专利名称：:扩张青霉菌株及其培养方法与应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及青霉菌株及其培养方法与应用，尤其涉及一种扩张青霉菌株及其培养方法与在生产低聚半乳糖中的应用。技术背景低聚半乳糖(Galacto-oligosaccharides，G0S)是一种非消化类寡糖，具有许多有益的生理功能，可作为双歧杆菌增殖因子，在降低肠道梭菌数量、产生较多短链脂肪酸和较少气体等方面都具有突出的优点。该类寡糖可通过微生物产生的P-半乳糖苷酶以乳糖为底物转糖基合成获得，制备方式有两种，一种是采用游离酶，另一种是采用固定化酶。游离酶在反应过程中不稳定，并且难以重复利用，不适合工业化生产，而固定化酶能有效提高酶的稳定性，可重复利用，适合于工业化生产。但不同来源的P-半乳糖苷酶固定化后的稳定性存在差异，如一些细菌来源的酶固定化后的稳定性较差，使用批次较少。因而迫切需要寻求适合于利用固定化酶技术生产低聚半乳糖的优良菌株，提升固定化酶的使用批次，降低了工业化生产低聚半乳糖的成本。
发明内容本发明针对现有技术的不足，提供一种适合于利用固定化酶技术生产低聚半乳糖的扩张青霉F3(PenicilliumexpansumF3)及其培养方法。[0004]发明概述本发明的要点是提供扩张青霉F3的菌株、特征、培养方法及其应用于固定化酶生产低聚半乳糖的方法。经文献检索，目前国际上没有扩张青霉应用于合成低聚半乳糖的报道。发明详述本发明提供的扩张青霉F3(PenicilliumexpansumF3)菌株已于2008年1月21日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.2352。[0008]扩张青霉F3菌株，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCCNo.2352。该扩张青霉F3菌株在马铃薯培养基上生长23天，产生大量的绿色孢子群，菌落铺展；在查氏培养基上菌落生长迅速，23天产生大量绿色孢子群，1214天直径56厘米，厚12毫米，有放射状沟纹，边缘白色，孢子很多，橄榄绿色，生长后期呈淡粉色，渗出液较少，无特殊气味，反面亮黄色至红褐色。分生孢子梗光滑，帚状分枝不对称，分生孢子成链状生于小梗上，分生孢子椭球形。该扩张青霉F3菌株的18SrDNA在GenBank的登录号为DQ266450，在进化关系上与扩张青霉最接近。[0010]—种扩张青霉F3菌株的培养方法，具体步骤如下(1)取菌种保藏编号为CGMCCNo.2352的扩张青霉F3菌株，将该菌株接种至新鲜斜面培养基活化4050小时，温度为283(TC，取活化后的扩张青霉F3接种于种子培养液，培养30小时，培养温度为2830°C，得初级培养液；(2)取步骤(1)制得的初级培养液，按1%(v/v)接种量转接于产酶发酵培养液并置于摇床培养4042小时，培养温度为283(TC，摇床转速为180转/分。所述步骤(1)中斜面培养基成分如下葡萄糖3-7g/L，蛋白胨3-7g/L，酵母粉3-7g/L，琼脂18-22g/L。所述步骤(1)中种子培养液成分如下葡萄糖3-7g/L，蛋白胨3-7g/L，酵母粉3_7g/L。所述步骤(1)中产酶发酵培养液成分如下葡萄糖8-12g/L，蛋白胨8-12g/L，酵母粉8-12g/L，氯化钠1-5g/L。上述斜面培养基、种子培养液和产酶发酵培养液pH无须调整，使用前都在115°C高温下灭菌30分钟。优选的，所述培养温度为28°C。优选的，所述产酶发酵培养液中的培养时间为40小时。优选的，所述斜面培养基成分为葡萄糖5g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉5g/L，琼脂20g/L，pH自然。优选的，所述种子培养液成分为葡萄糖5g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉5g/L，pH自然。优选的，所述产酶发酵培养液成分为葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉10g/L，氯化钠3g/L，pH自然。—种扩张青霉F3菌株应用于生产低聚半乳糖。所述的扩张青霉F3菌株应用于生产低聚半乳糖的方法，先利用扩张青霉F3菌株制备低聚半乳糖生产用固定化酶，再利用该固定化酶生产低聚半乳糖，具体步骤如下(1)将产酶发酵培养液培养后的扩张青霉F3抽滤，获得菌细胞；(2)将菌细胞按质量体积比1:1的比例悬浮于pH6.4、50mM的磷酸缓冲液中，进行冻融处理；(3)将步骤(2)冻融处理后的细胞悬液与3%(w/w)海藻酸钠溶液以质量体积比1:2的比例充分混合，滴入3%(w/w)氯化钙溶液中，在4t:硬化，即得低聚半乳糖生产用固定化酶；(4)将低聚半乳糖生产用固定化酶按质量体积比1:2的比例与浓度为350g/L400g/L的乳糖溶液混合，5(TC反应3036小时，将溶液倾出，即获得低聚半乳糖溶液，通过高效液相色谱分析低聚半乳糖产量；将固定化酶置于新的浓度为350g/L400g/L乳糖溶液中，在相同的反应条件下重新合成低聚半乳糖并分析低聚半乳糖产量。