专利名称：抗ercc1单克隆抗体2e12及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及可特异性结合切除修复交叉互补基因I (excision repaircross-compIement-action group 1,ERCC1)蛋白的单克隆抗体,产生所述单克隆抗体的杂交瘤，包含所述单克隆抗体的组合物，以及所述单克隆抗体的使用方法和用途。
背景技术：
恶性肿瘤是严重威胁人类健康的疾病之一，钼类药物参与的化疗是其重要的治疗手段。以顺钼为代表的钼类药物是20世纪60年代开发的高效广谱的无机抗肿瘤药，属于破坏DNA结构和功能的细胞毒药物，经过长期研究发展，已相继成功开发了顺钼(cisplatin)、卡钼(Carboplatin)、奈达钼(Nedaplatin)、奥沙利钼(Oxaliplatin)、舒钼(Sunpla)和洛钼(Lobaplatin)，常与其他抗肿瘤药物联合使用，用于卵巢癌、肺癌、胃癌、宫颈癌、头颈部癌、恶性淋巴瘤等多种癌症的临床治疗。但肿瘤对钼类药物的耐药性严重影 响了其治疗的疗效，耐药的原因很多，其中DNA损伤修复能力增强是导致钼类耐药的主要原因。人体DNA受各种因素损伤后，其修复主要是通过核苷酸切除修复(Nueleotideexcision repair,NER)途径来完成。其中起到重要作用的核苷酸ERCC基因家族能对核苷酸进行切除和修复以减少DNA的损伤。其中，切除修复交叉互补基因I (excision repaircross-complement-action group 1,ERCC1)参与DNA链的损伤识别和切割，在NER过程中起着至关重要的作用，是ERCC基因家族和NER途径的关键基因。有研究显示，ERCCl过表达可使损伤DNA迅速修复，导致顺钼耐药，NER过程增强是导致顺钼耐药的一个重要机制。2010年NCCN指南指出，ERCCl可以作为非小细胞肺癌(NSCLC)的预后判断和疗效预测标记物。一方面，与ERCCl低水平相比，ERCCl高水平预示NSCLC患者生存效果更佳(与治疗无关)，同时ERCCl高水平预示含钼类药物化疗效果不佳。研究显示，在完全切除的、未接受过围手术期化疗或放疗的NSCLC患者中，ERCClmRNA水平是生存预后指标，研究显示，高表达的患者生存期显著长于低表达者。另一方面，已有多项转化型研究证明，ERCCl水平可用于预测含钼化疗治疗NSCLC的疗效，高水平者耐药，低水平者敏感。Olaussen等发现，在国际癌辅助化疗研究(IALT)中，仅肿瘤ERCCl蛋白低表达者可从含顺钼辅助化疗中获益。Bepler等报道，前瞻性采集自一项基于社区的III期随机临床研究的肿瘤标本中，其原位ERCCl蛋白表达水平与卡钼/吉西他滨或吉西他滨单药治疗后疾病缓解成显著负相关，即ERCCl低表达者缓解率更高。因此目前临床上在进行肿瘤辅助化疗之前，通常通过免疫组织化学(IHC)病理实验确定肿瘤细胞中ERCCl的表达水平，进而起到指导含钼类化疗药物使用的目的。IHC实验的核心为特异性结合ERCCl的单克隆抗体，当前国内外广泛用于临床病理一线的ERCCl单抗为8F1，但研究显示，8F1在与ERCCl特异结合的同时，还与非特异蛋白发生交叉反应，直接影响了免疫组化结果的特异性。因此，本领域迫切需要这样的单克隆抗体，其不仅可与ERCCl特异性结合，而且与细胞内的其他非特异蛋白不发生交叉反应，以显著提高IHC实验的特异性和可靠性，从而更有效和更精确地用于非小细胞肺癌、卵巣癌等肿瘤的预后判断，实现对使用钼类化疗药物的辅助化疗进行疗效预測。
发明内容
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。如本文中所使用的，术语“切除修复交叉互补基因I (ERCCl) ”是本领域内熟知的，其是ERCC基因家族和NER途径的关键基因，參与DNA链的损伤识别和切割，在NER途径中起着至关重要的作用。ERCCl蛋白是核苷酸剪切修复复合体的5’核酸内切酶，见于所有的肿瘤细胞中，其表达水平差异很大。ERCCl蛋白的示例性编码核苷酸序列如SEQ ID NO :1所 /Jn o如本文中所使用的，术语“抗体”是指通常由两对相同的多肽链(每对具有一条“轻”(L)链和一条“重”⑶链)组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分类为K和X轻链。重链可分类为i!、S、Y、Ct或e ,并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(Vh)和重链恒定区(Ch)组成。重链恒定区由3个结构域((^、(^和^^)组成。各轻链由轻链可变区和轻链恒定区(CJ组成。轻链恒定区由一个结构域Q组成。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)的结合。Vh和ん区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR))，其间散布有较保守的称为构架区(FR)的区域。各Vh和ん由按下列顺序FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、⑶R3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个⑶R和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(Vh和^分别形成抗体结合部位。