专利名称：原核表达并纯化人源表皮生长因子(egf)的简便化工业技术的制作方法
技术领域：
本发明涉及原核表达并纯化人源表皮生长因子(EGF)的简便化方法。
背景技术：
表皮生长因子(Epidermal growth factor, EGF)是最早发现的生长因子，对调节细胞生长、增殖和分化起着重要作用。人源表皮生长因子蛋白由53个氨基酸残基组成，分子量为6千道尔顿，分子内有6个半胱氨酸组成的二硫键，形成生物活性所必需的受体结构域。表皮生长因子主要由颂下腺、十二指肠合成，广泛存在于体液和各种腺体中，其中乳汁、尿液、精液中含量较高，但在血清中的浓度较低。一系列的实验研究证明，表皮生长因子可刺激多种细胞的增殖，主要是表皮细胞、内皮细胞。表皮生长因子已经成功应用于角膜损伤、烧烫伤及手术等创面的修复和愈合。此外，表皮生长因子被用于生产抗衰老的化妆品和美容产品。同时，表皮生长因子还是无血清培养基的常见添加剂之一。Montalcini和 Cohen教授因发现表皮生长因子并分析其结构和作用机理，获得了 1986年的诺贝尔生理学及医学奖。表皮生长因子受体是一种糖蛋白，广泛分布于哺乳动物的上皮细胞、人成纤维细胞、胶质细胞，角质细胞等。EGF受体由细胞外结构域、跨膜区和细胞质结构域三个部分组成。细胞外结构域富含半胱氨酸(51个)，并形成多对二硫键，其上结合有糖基，是EGF结合的位点；细胞质结构域含有无活性的酪氨酸激酶和几个酪氨酸磷酸化的位点。表皮生长因子制剂最初从人尿液中分离纯化获得的。尽管可以采用这种方法获取少量表皮生长因子，但要如此进行大规模提取并不实际。如今，随着基因工程技术的发展， 表皮生长因子已经可以由多种细胞株中获得表达。但是，不管是从天然资源，还是来自基因工程细胞株发酵液，需要经过复杂的分离和纯化流程，才能获得少量相对较纯较低的产品， 使得其经济意义大为降低。
发明内容
本发明的目的在于实现人来源的表皮生长因子在原核细胞中的大量表达，并通过透析复性和简单的纯化步骤，获得有活性、纯度高的目的蛋白。在工业生产中满足生产周期短，生产成本低，产量高的总体要求。本发明通过体外PCR扩增的方法，从人表皮生长因子的cDNA中扩增得到EGF基因，并通过NcoI和EcoRI限制性酶切位点与表达载体pET-28a连接。随后将质粒转化入大肠杆菌BL21 (DE3)，诱导后目的蛋白以包涵体的形式过表达。溶菌酶加上超声破碎的方法使得包涵体能从大肠杆菌中彻底释放。在8M尿素溶液中溶解包涵体后，透过透析的方法逐步去除变性剂，最后在Tris-HCl溶液中透析复性。应用强阴离子交换树脂(SP-bestarose) 和分子筛对复性后的蛋白进行纯化，最终获得高纯度表皮生长因子。
图1是表皮生长因子5小时诱导表达SDS-PAGE电泳分析结果图(M为marker ；1 为诱导前，2为诱导5小时后。)图2是表皮生长因子超声细胞破碎SDS-PAGE电泳分析结果图(M为marker，1为上清，2为沉淀)电泳图中显示，表皮生长因子以包涵体形式过表达。图3是表皮生长因子SDS-PAGE电泳检测阴离子交换层析结果图A是阴离子交换层析收集组分还原条件下电泳图(1-12为第3至15管收集组分。M为marker)，B是B阴离子交换层析收集组分非还原条件下电泳图(1流穿液(还原条件)，2洗涤液(还原条件)， 3复性后表皮生长因子(还原条件)，M为marker，4复性后表皮生长因子，5流穿液(还原条件)，6-10分别是第3、6、9、12、15管收集组分)。图4是表皮生长因子Superdex 7510/300GL纯化峰图。图5是表皮生长因子分子筛纯化收集组分SDS-PAGE电泳结果图。(1_3分别对应图4中收集组分B8-B10)。图6是表皮生长因子SDS-PAGE分析纯化纯度结果图(1非还原条件，2还原条件)。
