一株蓝色犁头霉及其应用的制作方法

技术领域：

本发明属于微生物甾体转化技术领域，具体涉及一株蓝色犁头霉菌株及其在c11β-羟基化上的应用。

背景技术：
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甾体类药物具有重要的生理活性，是仅次于抗生素的第二大类药物。氢化可的松(hydrocortisone，简写hc)又称可的索(cortisol)、皮质醇，分子式c21h30o5，化学名称为11β,17α,21-三羟基孕甾-4-烯-3,20-二酮，分子量362.47，属肾上腺皮质激素类药，是目前激素类药物中产量最大的品种，具有抗炎、抗过敏等作用，临床上主要应用于替代治疗肾上腺皮质功能减退症。同时因为它对糖代谢有一定影响，也被用于葡萄糖、血糖过多症等疾病的治疗，在生产中还可作为许多甾体皮质激素药物的前体。

自1952年微生物法合成糖皮质激素并进入商业化以来，微生物转化已经成为诸多甾体药物或药物中间体合成路线中的关键技术，而氢化可的松的生产是利用微生物的11β-羟基化作用。对于合成甾体糖皮质激素来说，11β-oh是抗炎药物所必需的基团，现有的高级皮质激素药物都具有c11β-羟基。由于甾体c10位、c13位的甲基容易造成c11β-羟基的立体位阻比c11α-羟基大，并致使c11β-羟基化比c11α-羟基化效率低、副产物多，在一定程度上制约着它的大规模应用。

目前国内生产hc的11β-羟基化菌种主要是蓝色犁头霉(absidiacoerulea)，该菌以化合物rsa(化学名为17α-羟基-孕甾-4-烯-3,20-二酮-21-醋酸酯)为底物，经脱乙酰化(水解)生成rs(化学名为17α，21-二羟基-孕甾-4-烯-3,20-二酮)，rs再被c11β-羟化酶系催化生成hc(图1)。但由于蓝色犁头霉11β-羟化酶的专一性较差，副产物多，且投料浓度较低，hc的收率受到限制。因此选育出具有较高投料浓度和转化率，性状稳定的蓝色犁头霉菌种，对我国甾体微生物发酵具有重大意义。

技术实现要素：
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为了实现上述目的，本发明将提供一株蓝色犁头霉菌株，所述菌株是通过artp诱变与artp-licl复合诱变选育获得的一株能在高投料浓度下提高氢化可的松转化率的菌株。

所述蓝色犁头霉菌株具体为蓝色犁头霉(absidiacoeralea)al-172，该菌株已于2017年5月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号：cgmccno.14124。

本发明还提供一种利用上述蓝色犁头霉发酵生产氢化可的松的方法，具体如下：

将蓝色犁头霉(absidiacoeralea)al-172种子液以7-20％接种量转接入发酵培养基，28℃，180r/min发酵培养4-9h后，先使用0.1-1g/l的17α-羟基-孕甾-4-烯-3,20-二酮-21-醋酸酯(rsa)进行诱导，待培养ph至3.5-4.3时，调节发酵液ph至5.4-6.0，助溶剂溶解底物rsa后，向发酵培养基中投入浓度为1-6g/lrsa，转化26-57h；

优选地，转化时，向发酵培养基中投入rsa的浓度为5-6g/l；

优选地，所述1-6g/lrsa分两次投加，调节发酵液ph至5.4-6.0后，先投加0.5-4g/l，转化6-9h后再次调节发酵液ph至5.4-6.0，投加剩余的rsa底物，继续转化20-48h；

优选地，所述助溶剂为3-6％的乙醇,3-6％为乙醇在发酵体系中的终浓度；

优选地，所述助溶剂为5％的乙醇；

优选地，所述发酵培养基组分如下：玉米浆12g/l，葡萄糖10g/l，酵母粉2.5g/l，硫酸铵5g/l，水配制，ph6.5；

优选地，所述种子液的培养的条件如下：将蓝色犁头霉接种于种子培养基中，在温度25-29℃，转速150-200r/min的条件下培养ph到3.5-4.3，制得蓝色犁头霉种子液；