氨基酸至各区域或结构域的分配遵循Kabatsequences of Proteins oi Immunological 丄nterest(National Institutes oi Health,Bethesda，Md. (1987 and 1991)),或 Chothia & Lesk(1987)J. Mol. Biol. 196 :901-917 ;Chothia等人(1989)Nature 342 :878-883的定义。术语“抗体”不受任何特定的产生抗体的方法限制。例如，其包括，特别地，重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。抗体可以是不同同种型的抗体，例如，IgG(例如，IgGl, IgG2, IgG3 或 IgG4 亚型),IgAl, IgA2, IgD, IgE 或IgM抗体。如本文中所使用的，术语抗体的“抗原结合部分”是指全长抗体的ー个或多个部分，所述部分保持结合抗体所结合的相同抗原(例如，ERCC1)的能力，与完整抗体竞争对抗原的特异性结合。通常參见，Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W. , ed ,第 2 版，RavenPress, N. Y. (1989)，其以其全文通过引用合并入本文，用于所有目的。可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗原结合部分。在一些情况下，抗原结合部分包括Fab, Fab;、F(ab' )2、Fd、Fv、dAb和互补决定区(CDR)片段、单链抗体(例如，scFv)、嵌合抗体、双抗体(diabody)和这样的多肽，其包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分。如本文中所使用的，术语“Fd片段”意指由VdP ChI结构域组成的抗体片段；术语"Fv片段”意指由抗体的单臂的\和Vh结构域组成的抗体片段；术语“dAb片段”意指由Vh结构域组成的抗体片段(Ward等人,Nature 341 :544-546(1989));术语“Fab片段”意指由'、VH、(^和ChI结构域组成的抗体片段；术语“F(ab' )2片段”意指包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的抗体片段。在一些情况下，抗体的抗原结合部分是单链抗体(例如，scFv),其中Vlj和Vh结构域通过使其能够产生为单个多肽链的连接体配对形成单价分子(参见，例如，Bird等人，Science 242:423-426(1988)和 Huston 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988))。此类 scFv 分子可具有一般结构=NH2-Vf 接头-Vh-COOH 或 NH2-Vh-接头-'-C00H。合适的现有技术接头由重复的GGGGS氨基酸序列或其变体组成。例如，可使用具有氨基酸序列(GGGGS)4的接头，但也可使用其变体(Holliger等人(1993)，Proc.Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448)。可用于本发明的其他接头由 Alfthan 等人(1995)，Protein Eng. 8 :725-731，Choi 等人(2001)，Eur· J. Immunol. 31 :94-106, Hu 等人(1996)， Cancer Res. 56 :3055-3061，Kipriyanov 等人(1999)，J. Mol. Biol. 293 :41-56 和 Roovers等人(2001), Cancer Tmmunol.描述。在一些情况下，抗体是双抗体，即，双价抗体，其中V1^P \结构域在单个多肽链上表达，但使用太短的连接体以致不允许在相同链的两个结构域之间配对，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并且产生两个抗原结合部位(参见，例如，Holliger P.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :6444-6448 (1993),和 Pol j ak R. J.等人，Structure〗1121-1123(1994))。可使用本领域技术人员已知的常规技术(例如，重组DNA技术或酶促或化学断裂法)从给定的抗体(例如单克隆抗体2E12)获得抗体的抗原结合部分(例如，上述抗体片段)，并且以与对于完整抗体的方式相同的方式就特异性筛选抗体的抗原结合部分。如本文中所使用的，以编号提及的抗体与从相同编号的杂交瘤获得的单克隆抗体相同。例如，单克隆抗体2E12是与从杂交瘤2E12或其亚克隆或后代细胞获得的抗体相同的抗体。如本文中所使用的，术语“表位”是指，抗原上被免疫球蛋白或抗体特异性结合的部位。“表位”在本领域内也称为“抗原决定簇”。表位或抗原决定簇通常由分子的化学活性表面基团例如氨基酸或碳水化合物或糖侧链组成并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。例如，表位通常以独特的空间构象包括至少3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15个连续或非连续的氨基酸，其可以是“线性的”或“构象的”。