专利名称：哺乳动物细胞大规模生产重组可溶性人干细胞因子与免疫球蛋白Fc片段融合蛋白(sSCF ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种将人干细胞因子与人免疫球蛋白IgGl的Fc段融合基因 (sSCF-Fc)转入哺乳动物细胞以大规模生产其蛋白产物的技术。
背景技术：
1.SCF的生物学作用与应用前景干细胞因子(stemcell factor, SCF)，又称 KIT 配体(KIT Ligand, KITLG)或肥大细胞生长因子(Mast cell growth factor，MGF)，是一种与原癌基因c_Kit产物结合的糖蛋白(CD117)。SCF通过可变剪切可以形成跨膜型和可溶性两种形式的的蛋白产物，二者都具有生物活性，在机体发育、肿瘤发生、发展和侵润及其它疾病的形成等过程中发挥重要的作用。SCF对于胚胎发育过程中的造血作用至关重要。SCF指导造血干细胞进入造血微环境，并维持造血干细胞的存活能力和再生能力。可溶性或细胞表面的SCF通过与其细胞表面受体c-Kit结合影响效应的肥大细胞、造血前体细胞、生殖细胞和黑素细胞的分化和功能。所有血管发生的组织如骨髓、胎肝等都有SCF表达。有研究显示，SCF或其受体表达缺陷能够引起巨红细胞贫血症甚至死亡。SCF在精子发生过程中也扮演重要角色。SCF是精巢形成和发育的关键性调节分子，其与受体结合激活的信号通路对于生殖细胞的增殖、迁移、减数分裂及其凋亡都发挥着重要的调节作用。SCF表达的时间和区域与生殖细胞的形成及迁移的路径一致，其受体的表达时相也与生殖细胞的形成过程具有同一性。SCF系统对人生精细胞的调控不仅限于胚胎期，在青春期及随后精子发生的全过程均以不同的方式发挥调控作用。SCF及其受体缺失能够引起不育症。SCF对于在发育过程中黑素细胞的定位非常重要。机体的色素沉着由一类能够产生黑色素的黑素细胞控制。SCF通过结合成黑素细胞表面的Kit受体指导其从中枢神经系统到达皮肤或毛发特定区域分化成黑素细胞。另外，SCF对于成体中终末分化的黑素细胞存活和增殖的调节同样重要。SCF表缺陷能够引起斑驳病。SCF表达异常还与某些肿瘤的关系密切。与正常的肝组织相比，肝癌组织中SCF及 c-Kit蛋白的表达明显降低；食管癌患者胃食管吻合术后，其胃粘膜和残存食管中SCF表达水平较正常人明显降低；胆管癌病人体内SCF表达水平和阳性率显著提高，且其表达与肿瘤分级呈正相关，SCF表达可能与胆管癌的发生密切相关，并且参与了肿瘤的侵润过程。目前，SCF已经用于某些疾病的治疗。SCF作为相关肿瘤的重要检测指标用于早期的诊断或预后的评价；另外，SCF还可作为肿瘤治疗上的新靶点，对于阻断肿瘤细胞向周围组织的扩散转移或肿瘤的复发可能有重要意义。另外，体外造血干细胞或其他多能干细胞的大规模培养的成功为器官移植提供了可能性。SCF是在干细胞培养过程中不可或缺的细胞因子，用SCF与其它细胞因子(如IL-3，IL-6，IL-1，TPO, GM-CSF等)协同作用可体外扩增骨髓或外周血来源的干细胞，如造血干细胞、内皮祖细胞、神经干细胞，间充质干细胞等，这些干细胞直接回输至病人体内，或体外诱导其进行组织分化，将诱导形成的器官移植到病人体内，用于白血病、肿瘤或大面积创面的治疗。目前，SCF还在其它疾病的治疗过程中发挥作用。SCF与其它化疗药物协同作用白血病患者可提高造血前体细胞的动员；SCF可用于降低非小细胞肺癌和乳癌化疗过程中产生的血小板减少症。制备高活性、高纯度、低毒性的重组SCF蛋白是生产临床诊断试剂、治疗用SCF药物和器官移植的前提，为其在科研、临床诊断和治疗等方面研究和应用提供了更多的可能性和广阔的市场前景。