具体实施例方式1、重组表皮生长因子的原核表达编码人来源的EGF基因通过NcoI和EcoRI限制性酶切位点与表达载体pET_28a 连接。随后将质粒转化入大肠杆菌BL21 (DE3)。挑取单克隆并接入含有3ml LB和终浓度为100 μ g/ml卡那霉素的培养基中，摇床 37°C，250rpm培养约16小时。将上述菌液按1 200的比例接入含有200ml LB和终浓度为100 μ g/ml卡那霉素的培养基中，摇床37°C，250rpm培养至0D600约为0. 6，加入IPTG至终浓度为ImM，诱导 5小时之后收菌，离心，4000rpm，20min,弃上清，菌体_80°C保存。表皮生长因子诱导表达SDS-PAGE电泳分析结果见附图1 (M为marker ；1为诱导前，2为5h诱导后。)2、表皮生长因子的复性收集的菌体置于冰上融化，并按1 20(m/v)比例悬浮于裂解液(50mM Tris pH 8. 0,150mM NaCl,lmM PMSF, 5mM EDTA,)中，加入终浓度为lmg/ml的溶菌酶，置冰放置 30min。细胞经超声破碎仪裂解(450w，破碎9. 9s，停9. 9s，共15次)。离心13000rpm，30min。 收集上清和沉淀，SDS-PAGE电泳检测蛋白的可溶性(电泳结果显示该蛋白为包涵体表达)。表皮生长因子超声细胞破碎SDS-PAGE电泳分析结果见附图2 (M为marker ；1为上清；2为沉淀)。将所得包涵体用含有2% Triton X-100的裂解液洗涤两次，含有1 % Triton X-100的裂解液洗涤两次，最后再用裂解液洗涤一次去除Triton X-100。洗涤后的包涵体用20ml含20mM DTT和8M尿素的裂解液，室温溶解30min ；离心 (12000rpm,30min)去除不溶解的杂质。在含有2M、IM和0. 5M尿素的透析液(50mM TrispH 8. 4,150mM NaCl,5mM EDTA, 2. 5mM cysteine)中分别透析 24hr、4hr 和 4hr 去除尿素；最后在无尿素的透析液中透析24hr，使表皮生长因子复性形成二硫键和正确的构象。
权利要求
1.一种通过原核表达并纯化人源表皮生长因子(EGF)的简便化方法，其特征在于该方法通过如下步骤通过原核表达并纯化人源表皮生长因子(EGF)重组表皮生长因子的原核表达，表皮生长因子的复性，阴离子交换层析纯化目的蛋白，凝胶过滤层析进一步纯化目的蛋白
2.如权利要求1所述的通过原核表达并纯化人源表皮生长因子(EGF)的简便化方法， 特征在于所述人源表皮生长因子(EGF)是从大肠杆菌高效表达的包涵体中进行制备纯化的。
3.如权利要求1所述的通过原核表达并纯化人源表皮生长因子(EGF)的简便化方法， 特征在于所述人源表皮生长因子(EGF)的表达温度为37°C
4.如权利要求1所述的通过原核表达并纯化人源表皮生长因子(EGF)的简便化方法， 特征在于所述人源表皮生长因子(EGF)的纯化温度为室温或4°C。
5.如权利要求1所述的通过原核表达并纯化人源表皮生长因子(EGF)的简便化方法， 特征在于所述人源表皮生长因子(EGF)液氮冷激后于-80°C保存。
全文摘要
本发明涉及原核表达并纯化人源表皮生长因子(EGF)的简便化方法。本发明的目的在于实现人来源的表皮生长因子在原核细胞中的大量表达，并通过透析复性和简单的纯化步骤，获得有活性、纯度高的目的蛋白。在工业生产中满足生产周期短，生产成本低，产量高的总体要求。
文档编号C12N15/12GK102344924SQ201110274408
公开日2012年2月8日 申请日期2011年9月16日 优先权日2011年9月16日
发明者朱月珍, 杨宣武, 柴笑梅, 江永海 申请人:江苏普罗赛生物技术有限公司