参见，例如，EpitopeMapping Protocols in Methods in Molecular Biology,第66卷，G. E.Morris,Ed. (1996)。在线性表位中，蛋白质与相互作用分子(例如抗体)之间的所有相互作用的点沿着蛋白质的一级氨基酸序列线性存在。在构象表位中，相互作用的点跨越彼此分开的蛋白质氨基酸残基而存在。可使用本领域技术人员已知的常规技术，就与相同表位的结合竞争性筛选抗体。例如，可进行竞争和交叉竞争研究，以获得彼此竞争或交叉竞争与抗原(例如，ERCC1)的结合的抗体。基于它们的交叉竞争来获得结合相同表位的抗体的高通量方法描述于国际专利申请WO 03/48731中。因此，可使用本领域技术人员已知的常规技术，获得与单克隆抗体2E12竞争结合ERCCl蛋白上的相同表位的抗体及其抗原结合部分。如本文中所使用的，术语“特异性结合”是指抗体对预先确定的抗原上的表位的结合。通常，抗体以小于大约10_7M，例如小于大约10_8M、10_9M或KTkiM或更小的亲和カ(Kd)结合抗原表位。如本文中所使用的，术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。通常，抗体(例如，本发明的单克隆抗体2E12)以小于大约10_7M，例如小于大约10_8M、10_9M或KTwM或更小的解离平衡常数(Kd)结合抗原(例如，ERCCl蛋白)，例如，如使用表面等离子体共振术(SPR)在BIAC0RE仪中測定的。如本文中所使用的，当提及术语“杂交瘤”时，其还包括杂交瘤的亚克隆和后代细 胞。例如，当提及杂交瘤2E12时，其还指杂交瘤2E12的亚克隆和后代细胞。如本文中所使用的，术语“患者”是指哺乳动物，例如人。如本文中所使用的，术语“钼类药物”是指含有钼的药物(例如化疗药物)，其包括但不限于，顺钼(Cisplatin)、卡钼(Carboplatin)、奈达钼(Nedaplatin)、奥沙利钼(Oxaliplatin)、舒钼(Sunpla)和洛钼(Lobaplatin)。如本文中所使用的，20种常规氨基酸和其缩写遵从常规用法。參见Immunology-ASynthesis {^2 版，E. S. Golub 和 D. R. Gren, Eas. , Sinauer Associates, Sunderland,Mass.(1991))，其通过引用合并入本文。因此，在ー个方面，本发明提供了特异性结合ERCCl蛋白的单克隆抗体2E12或其抗原结合部分，所述单克隆抗体2E12由保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，具有保藏号CGMCCNo. 5197的杂交瘤产生。在另ー个方面，本发明提供了特异性结合ERCCl蛋白的抗体或其抗原结合部分，其与单克隆抗体2E12竞争结合ERCCl蛋白上的相同表位，所述单克隆抗体2E12由保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，具有保藏号CGMCC No. 5197的杂交瘤产生。在另ー个方面，本发明提供了一种杂交瘤，其以保藏号CGMCCNo. 5197保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。在另ー个方面，本发明提供了一种组合物，其包含根据本发明的抗体或其抗原结合部分。在另ー个方面，本发明提供了检测ERCCl蛋白在样品中的存在或其表达水平的方法，其包括使用根据本发明的抗体或其抗原结合部分。在一个优选的实施方案中，所述样品是组织样品，例如癌组织样品(例如肺癌组织，卵巣癌组织，肾腺癌组织，子宮内膜癌组织和乳腺癌组织)。在一个优选的实施方案中，所述样品是细胞样品，例如细胞裂解液。在一个优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合部分还包括可检测的标记。在一个优选的实施方案中，所述方法还包括使用携帯可检测的标记的第二抗体来检测根据本发明的抗体或其抗原结合部分。此类第二抗体是本领域公知的，例如但不限于可识别抗体2E12的抗小鼠IgG抗体。在一个优选的实施方案中，所述方法包括但不限于，Western印迹法、ELISA法和免疫组织化学法。在一个优选的实施方案中，所述方法不是疾病的诊断方法。在另一个方面，还提供了根据本发明的抗体或其抗原结合部分的用途，其用于检测ERCCl蛋白在样品中的存在或其表达水平，或者用于制备试剂盒，所述试剂盒用于检测ERCCl蛋白在样品中的存在或其表达水平。在一个优选的实施方案中，所述样品包括但不限于，组织样品，例如癌组织样品(例如肺癌组织，卵巢癌组织，肾腺癌组织，子宫内膜癌组织和乳腺癌组织)，以及细胞样品，例如细胞裂解液。在一个优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合部分还包括可检测的标记。在一个优选的实施方案中，所述试剂盒还包含第二抗体，其特异性识别根据本发明的抗体或其抗原结合部分，例如但不限于可特异性识别抗体2E12的抗小鼠IgG抗体。在进一步优选的实施方案中，所述第二抗体还包括可检测的标记。