0. 5-1. 5 g/L。
7.按照权利要求1所述的液体发酵培养方法，其特征在于将液体发酵培养基的初始 PH值调为5. 0-7. 0后接种淡紫拟青霉孢子悬浮液进行发酵培养；优选的，将液体发酵培养基的初始PH值调为5. 0-5. 5后接种淡紫拟青霉孢子悬浮液进行发酵培养；更优选的，将液体发酵培养基的初始PH值调为5. 0后接种淡紫拟青霉孢子悬浮液进行发酵培养。
8.按照权利要求1所述的液体发酵培养方法，其特征在于按ν/ν计，液体发酵培养基在摇瓶中的装液体积占摇瓶体积的40%。
9.按照权利要求1所述的液体发酵培养方法，其特征在于按ν/ν计，所述的接种量为 3. 0% -5. 0%，优选为 4. 5% -5. 0%。
10.按照权利要求1所述的液体发酵培养方法，其特征在于所述的发酵培养条件为 发酵温度为-30°C，优选为25°C _27°C，更优选为；摇床转速为80-250 r/min，优选为 180-240 r/min，更优选为 220 r/min。
全文摘要
本发明公开了一种淡紫拟青霉的液体发酵培养方法，包括制备淡紫拟青霉孢子悬浮液；制备淡紫拟青霉的液体发酵培养基；向液体发酵培养基中接种淡紫拟青霉孢子悬浮液，发酵培养；所述液体发酵培养基的组成成分包括碳源和氮源；所述的碳源选自葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉或玉米粉中的任一种或多种；所述的氮源选自硝酸钠、硫酸铵、蛋白胨或黄豆粉中的任一种或多种。本发明对淡紫拟青霉的发酵培养的各工艺参数，包括培养基的组成成分和用量、培养基的初始pH值、孢子悬液的接种量、发酵培养的温度和转速等进行了筛选和优化，获得了最适宜产孢的各工艺参数。本发明发酵培养方法孢子产量高、生产成本相对较低，适用于规模化生产淡紫拟青霉菌剂。
文档编号C12N3/00GK102286421SQ201110274968
公开日2011年12月21日 申请日期2011年9月16日 优先权日2011年9月16日
发明者刘春秀, 朴春根, 李永, 林彩丽, 汪来发, 王曦茁, 田国忠, 郭民伟 申请人:中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所