优选地，所述种子培养基组分如下：玉米浆12g/l，葡萄糖10g/l，酵母粉2g/l，硫酸铵5g/l，水配制，ph6.5。

有益效果：

本发明提供的蓝色犁头霉(absidiacoeralea)al-172能够有效提高蓝色犁头霉在氢化可的松转化中的底物投料浓度，5％乙醇助溶剂体系中底物rsa的投料浓度最高可达6g/l，比出发菌株的投料浓度(2.5g/l)提高了1.4倍。有效的解决了现有技术中高投料浓度对羟化酶活性的抑制问题，在提高投料浓度的同时不影响氢化可的松的最终转化率，最终实现70％以上转化率。而5g/l投料浓度下，出发菌株的hc转化率仅为42％。

附图说明：

图1蓝色犁头霉对化合物rsa的c11-羟基化反应过程示意图；

图2为artp诱变的致死率曲线；

图3为实施例3中诱变菌株对rsa转化的结果与原始菌株的比较。

具体实施方式：

为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利，并不用于限定本发明。

实施例1蓝色犁头霉菌株的诱变及筛选

(1)artp诱变

利用artp对蓝色犁头霉的孢子进行诱变，将斜面上的孢子洗下制成孢子悬液，调整孢子悬液浓度至1×10⁶个/ml。取10μl孢子悬液滴加在无菌载片上。选择致死率分别为84.73％，43.71％，26.65％时对应的照射时间50s、35s、30s作为诱变时间(图2)，将诱变后的孢子洗下涂布在平板上，挑取单菌培养，选取培养6d后菌落颜色较深、背面呈环状纹路、菌丝较密集的菌株进行复筛。得到转化率最高的菌株a-42，菌株的转化率提高至69.85％，较出发菌株的转化率增幅6.7％。以a-42作为artp-licl复合诱变的出发菌株。

(2)artp-licl复合诱变

采用30s、35s、55s三个artp照射时间下的a-42孢子混合液进行licl复合诱变。将孢子混合液梯度稀释后，涂布于含有1.5％，2％，2.5％licl的pda平板上进行复合诱变，1d后挑取单菌落至不含licl的pda平板上进行培养。选取培养6d后菌落颜色较深、背面呈环状纹路、菌丝较密集的菌株进行复筛。

(3)复合诱变菌株对rsa的转化

无菌水洗下斜面种子，制成3×10⁷个/ml的孢子悬浮液。取1ml孢子悬浮液接种于种子培养基中，于28℃、170r/min培养17h。按10％的接种量将种子接种于发酵培养基中，在同样条件下培养至ph降低至3.8左右时，调节ph至5.6，投入1.2ml底物rsa乙醇溶液(rsa终浓度为2.5g/l)，继续培养24h，取样测定hc转化率；

所述发酵培养基组分如下：玉米浆12g/l，葡萄糖10g/l，酵母粉2.5g/l，硫酸铵5g/l，水配制，ph6.5；

所述种子培养基组分如下：玉米浆12g/l，葡萄糖10g/l，酵母粉2g/l，硫酸铵5g/l，水配制，ph6.5；

菌株al-171、al-172、al-177对hc的转化能力最强，al-172菌株相比另两株诱变菌株转化率较高，且实验平行性较好，遗传稳定性较强。al-172菌株hc转化率达74.87％，比保藏菌株的转化率(62.41％)增幅19.96％。

表1不同传代次数artp-licl复合诱变菌株对hc的转化率(％)

实施例2蓝色犁头霉诱变菌株al-172对rsa的转化

(1)种子培养

将蓝色犁头霉接种于种子培养基中，在温度25℃，转速150r/min的条件下培养ph到3.5，制得蓝色犁头霉种子液。

所述种子培养基组分如下：玉米浆12g/l，葡萄糖10g/l，酵母粉2g/l，硫酸铵5g/l，水配制，ph6.5；

(2)发酵培养

种子液以7％接种量转接入发酵培养基，28℃，180r/min发酵培养4h后，先使用0.1g/l的rsa进行诱导，待培养ph至3.5时，调节发酵液ph至5.4，利用3％乙醇超声分散rsa，向发酵培养基中投入浓度为1.5g/lrsa，转化26h；