本领域技术人员公知，ERCCl蛋白可用作标志物，用于对患有恶性肿瘤的患者进行预后判断，以及用于预测对患者施用钼类药物的辅助治疗的疗效(参考文献Bhagwat，etal. Immunodetection of DNA Repair Endonuclease ERCCI-XPF in Human Tissue. Cancer·Res2009 ;69 :6831-6838 ;01aussen，et al. DNA Repair by ERCCl in Non-SmalI-CelI LungCancer and Cisplatin-Based Adjuvant Chemotherapy. N Engl J Med,2006, vol.355,no. 10 :983-991 ；Arbogast et al. Automated ERCCl Immunohistochemistry in Non-smallCell Lung Cancer :Comparison of anti-ERCCI Antibodies 8F1, D-10,and FL-297. ApplImmunohistochem Mol MorphoI. 2011, Volume 19, Number2,99-105 ;李建旺.切除修复交叉互补基因I与钼类耐药的研究进展·江西医药，2009，Vol44，No. 6 :625-628.)。因此，在另一个方面，本发明提供了对患有恶性肿瘤的患者进行预后判断的方法，其包括使用根据本发明的抗体或其抗原结合部分检测来自所述患者的恶性肿瘤组织中ERCCl的表达水平。所述恶性肿瘤组织中ERCCl的表达水平与预后相关，在一个优选的实施方案中，所述恶性肿瘤包括但不限于，肺癌(例如非小细胞肺癌)，卵巢癌，肾腺癌，子宫内膜癌和乳腺癌。在一个优选的实施方案中，所述抗体是单克隆抗体2E12。在一个优选的实施方案中，所述恶性肿瘤组织中更高水平的ERCCl预示着，所述患者的预后结果更佳(与治疗无关)。在一个优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合部分还包括可检测的标记。在一个优选的实施方案中，所述方法还包括使用携带可检测的标记的第二抗体来检测根据本发明的抗体或其抗原结合部分。此类第二抗体是本领域公知的，例如但不限于可识别抗体2E12的抗小鼠IgG抗体。在另一个方面，本发明提供了预测对患有恶性肿瘤的患者施用钼类药物治疗的疗效的方法，其包括使用根据本发明的抗体或其抗原结合部分检测来自所述患者的恶性肿瘤组织中ERCCl的表达水平。在一个优选的实施方案中，所述恶性肿瘤为可以施用钼类药物进行治疗的恶性肿瘤，其包括但不限于，肺癌(例如非小细胞肺癌)，卵巢癌，肾腺癌，子宫内膜癌和乳腺癌。在一个优选的实施方案中，所述抗体是单克隆抗体2E12。在一个优选的实施方案中，所述恶性肿瘤组织中更低水平的ERCCl预示着，所述治疗对于该患者的疗效更好。在一个优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合部分还包括可检测的标记。在一个优选的实施方案中，所述方法还包括使用携带可检测的标记的第二抗体来检测根据本发明的抗体或其抗原结合部分。此类第二抗体是本领域公知的，例如但不限于可识别抗体2E12的抗小鼠IgG抗体。在另ー个方面，还提供了根据本发明的抗体或其抗原结合部分在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于对患有恶性肿瘤的患者进行预后判断和/或用于预测对患有恶性肿瘤的患者施用钼类药物治疗的疗效。当试剂盒用于预后判断时，所述恶性肿瘤组织中ERCCl的表达水平与预后相关；当试剂盒用于预测药物疗效时，所述恶性肿瘤为可以施用钼类药物进行治疗的恶性肿瘤。在一个优选的实施方案中，所述恶性肿瘤包括但不限于，肺癌(例如非小细胞肺癌)，卵巣癌，肾腺癌，子宮内膜癌和乳腺癌。在一个优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合部分还包括可检测的标记。在一个优选的实施方案中，所述抗体是单克隆抗体2E12。在ー个优选的实施方案中，所述试剂盒还包含第二抗体，其特异性识别根据本发明的抗体或其抗原结合部分，例如但不限于可特异性识别抗体2E12的抗小鼠IgG抗体。在进ー步优选的实施方案中，所述第二抗体还包括可检测的标记。 在另ー个方面，还提供了根据本发明的抗体或其抗原结合部分在制备检测试剂中的用途，所述检测试剂用于对患有恶性肿瘤的患者进行预后判断和/或用于预测对患有恶性肿瘤的患者施用钼类药物治疗的疗效。当检测试剂用于预后判断时，所述恶性肿瘤组织中ERCCl的表达水平与预后相关；当检测试剂用于预测药物疗效时，所述恶性肿瘤为可以施用钼类药物进行治疗的恶性肿瘤。在一个优选的实施方案中，所述恶性肿瘤包括但不限于，肺癌(例如非小细胞肺癌)，卵巣癌，肾腺癌，子宮内膜癌和乳腺癌。在一个优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合部分还包括可检测的标记。在一个优选的实施方案中，所述抗体是单克隆抗体2E12。在一个优选的实施方案中，所述试剂盒还包含第二抗体，其特异性识别根据本发明的抗体或其抗原结合部分，例如但不限于可特异性识别抗体2E12的抗小鼠IgG抗体。在进ー步优选的实施方案中，所述第二抗体还包括可检测的标记。在另ー个方面，本发明提供了试剂盒，其包含根据本发明的抗体或其抗原结合部分。在一个优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合部分还包含可检测的标记。在另ー个优选的实施方案中，所述抗体是单克隆抗体2E12。