2. Fc融合蛋白的表达免疫球蛋白IgG的Fc融合蛋白是指在基因水平将目的基因同IgG的Fc片段基因相连而表达的重组蛋白，同时具有目的蛋白及免疫球蛋白的结构域，从而赋予了重组蛋白许多新的特性，拓展了蛋白在科研、制药及临床等方面的应用。在重组蛋白表达的过程中，Fc重组蛋白易于结合Protein A，从而简化了蛋白的纯化过程；Fc片段可以方便地进行流式、免疫组化和免疫共沉淀等方法检测，可用于感兴趣的基因研究；体外实验中，Fc融合蛋白可用于拮抗或激活细胞表面受体用来研究受体-配体反应和信号通路；此外，Fc重组蛋白还能应用于噬菌体展示技术，如作为抗原制备人类全抗体库。另外，Fc片段还赋予了重组蛋白一些其它特性，增加了其在在制药和临床方面的应用价值。融合蛋白中加入重链的恒定区，其半衰期明显延长，延长了其在体内的半衰期； Fc段能穿过胎盘、结合补体并介导补体依赖的细胞毒作用等；重组蛋白含有的铰链区结构域使其形成二聚体或多聚体，增强了其抗原结合力。以上这些特点拓展了融合蛋白在感染性疾病、自身免疫性疾病及移植排斥反应的治疗方面的临床应用前景。3.研究现状目前国际上生产的sSCF-Fc重组蛋白基本都是采用大肠杆菌或酵母表达系统获得的，蛋白产物未经糖基化或糖基化程度不高，活性和毒素含量难以满足临床诊断和治疗的目的。用哺乳动物细胞生sSCF-Fc重组蛋白是生产科研和临床用SCF的重要途径，对于推动临床诊断环节的新型生物技术发展和临床药物开发具有重要意义。
发明内容
本发明旨在建立用哺乳动物细胞大规模生产具有生物学活性的sSCF-Fc蛋白的方法。在工业生产中满足生产成本降低、简化工艺流程、提高产品产量和质量的总体要求。本发明包括制备转染用质粒和PEI、质粒转染293T细胞和表达、蛋白纯化及等四个步骤。用PEI作为转染试剂，其作为“质子海绵”可以高效地结合双链DNA，把其带入目的细胞中，蛋白产物可在短暂的时间(一般可以表达一周的时间)内获得一过性表达从而获得大量的蛋白。本发明所用的293T细胞是工业生产人临床用蛋白最为常见的一种细胞。不仅表达水平高，蛋白翻译后加工方式如糖基化等与体内天然蛋白相似，而且无潜在的生物危害性，自身分泌的蛋白很少从而简化了后续的纯化过程，特别适于分泌型细胞因子或趋化因子等产物的大规模生产。而且这种细胞可以通过驯化在无血清培养基中生产，对于降低工业生产的成本是必需的。细胞密度能够提高数十倍甚至数千倍，大大提高了蛋白产量。采用本方法，可以通过普通的大规模细胞培养获得大量高纯度高生物活性的 sSCF-Fc蛋白。本项技术应用于sSCF-Fc蛋白的大规模生产，能够明显降低成本、简化工艺流程，提高产品产量和质量。
图是SDS-PAGE鉴定Protein A亲和层析柱纯化后的sSCF-Fc重组蛋白电泳结果图
具体实施例方式1.转染用质粒的制备用去除内毒素的质粒大提试剂盒(购自Qiagen公司)制备转染所需连有sSCF_Fc 基因的表达质粒pR-sSCF-Fc。方法见说明书。用200μ1 TE缓冲液溶解质粒，紫外分光光度计测其浓度。2.转染用PEI的制备1)在500ml的烧杯中倒入450ml Milli-Q制备的超纯水；2)天平称量500mg线性PEI (购自Poly Science公司)，加入烧杯中，磁力搅拌器不断搅动；3)逐滴加入预先配好的12M浓HCl使其pH < 2. 0 (大约需要800 μ 1)。搅动PEI 溶液约2-3小时；4)加入预先配制的IOM NaOH溶液将pH调至7.0 (大约需要500 μ 1)。用Milli-Q 超纯水将PEI溶液定容至500ml。5) 0. 22- μ m滤膜过滤PEI溶液，分装成Iml/管，-20C保存。3.质粒转染293T细胞