优选的，所述步骤(4)中，乳糖溶液浓度为380g/L。优选的，所述步骤(4)中，反应时间为30小时。以上操作步骤如无特别说明，均采用本领域常规操作方法，其中扩张青霉F3菌株制备固定化酶生产低聚半乳糖的方法中，步骤(2)可优选公开号为CN1737132A中公开的通过冻融方式处理菌细胞的操作方法。本发明菌株扩张青霉(Penicilliume邓ans咖)F3培养简单，遗传性质稳定，以该菌株的冻融全细胞作为酶源、采用海藻酸钙包埋法制得的固定化酶十分稳定，可重复用于低聚半乳糖合成，反应11批次保持产量大于20%，具有很强的工业化生产优势和广阔的应4用前景。具体实施方式下面结合实施例对本发明做进一步阐述，但本发明所保护范围不仅限于此。实施例1:扩张青霉F3菌株，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCCNo.2352。(1)形态学特征观察用接种环挑取扩张青霉F3CGMCCNo.2352孢子分别接到马铃薯培养基(PDA)平板和查氏培养基平板上，置3(TC培养。在PDA平板上，23天，产生大量的绿色孢子群，菌落铺展；在查氏平板上，菌落生长迅速，1214天直径56厘米，厚12毫米，有放射状沟纹，边缘白色，孢子很多，橄榄绿色，生长后期呈淡粉色，渗出液较少，无特殊气味，反面亮黄色至红褐色。分生孢子梗光滑，帚状分枝不对称，分生孢子成链状生于小梗上，分生孢子椭球形。上述马铃薯培养基成分是马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂1520g/L，pH自然。马铃薯去皮，切成块煮沸30分钟，然后用纱布过滤，再加糖及琼脂，溶化后补足水至1L，115。C灭菌30分钟。上述查氏培养基成分是NaN032g/L，K2HP04lg/L，KC10.5g/L，MgS040.5g/L，FeS040.01g/L，蔗糖30g/L，琼脂1520g/L，水1L，pH自然，115。C灭菌30分钟。(2)18SrDNA序列测定和分析采用基因组提取试剂盒(BioFlux)提取扩张青霉(Penicilliumexpans咖)F3基因组DNA，采用真菌18SrDNA通用上游引物NSl(5'-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3')和下游引物FS2(5，-TAGGNATTCCTCGTTGAAGA-3，)以基因组DNA为模板PCR扩增18SrDNA序列。PCR反应体系50iiL:10XPCRbuffer5iiL，25mmol/LMgCl23iiL，2.5mmol/LdNTP混合物4iiL，20iimol/L引物各lyL，模板liiL，rTaq酶1yL，无菌水35yL。PCR扩增条件94。C预变性5分钟；94。C变性30秒，5(TC退火30秒，72。C延伸2分钟，30个循环；72。C延伸10分钟。所获得的扩增产物由上海英骏生物技术有限公司进行序列测定，大小为1552碱基，将该序列于NCBI网站进行BLAST核苷酸比对分析，与一株扩张青霉的18SrDNA序列(GenBankNo.AB028137)同源性为99%。扩张青霉菌F3CGMCCNo.235218SrDNA的GenBank登录号为DQ266450。实施例2:—种扩张青霉F3菌株的培养方法，具体步骤如下取扩张青霉F3(菌种保减号CGMCCNo.2352)接种至新鲜斜面培养基活化48小时，温度为28°C，取活化后的扩张青霉F3接种于5mL种子培养液，培养30小时后转接于500mL产酶发酵培养液中扩大培养40小时，培养温度为2『C，摇床转速为180转/分。扩张青霉F3CGMCCNo.2352在上述培养基中生长产酶良好。该斜面培养基成分葡萄糖5g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉5g/L，琼脂20g/L，pH自然，115。C灭菌30分钟。该种子培养液成分葡萄糖5g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉5g/L，pH自然，115"C灭菌530分钟。该产酶发酵培养液成分葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉10g/L，氯化钠3g/L，pH自然，115。C灭菌30分钟。