在一个优选的实施方案中，所述试剂盒还包含第二抗体，其特异性识别根据本发明的抗体或其抗原结合部分，例如但不限于可特异性识别抗体2E12的抗小鼠IgG抗体。在进ー步优选的实施方案中，所述第二抗体还包括可检测的标记。在其他优选的实施方案中，本发明的试剂盒可用于检测ERCCl蛋白在样品中的存在或其表达水平，用于对患有恶性肿瘤的患者进行预后判断和/或用于预测对患有恶性肿瘤的患者施用钼类药物治疗的疗效。当试剂盒用于预后判断时，所述恶性肿瘤组织中ERCCl的表达水平与预后相关；当试剂盒用于预测药物疗效时，所述恶性肿瘤为可以施用钼类药物进行治疗的恶性肿瘤。、在一个优选的实施方案中，所述恶性肿瘤包括但不限于，肺癌(例如非小细胞肺癌)，卵巣癌，肾腺癌，子宫内膜癌和乳腺癌。在另ー个方面，本发明提供了用于检测ERCCl蛋白的检测试剂，其包含根据本发明的抗体或其抗原结合部分。在一个优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合部分还包含可检测的标记。在另一个优选的实施方案中，所述抗体是单克隆抗体2E12。在一个优选的实施方案中，所述试剂盒还包含第二抗体，其特异性识别根据本发明的抗体或其抗原结合部分，例如但不限于可特异性识别抗体2E12的抗小鼠IgG抗体。在进一步优选的实施方案中，所述第二抗体还包括可检测的标记。在其他优选的实施方案中，本发明的检测试剂可用于检测ERCCl蛋白在样品中的存在或其表达水平，用于对患有恶性肿瘤的患者进行预后判断和/或用于预测对患有恶性肿瘤的患者施用钼类药物治疗的疗效。当检测试剂用于预后判断时，所述恶性肿瘤组织中ERCCl的表达水平与预后相关；当检测试剂用于预测药物疗效时，所述恶性肿瘤为可以施用钼类药物进行治疗的恶性肿瘤。在一个优选的实施方案中，所述恶性肿瘤包括但不限于，肺癌(例如非小细胞肺癌)，卵巢癌，肾腺癌，子宫内膜癌和乳腺癌。
图I展示了包含ERCCl开放阅读框(open reading frame, 0RF)的构建体的核苷酸序列。其中，粗体表示ERCC10RF;斜体+单下划线表示酶切位点；双下划线表示C末端Myc-DDK 标签。图2展示了表达ERCCl的重组质粒的构建设计。其中，在ERCC10RF的两侧具有多个酶切位点，并且在ORF的上游具有核糖体结合位点(RBS)和Kozac共有序列，在ORF的下游具有Myc标签和Flag标签。图3展示了使用Western印迹法检测细胞中表达的ERCCl蛋白的结果。蛋白质分子量标准的单位为kDa。其中，左侧泳道转染了空载体pCMV6-Entry的HEK293T细胞的裂解液；右侧泳道转染了重组质粒PCMV6-ERCC1的HEK293T细胞的裂解液。Western印迹法所使用的一抗为anti-DDK，使用的二抗为羊抗鼠IgG抗体。结果显示，用重组质粒转染细胞后，ERCCl蛋白在HEK293T细胞中高表达。图4展示了使用SDS-PAGE检测经纯化的ERCCl蛋白的结果。蛋白质分子量标准的单位为kDa。结果显示，经亲和层析纯化后，ERCCl蛋白的纯度达到90%，其分子量为32. 4kDa。图5展示了单克隆抗体2E12在9种不同细胞系中的Western blot结果,九种细胞系从左至右依次为 H印G2、Hela, HT29、A549、C0S7、Jurkat, MDCK, PC12 和 MCF7，结果显示，本发明的单克隆抗体2E12能够特异性识别并结合!fepG2、Hela、HT29、A549、C0S7、Jurkat、PC12和MCF7细胞中的ERCCl蛋白。图6展示了使用抗ERCCl单克隆抗体2E12通过免疫组化方法检测乳腺癌组织的结果。图7展示了使用抗ERCCl单克隆抗体2E12通过免疫组化方法检测肾腺癌组织的结果。图8展示了使用抗ERCCl单克隆抗体2E12通过免疫组化方法检测卵巢癌组织的结果。
图9展示了使用抗ERCCl单克隆抗体2E12通过免疫组化方法检测子宮内膜癌组织的結果。图10展示了使用Western印迹法检测单克隆抗体2E12特异性的结果。蛋白质分子量标准的单位为kDa。其中泳道I和5为转染了重组质粒pCMV6-ERCCl的HEK293T细胞的裂解液，泳道2和6为转染了空载体pCMV6-Entry的HEK293T细胞的裂解液，泳道3和7为Protein X(PCYTlA, Homo sapiens phosphate cytidyIyItransferase I, choline, alpha,NCBI登录号为NM_005017)，泳道4为空缺；Western印迹法所使用的ー抗，在泳道1、2、3为抗ERCCl单克隆抗体8F1，泳道5、6、7为抗ERCCl单克隆抗体2E12，使用的ニ抗为羊抗鼠IgG抗体(Jackson公司)。结果显示，单抗8F1与Protein X有交叉反应,而单抗2E12与Protein X没有交叉反应，表明单抗2E12具有更好的特异性。发明的有益效果
目前国内外广泛用于临床病理检测及科学研究实践的ERCCl单克隆抗体是8F1。研究显示，8F1在与ERCCl特异性结合的同时，还与细胞内除ERCCl蛋白外的非特异蛋白发生交叉反应，这直接影响了免疫组化结果的特异性和可靠性。相比之下，本发明提供了一种特异性针对ERCCl的单克隆抗体2E12，其不仅可与ERCCl特异性结合，而且与细胞内其他非特异蛋白不发生非特异反应。因此，本发明的单克隆抗体2E12特异性更好，可有效提高IHC实验的特异性、准确性和可靠性，达到真实反映肿瘤细胞内ERCCl表达水平的目的。本发明的单克隆抗体2E12有效克服了目前广泛使用的ERCCl单抗8F1的非特异性问题，可用于非小细胞肺癌、卵巣癌、乳腺癌、肾腺癌和子宮内膜癌等肿瘤的预后判断，并实现对含钼类化疗药物辅助化疗的疗效预測。关于生物材料保藏的说明本发明涉及生物材料HB501696，其分类命名为抗人ERCCl单克隆抗体杂交瘤细胞株2E12，其于2011年8月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCCNo. 5197。该杂交瘤分泌单克隆抗体2E12。