1)转染前1天(约24小时)，将293T细胞用无抗、含10%胎牛血清的DMEM完全培养基重悬，按照5 XlO5Ail铺入150mm培养皿中，每瓶加入25mL，5% C02培养箱中培养过夜；2)转染当天，将所需的Opti MEM培养基(或磷酸盐缓冲液)预热到25° _37°C。 冰上溶解连接SCF-Fc基因的表达质粒和PEl ；3)在 5ml 的 Ep 管中加入 2. 5ml Opti MEM/PBS,加入 43. 75 μ g 连有 sSCF-Fc 基因的质粒DNA(紫外分光光度计测其浓度后，加入洗脱缓冲液调整浓度至lug/ul)，在振荡器上轻轻涡旋；4)加入262. 5 μ L lmg/ml的PEI，立即在振荡器上振荡3次，每次3秒钟。室温下将混合液孵育15分钟；5)取出预先铺入培养皿的细胞，将DNA/PEI混合液加入细胞培养液中，，轻轻摇晃培养瓶混勻；将细胞放入培养箱中继续培养。4.表达产物收集及纯化1)转染6小时后，将细胞培养皿完全中培养基吸出，加入25ml无血清培养基(serum free media, SFM)。同时加入4mM L-谷氨酰胺的和ImM的丙酮酸钠后继续培养；2)转染后2天和4天分别换液并且加入新鲜的SFM及L-谷氨酰胺和ImM的丙酮酸钠。收集细胞上清(注意不要把细胞去掉)，12，000rpm/min离心IOmin去死细胞和细胞碎片；3)将上清与等体积的结合/漂洗缓冲液(0. 15M NaCl, 20mM Na2HPO4, pH8. 0)。与此同时，用超纯水洗涤蛋白纯化柱，再用Iml结合/漂洗缓冲液洗柱子；4)吸取Iml ProteinA的Resin加入纯化柱，使其中的液体流尽；加入5mL结合/ 漂洗缓冲液平衡柱子，使其流速为lml/min ；5)将稀释后的上清液上柱，调节流速为0. 5ml/min ；6) 20mL结合/漂洗缓冲液洗柱，调节流速为2ml/min ；7)最后用4X Iml 0. IM洗脱缓冲液(glycine，pH 2. 5)洗脱蛋白产物，用1. 5ml离心管收集液体，管中预先加入IlOul IM pH 8. 5的Tris-Cl调节pH值。紫外分光光度计及 SDS-PAGE测蛋白浓度及纯度见附图。
权利要求
1.一种用哺乳动物细胞大规模生产具有生物学活性SCF-Fc的蛋白的方法，其特征在于该方法通过如下步骤用哺乳动物细胞大规模生产具有生物学活性的SCF-Fc蛋白制备转染用质粒和PEI、质粒转染293T细胞和表达、蛋白纯化及等四个步骤。
2.如权利要求1所述的用哺乳动物细胞大规模生产具有生物学活性的SCF-Fc蛋白，特征在于所述的SCF-Fc是通过能稳定生产的哺乳动物细胞中制备纯化的。
3.如权利要求1所述的用哺乳动物细胞大规模生产具有生物学活性的SCF-Fc蛋白，特征在于所述的SCF-Fc的表达为分泌性的可溶性蛋白。
4.如权利要求1所述的用哺乳动物细胞大规模生产具有生物学活性的SCF-Fc蛋白，特征在于所述的SCF-Fc作为生物制剂应用于研究和临床诊断。
全文摘要
本发明涉及一种将人干细胞因子与人免疫球蛋白IgG1的Fc段融合基因(sSCF-Fc)转入哺乳动物细胞以大规模生产其蛋白产物的技术。本发明旨在建立用哺乳动物细胞大规模生产具有生物学活性的sSCF-Fc蛋白的方法。在工业生产中满足生产成本降低、简化工艺流程、提高产品产量和质量的总体要求。采用本方法，可以通过普通的大规模细胞培养获得大量高纯度高生物活性的sSCF-Fc蛋白。本项技术应用于sSCF-Fc蛋白的大规模生产，能够明显降低成本、简化工艺流程，提高产品产量和质量。
文档编号C12N15/62GK102344938SQ20111027437
公开日2012年2月8日 申请日期2011年9月16日 优先权日2011年9月16日
发明者周慧芳, 朱月珍, 杨宣武, 柴笑梅, 江永海, 王小娟 申请人:江苏普罗赛生物技术有限公司