稳定性实验表明，该菌株具有非常高的稳定性，数代后产酶能力没有降低。实施例3:—种扩张青霉F3菌株制备固定化酶生产低聚半乳糖的方法，具体步骤如下采用实施例2所述方法培养扩张青霉F3(菌种保藏号CGMCCNo.2352)，抽虑获得菌细胞，将菌细胞按w:v=l:1的比例悬浮于pH6.4、50mM的磷酸缓冲液，于-2(TC以下完全冷冻后，置室温解冻，再重复冻融2次，所得细胞悬液作为P-半乳糖苷酶酶源；取冻融后的细胞悬液，采用海藻酸钙包埋法进行固定化，将菌悬液与3%(w/w)海藻酸钠溶液以w:v=i:2的比例充分混合，滴入3%(w/w)氯化钙溶液中，于4t:硬化后即制得固定化酶。将固定化酶按w:v=l:2的比例与380g/L乳糖溶液混合，5(TC反应30小时，将溶液倾出，即获得低聚半乳糖溶液，通过高效液相色谱分析低聚半乳糖产量。将固定化酶置于新的380g/L的乳糖溶液中，在相同的反应条件下重新合成低聚半乳糖并分析产量，反应进行11批次后低聚半乳糖的产量为20.03%(w/w)，表1为固定化酶催化的各个反应批次的低聚半乳糖产量。表1、固定化酶催化的各个反应批次的低聚半乳糖(GOS)产量<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>权利要求扩张青霉F3(PenicilliumexpansumF3)，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCCNo.2352。2.—种如权利要求1所述的扩张青霉F3菌株的培养方法，其特征在于，具体步骤如下(1)取菌种保藏编号为CGMCCNo.2352的扩张青霉F3菌株，将该菌株接种至新鲜斜面培养基活化4050小时，温度为283(TC，取活化后的扩张青霉F3接种于种子培养液，培养30小时，培养温度为283(TC，得初级培养液；其中，斜面培养基成分如下葡萄糖3-7g/L，蛋白胨3-7g/L，酵母粉3-7g/L，琼脂18-22g/L;种子培养液成分如下葡萄糖3-7g/L，蛋白胨3-7g/L，酵母粉3-7g/L;(2)取步骤(1)制得的初级培养液，按1%(v/v)接种量转接于产酶发酵培养液并置于摇床培养4042小时，培养温度为2830°C，摇床转速为180转/分；其中，产酶发酵培养液成分如下葡萄糖8-12g/L，蛋白胨8-12g/L，酵母粉8-12g/L，氯化钠l-5g/L。3.如权利要求1所述的扩张青霉F3菌株在生产低聚半乳糖中的应用。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，先利用扩张青霉F3菌株制备低聚半乳糖生产用固定化酶，再利用该固定化酶生产低聚半乳糖，具体步骤如下(1)将产酶发酵培养液培养后的扩张青霉F3抽滤，获得菌细胞；(2)将菌细胞按质量体积比1:1的比例悬浮于pH6.4、50mM的磷酸缓冲液中，进行冻融处理；(3)将步骤(2)冻融处理后的细胞悬液与3%(w/w)海藻酸钠溶液以质量体积比1:2的比例充分混合，滴入3%(w/w)氯化钙溶液中，在4t:硬化，即得低聚半乳糖生产用固定化酶；(4)将低聚半乳糖生产用固定化酶按质量体积比1:2的比例与浓度为350g/L400g/L的乳糖溶液混合，5(TC反应3036小时，将溶液倾出，即获得低聚半乳糖溶液，通过高效液相色谱分析低聚半乳糖产量；将固定化酶置于新的浓度为350g/L400g/L乳糖溶液中，在相同的反应条件下重新合成低聚半乳糖并分析低聚半乳糖产量。5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述步骤(4)中，乳糖溶液浓度为380g/L。6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述步骤(4)中，反应时间为30小时。专利摘要本发明公开了一株扩张青霉F3(PenicilliumexpansumF3)及其在制备低聚半乳糖中的应用。该菌株保藏编号为CGMCCNo.2352，其菌落生长迅速，有放射沟纹，橄榄绿色，生长后期呈淡粉色；分生孢子梗光滑，帚状分枝不对称，分生孢子成链状生于小梗上，分生孢子椭球形。以该菌株的冻融全细胞作为酶源、采用海藻酸钙包埋法制得的固定化酶十分稳定，可重复用于低聚半乳糖合成，反应11批次保持产量大于20％。本发明菌株培养简单，遗传性质稳定，制备固定化酶的方法简便且酶性质稳定，应用于工业化生产低聚半乳糖的优势显著，前景乐观。文档编号C12N11/04GKCN101250484B发布类型授权专利申请号CN200810014906公开日2010年6月9日申请日期2008年3月31日发明者卢丽丽,李正义,李玉梅,肖敏申请人:山东大学导出引文BiBTeX,EndNote,RefMan专利引用(1),非专利引用(3),