具体实施例方式下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例I、ERCCl重组表达质粒的构建以从ATCC 获得的质粒 BC0089302 (含 ERCC10RF 894bp)为模板，以 5' -GAGAGCGATCGCCATGGACCCTGGGAAGGACAAAG-3' (SEQ ID NO :2)为正向引物(其5'端引入限制性内切酶 SgfI 位点 GCGATCGC)，5' -CGAGCCCTTCTTGAAAGTACCCACGCGTGAGA-3' (SEQ ID NO :3)为反向引物(其5'端引入限制性内切酶MluI位点ACGCGT)，通过PCR扩增获得ERCC10RF,并在其两侧分别引入限制性内切酶SgfI和MluI的识别位点。根据制造商的说明书，使用限制性内切酶SgfI和MluI (ABI公司)，将PCR产物克隆入表达载体pCMV6-Entry (来源于origene公司)，从而构建表达ERCCl的重组质粒pCMV6_ERCCl，该重组质粒在ERCC10RF的下游携带Myc标签和Flag标签(参见图2，其核苷酸序列如SEQ ID NO 4所示)。经测序验证,所获得的重组质粒中插入的ERCC10RF的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。图I和图
2分别显示了包含ERCC10RF的构建体，以及pCMV6_ERCCl重组质粒的构建设计。实施例2、ERCCl重组抗原的表达与纯化ERCCl重鉬蛋白的表汰使用本领域技术人员熟知的方法，将实施例I获得的PCMV6-ERCC1重组质粒转染入HEK293T细胞。简言之，在37°C下在5% CO2培养箱(Thermo 公司)中，将HEK293T细胞(来源于ATCC)培养在补充有新生牛血清、庆大霉素的DMEM培养基(Thermo fisher公司)中直至汇合，然后以I : 3将其传代至IOcm培养皿(康宁公司)中继续培养；取7.5ml DMEM培养基(不含血清及抗生素)至50ml管中，加入300ul PEI MegaTranl. O (origene生产)并混匀；然后添75 μ g pCMV6-ERCCl重组质粒DNA至上述混合物中，混匀并静置30分钟；静置后，分别取515 μ I至各培养皿中，继续培养细胞；转染24小时后，各培养皿分别添加2Μ丁酸钠，直至终浓度为5mM，继续培养细胞。转染48小时后，从各培养皿中吸去培养基，并用PBS清洗细胞I次，然后向各培养皿中分别添加含蛋白酶抑制剂PI (SIGMAgs )和IOOmM PMSF(Amresco公司)的Iml裂解缓冲液，然后在冰上，在振荡下裂解细胞。收集经转染的HEK293T细胞的细胞裂解液，在4°C下以4000rpm离心15分钟，收集裂解液上清。转染空载体pCMV6_Entry的HEK293T细胞的裂解液上清用作阴性对照。通过本领域技术人员熟知的Western印迹法(《蛋白质技术手册》,汪家政著)，使用anti-DDK (ABM公司)作为一抗,使用Jackson公司生产的羊抗鼠抗体作为二抗,检测如上获得的细胞裂解液上清中ERCCl重组蛋白的存在。结果如图3所示。结果显示，转染空载体pCMV6-Entry的HEK293T细胞不表达ERCCl蛋白，而转染pCMV6_ERCCl重组质粒的HEK293T细胞以高水平表达ERCCl重组蛋白。ERCCl重组蛋白的纯化使用亲和层析法对如上获得的细胞裂解液上清中的ERCCl蛋白进行纯化。将细胞裂解液上清用0.45uM，33mm PVDF膜滤器过滤，然后根据制造商的说明书，使用Beads (SIGMA公司)纯化裂解液上清中的ERCCl蛋白(其DDK标签)。简言之，向50ml的裂解液上清中加入Iml Beads，并在4°C下在360度混匀器(其林贝尔公司？)中结合2小时；然后将含有Beads的裂解液倒BIO-RAD层析柱中，并接住穿透液；用裂解缓冲液清洗Beads1-2 次，再用 TBST(TBS+0. 5% Tween-20)清洗Beads 3 次;然后用 O. IM Glycine ρΗ3· 5 进行洗脱第一次添加200ul，滴尽不收集，第二、三次各添加500ul，，收集洗脱液至一个I. 5ml离心管中，并迅速加入NaH2PO4(pH= 11. O)以将洗脱液的pH中和至pH7. O左右；然后向洗脱液中添加甘油至终浓度为10 %，添加Tween-80至终浓度为O. I %，从而获得经纯化的ERCCl蛋白。使用本领域技术人员熟知的SDS-PAGE法(《蛋白质技术手册》，汪家政著)来鉴定纯化后的ERCCl蛋白，结果示于图4中。结果显示，经亲和层析纯化后，ERCCl蛋白的纯度达到90%，其分子量为32. 4kDa。实施例3、单抗的筛选与制备