所述发酵培养基组分如下：玉米浆12g/l，葡萄糖10g/l，酵母粉2.5g/l，硫酸铵5g/l，水配制，ph6.5；

在本实施例中，rsa投料总浓度为1.5g/l，出发菌株的转化26h后，氢化可的松转化率为65.82％；诱变菌株al-172氢化可的松的转化率达到76.53％。

实施例3蓝色犁头霉诱变菌株al-172对高浓度rsa的转化

(1)种子培养

将蓝色犁头霉接种于种子培养基中，在温度25℃，转速150r/min的条件下培养ph到4.1，制得蓝色犁头霉种子液。

所述种子培养基组分如下：玉米浆12g/l，葡萄糖10g/l，酵母粉2g/l，硫酸铵5g/l，水配制，ph6.5；

(2)发酵培养

在种子液ph为4.1时，以10％接种量转接入发酵培养基，28℃，180r/min发酵培养后5h后用0.3g/l的rsa进行诱导，待培养ph至3.8时，调节发酵液ph至5.4，利用4％乙醇超声分散rsa，先投入4g/lrsa，转化6h后再次调节ph至5.4并将底物补齐至5g/l，进行转化36h。

所述发酵培养基组分如下：玉米浆12g/l，葡萄糖10g/l，酵母粉2.5g/l，硫酸铵5g/l，水配制，ph6.5；

在本实施例中，rsa投料总浓度为5g/l，出发菌株的转化36h后，底物rsa仍有10.27％剩余，氢化可的松转化率为42.81％，且副产物也较多；诱变菌株al-172转化36h后，氢化可的松的转化率达到74.56％(图3)。

实施例4蓝色犁头霉诱变菌株对高浓度rsa的转化

(1)种子培养

将蓝色犁头霉接种于种子培养基中，在温度29℃，转速200r/min的条件下培养ph到4.0，制得蓝色犁头霉种子液。

所述种子培养基组分如下：玉米浆12g/l，葡萄糖10g/l，酵母粉2g/l，硫酸铵5g/l，水配制，ph6.5；

(2)发酵培养

在种子液ph为4.0时，以15％接种量转接入发酵培养基，28℃，180r/min发酵培养后5h用0.7g/l的rsa进行诱导，待培养ph至4.0时，调节发酵液ph至5.6，利用5％乙醇超声分散rsa，先投入3g/lrsa，转化9h后再次调节ph至5.6并将底物总投料浓度补齐至6g/l，进行转化42h。诱变菌株al-172氢化可的松的转化率达到70.86％，出发菌株的hc转化率为40.35％。

实施例5蓝色犁头霉诱变菌株对高浓度rsa转化

(1)种子培养

将蓝色犁头霉接种于种子培养基中，在温度27℃，转速180r/min的条件下培养ph到3.8，制得蓝色犁头霉种子液。

所述种子培养基组分如下：玉米浆12g/l，葡萄糖10g/l，酵母粉2g/l，硫酸铵5g/l，水配制，ph6.5；

(2)发酵培养

在种子液ph为3.8时，以8％接种量转接入发酵培养基。28℃，180r/min发酵培养后7h用0.5g/l的rsa进行诱导，待培养ph至3.8时，调节发酵液ph至5.6，利用4％乙醇超声分散rsa，先投入2g/lrsa，转化6h后再次调节ph至5.6并将底物补齐至5g/l，进行转化40h。诱变菌株al-172氢化可的松的转化率达到72.39％，出发菌株hc的转化率为41.28％。

实施例6蓝色犁头霉诱变菌株对高浓度rsa转化

(1)种子培养

将蓝色犁头霉接种于种子培养基中，在温度26℃，转速170r/min的条件下培养ph到3.5，制得蓝色犁头霉种子液。

所述种子培养基组分如下：玉米浆12g/l，葡萄糖10g/l，酵母粉2g/l，硫酸铵5g/l，水配制，ph6.5；

(2)发酵培养

在种子液ph为3.5时，以20％接种量转接入发酵培养基。28℃，180r/min发酵培养后9h用1.0g/l的rsa进行诱导，待培养ph至4.3时，调节发酵液ph至6.0，利用4％乙醇超声分散rsa，先投入0.5g/lrsa，转化6h后再次调节ph至6.0并将底物补齐至5g/l，进行转化48h。诱变菌株al-172氢化可的松的转化率达到70.52％，出发菌株的hc转化率为39.42％。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以所附权利要求为准。