动物免疫将经过纯化的ERCCl蛋白用作抗原，免疫6-8周龄BALB/c小鼠。免疫方式为皮下或腹腔注射。初次免疫时，用完全弗氏佐剂乳化抗原，免疫剂量为50iig/只。间隔两周后，以不完全弗氏佐剂乳化抗原，进行第二次免疫，免疫剂量为50 u g/只。免疫两次后，取小鼠尾血以ELISA法(包被ERCCl蛋白，羊抗鼠抗体为ニ抗)测定梯度稀释的血清的效价。根据测定结果确定是否对小鼠进行进一歩的加强免疫，并且选取血清抗体效价最高的小鼠，用于进行后续的细胞融合。細胞融合采用的骨髓瘤细胞为处于对数生长期的BALB/c来源的sp2/0细胞(来源于ATCC)。取经免疫的小鼠的脾脏，制备脾淋巴细胞的单细胞悬液。然后将小鼠脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞以I : 5-1 10混合，滴加37°C预热的50% PEG4000(PH 8. 0) lml，加入DMEM培养基(Thermo fisher公司)，离心弃上清后加入HAT培养基(Sigma公司，Gibco公司生 产的頂DM培养基中加入新生牛血清、抗生素、MC、HAT)，悬浮混匀，分装至3. 5cm培养皿中，放于湿盒中，并置于37°C、5% CO2恒温培养箱中进行培养。筛诜和克降融合7-10天后，挑选细胞克隆，使用经纯化的ERCCl重组蛋白进行ELISA测试，以确定细胞克隆是否产生抗体。对ELISA检测呈阳性的细胞进行有限稀释，并在每次有限稀释后5-6天进行ELISA测试，测定0D280读数。挑取0D280读数较高的阳性细胞克隆进行进ー步的有限稀释，直至用ELISA測定96孔板吋，整个96孔板的结果均为阳性。从中挑取0D280读数较高的阳性细胞克隆，从而获得产生抗ERCCl单克隆抗体的杂交瘤细胞株，将其命名为2E12。腹水单抗的制备与纯化给10-12周龄的雄性BALB/c小鼠腹腔注射0. 5ml降植烷。一周后，用Iml注射器给每只小鼠腹腔注射用PBS洗涤和重悬的杂交瘤细胞株的细胞悬液，细胞用量为5X IO6/只，注射2只小鼠/杂交瘤细胞株。待小鼠腹水积聚后，收集腹水，离心收集上清，并用亲和层析法进行腹水单抗的纯化。单抗2E12亚型为IgG2b,采用protein A (Sigma公司)进行纯化。测定纯化后的单克隆抗体的浓度，进行分装，并冻存在-20°C。实施例4、单克隆抗体2E12的Western印迹检测在本实验中，使用单克隆抗体2E12通过Western印迹法来分析ERCCl蛋白在不同细胞系中的表达情况，从而通过Western印迹法来验证单克隆抗体2E12的效カ。所使用的9种细胞系如下H印G2，HeLa, HT29, A549, C0S7, Jurkat, MDCK, PCI2 和 MCF7 (来源于 ATCC)。Western印迹法中所使用的ー抗为如上获得的单克隆抗体2E12,所使用的ニ抗为Jackson公司生产的羊抗鼠IgG抗体，样品为上述各种细胞系的裂解液。Western印迹分析的结果示于图5中。结果显示，用单克隆抗体2E12进行检测时，仅显示単一的特异性条带，这表明单克隆抗体2E12能够特异性识别并结合在细胞系中表达的ERCCl蛋白，其具有结合特异性。实施例5、单抗2E12为ー抗的免疫组织化学(IHC)检测在本实验中，通过免疫组织化学(IHC)检测来验证单克隆抗体2E12的效力。IHC检测方案如下
I、取卵巢癌、肾腺癌、乳腺癌和子宫内膜癌等癌变组织块进行石蜡包埋，使用Finesse组织切片机(Thermo公司)进行切片，组织厚度为6um。2、依次使用下列试剂，对组织切片进行脱蜡与水化分析纯二甲苯(3X10min)，无水乙醇(3 X IOmin), 95 % 乙醇(I X 5min), 85% 乙醇(I X 5min), 75 % 乙醇(lX5min),去离子水(3X3min)。3、加入抗原修复液(O. OlM枸橼酸钠缓冲液，pH6. O)，在121°C下高压热修复2min。待温度降至约90°C时，取出组织切片 ，并自 然冷却至室温，然后用去离子水浸泡3X3min。4、在室温下，使用3%过氧化氢灭活组织样品中的内源性过氧化物酶，静置IOmin0然后用去离子水浸泡3X 5min。5、向样品中添加封闭液(PBS+5%脱脂奶粉+5%正常山羊血清)，在37°C下孵育60mino6、去除封闭液，勿冲洗，加入ERCCl单克隆抗体2E12(以I : 150稀释于封闭液中)，在湿盒中在37°C下孵育60min。然后用PBS+0. I % Tween-20洗涤2次，每次洗涤5min ；再用PBS+0. 02% Tween-20洗涤I次，每次洗涤5min。7、滴加Polink-试剂盒2 (GBI公司)的试剂1，并在37°C下孵育10_20分钟，然后用PBS洗涤3次，每次5min。洗涤后，滴加Polink_2试剂盒的试剂2，并在37°C下孵育10-20分钟，然后用PBS洗涤3次，每次5min。8、使用DAB溶液(中杉金桥ZLI-9019)进行显色，显色3_10min。然后用蒸馏水洗涤。9、用苏木精复染细胞核2min，然后用蒸馏水漂洗，用I %盐酸分化，再用蒸馏水漂洗3次,室温静置Imin。10、依次使用下列试剂，对样品进行脱水和透明75%乙醇乙醇(I X 5min), 95% 乙醇(I X 5min), 100% 乙酉享(3X5min), 二甲苯(3X5min)。用中性树胶封片。11、用显微镜(Olympus公司1X70)镜检，结果见图6、图7、图8、图9。结果显示，单克隆抗体2E12能够特异性检测癌组织(例如卵巢癌、肾腺癌、乳腺癌和子宫内膜癌组织)中的ERCCl蛋白的表达水平，从而可用于对使用钼类化疗药物的辅助化疗进行疗效预测及预后判断。实施例6、单抗2E12的特异性检测通过本领域技术人员熟知的Western印迹法(《蛋白质技术手册》,汪家政著)检测单抗2E12的特异性。分别使用抗ERCCl单克隆抗体8F1 (Abeam公司)和2E12 (实施例3制备)作为一抗，使用Jackson公司生产的羊抗鼠IgG抗体作为二抗(一抗I : 2000稀释，二抗I : 5000稀释)，检测转染了重组质粒PCMV6-ERCC1的HEK293T细胞的裂解液、转染了空载体 pCMV6-Entry 的 HEK293T 细胞的裂解液和 Protein X(PCYT1A, Homo sapiensphosphate cy tidy Iy I transferase I, choline, alpha, NCBI 登录号为 NM 005017)。结果如图10所示。结果显示，单抗8F1与Protein X有交叉反应，而单抗2E12与Protein X没有交叉反应，表明单抗2E12具有更好的特异性。尽管本发明的具体实施方式
已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的 保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
权利要求
1.特异性结合ERCCl蛋白的单克隆抗体2E12或其抗原结合部分，所述单克隆抗体2E12由保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，具有保藏号CGMCCNo. 5197的杂交瘤产生。
2.特异性结合ERCCl蛋白的抗体或其抗原结合部分，其与单克隆抗体2E12竞争结合ERCCl蛋白上的相同表位，所述单克隆抗体2E12由保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，具有保藏号CGMCC No. 5197的杂交瘤产生。
3.一种杂交瘤，其以保藏号CGMCC No. 5197保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
4.一种组合物，其包含权利要求I或2的抗体或其抗原结合部分。
5.检测ERCCl蛋白在样品中的存在或其表达水平的方法，其包括使用权利要求I或2的抗体或其抗原结合部分， 例如，所述样品包括但不限于，组织样品和细胞样品； 例如，所述抗体或其抗原结合部分还可包括可检测的标记； 例如，所述方法还可包括，使用携带可检测的标记的第二抗体来检测所述抗体或其抗原结合部分。。
6.权利要求I或2的抗体或其抗原结合部分的用途，其用于检测ERCCl蛋白在样品中的存在或其表达水平，或者用于制备试剂盒，所述试剂盒用于检测ERCCl蛋白在样品中的存在或其表达水平， 例如，所述样品包括但不限于，组织样品和细胞样品； 例如，所述抗体或其抗原结合部分还可包括可检测的标记； 例如，所述试剂盒还可包含第二抗体，其特异性识别所述抗体或其抗原结合部分， 例如，所述第二抗体还可包括可检测的标记。
7.一种试剂盒，其包含权利要求I或2的抗体或其抗原结合部分， 例如，所述抗体或其抗原结合部分还可包含可检测的标记； 例如，所述抗体是单克隆抗体2E12 ; 例如，所述试剂盒还可包含第二抗体，其特异性识别所述抗体或其抗原结合部分； 例如，所述第二抗体还可包括可检测的标记。
8.一种用于检测ERCCl蛋白的检测试剂，其包含权利要求I或2的抗体或其抗原结合部分， 例如，所述抗体或其抗原结合部分还可包含可检测的标记； 例如，所述抗体是单克隆抗体2E12 ; 例如，所述试剂盒还可包含第二抗体，其特异性识别所述抗体或其抗原结合部分； 例如，所述第二抗体还可包括可检测的标记。
9.权利要求I或2的抗体或其抗原结合部分在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于对患有恶性肿瘤的患者进行预后判断和/或用于预测对患有恶性肿瘤的患者施用钼类药物治疗的疗效， 例如，所述癌症包括但不限于，肺癌(例如非小细胞肺癌)，卵巢癌，肾腺癌，子宫内膜癌和乳腺癌； 例如，所述抗体或其抗原结合部分还可包括可检测的标记；例如，所述试剂盒还可包含第二抗体，其特异性识别所述抗体或其抗原结合部分， 例如，所述第二抗体还可包括可检测的标记。
10.权利要求I或2的抗体或其抗原结合部分在制备检测试剂中的用途，所述检测试剂用于对患有恶性肿瘤的患者进行预后判断和/或用于预测对患有恶性肿瘤的患者施用钼类药物治疗的疗效， 例如，所述癌症包括但不限于，肺癌(例如非小细胞肺癌)，卵巣癌，肾腺癌，子宮内膜癌和乳腺癌； 例如，所述抗体或其抗原结合部分还可包括可检测的标记； 例如，所述检测试剂还可包含第二抗体，其特异性识别所述抗体或其抗原结合部分， 例如，所述第二抗体还可包括可检测的标记。
全文摘要
本发明涉及可特异性结合切除修复交叉互补基因1(excision repair cross-complement-action group 1，ERCC1)蛋白的单克隆抗体2E12，产生所述单克隆抗体的杂交瘤，包含所述单克隆抗体的组合物，以及所述单克隆抗体的使用方法和用途。本发明的单克隆抗体2E12有效克服了ERCC1单抗8F1的非特异性问题，可用于非小细胞肺癌、卵巢癌、乳腺癌、肾腺癌和子宫内膜癌等肿瘤的预后判断，并实现对含铂类化疗药物辅助化疗的疗效预测。
文档编号C12R1/91GK102786597SQ20111027425
公开日2012年11月21日 申请日期2011年9月16日 优先权日2011年9月16日
发明者任琪, 何为无, 王宜, 袁克湖, 陈思, 马东辉, 龚世妍 申请人:无锡傲锐东源生物科技有限公司