细柄棒束孢新菌种及其栽培方法和用途与流程

本发明涉及一种新菌种及其栽培方法和用途，具体涉及一种细柄棒束孢新菌种及其栽培方法和用途。

背景技术：

目前，食用菌的产业发展迅猛，我国食用菌年产量达到2000万吨以上，占全球75％以上，从业人员超过2000万人，食用菌产业在种植业中排在除了粮、棉、油、菜之后的第五位，超过了果、茶叶和蚕桑。其中，药用菌，如灵芝、虫草等及其加工产品等，产值每年高达数百亿。

随着人们生活水平的逐步上升，对于生活品质的要求更高，由于大型真菌富含具有营养及功能作用的各种成分，包括真菌多糖、三萜类、甾醇等，对于人体健康具有非常良好的作用，因此，日益受到人们的重视。

在食用菌产业蓬勃发展的今天，越来越多的珍稀食用菌品种逐渐进入人们的视野，一些原有的珍稀品种逐渐被驯化，如竹荪、茶薪菇、离褶伞、羊肚菌等。但是，还有大批的野生食药用菌并未能被人类认识，没有得到研究。

据研究，目前世界上约有150万种真菌物种，仅仅有1％的物种被认识，其中已知的大型真菌约14000种，而当中又只有80种左右的野生食药用菌被人类驯化，规模化栽培的品种更只有20多种。人类距离大型真菌的研究与利用还有相当长的道路要走。

技术实现要素：

在本发明的第一方面，提供一种细柄棒束孢新菌种，该新菌种在浙江乌岩岭国家级自然保护区双坑口保护站采集得到，经过形态学和分子生物学鉴定为细柄棒束孢新菌种，通过对子实体部分进行组织分离得到原始菌株，命名为细柄棒束孢isariatenuipeshmgim-w150712，已于2017年7月20日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称cctcc，地址为：武汉市洪山区八一路武汉大学)保藏编号为cctccno：m2017430。

经分子生物学测定其its分子序列的分析结果为细柄棒束孢isariatenuipes(亦名：蛾蛹虫草(无性型)cordycepspolyarthra)结合its分子序列比对结果和形态学观察，与现有的细柄棒束孢菌种相似度高达近100％。

进一步地，研究者对该菌种着生的昆虫的卵也进行了克隆测序，测序结果显示为双翅目昆虫。目前，对于已有的发现的细柄棒束孢，通常都是单生、丛生和簇生于寄生鳞翅目昆虫幼虫或茧上，其有性型归于高雄山虫草。而本发明的菌种并非寄生于鳞翅目昆虫幼虫或茧，而是寄生在双翅目昆虫的卵上，因此，本发明菌种是一种有性型新颖的细柄棒束孢菌种。

虫草是一类十分重要的药用真菌，是真菌寄生在昆虫幼虫上的子座及幼虫尸体的复合体。截止到目前，在国内正式报到的虫草菌共计147种，其具有药用价值，可以实现人工培养的虫草属真菌主要有冬虫夏草、蛹虫草、蝉花、巴西虫草、古尼虫草、九州虫草、蜂头虫草、双翅目虫草、大团囊虫草等。目前国际上的分类学者对于虫草的分类标准还未能达成完全一，如细柄棒束孢这类目前仅依据其无性型进行命名。

细柄棒束孢isariatenuipes，属于真菌界，子囊菌门，粪壳菌纲，虫草科，棒束孢属。其无性分生孢子体通常生于蛾蛹上，由多根孢梗束组成。早在1932年和1934年，日本学者就在米饭培养基上接种细脚棒束孢，成功培养出了高雄山虫草子实体，并首次提出细脚棒束孢是高雄山虫草的真正无性型，并且，目前的细柄棒束孢都仅发现在寄生鳞翅目昆虫幼虫或茧，认为是高雄山虫草的无性型。而本发明的菌种，并非寄生在鳞翅目昆虫幼虫或茧，而是寄生在双翅目昆虫的卵上，故它的有性型并非高雄山虫草，是一种新的菌种，目前未见发现和报道。

细柄棒束孢isariatenuipeshmgim-w150712的性状为：虫体被灰白色或白色菌丝包被，孢梗束高2-3.8cm，群生或近丛生，常有分枝，孢梗束柄纤细，黄白色、浅青黄色、蛋壳色至米黄色，部分偶带淡褐色，光滑，上部多分枝，白色，粉末状，分生孢子2-3*1.5-2μm，近球形至宽椭圆形。

本发明的第二方面，提供了一种上述细柄棒束孢新菌种(cctccno：m2017430)的人工栽培方法，作为一种珍稀食用菌，其人工栽培的成功，具有重要的经济价值和社会价值。

一种上述细柄棒束孢新菌种细柄棒束孢cctccno：m2017430的栽培方法，主要包括将分离母种，并纯化母种后，制备液体原种，将液体原种接种到栽培的培养基后，进行栽培管理，所述栽培管理的主要步骤包括：在20-25℃、空气相对湿度60-70％的条件下避光培养约3-4天，再于75-80％(例如80％)的空气相对湿度下，每天光照8-10小时(例如10小时)，12-15天发生原基，继续培养38-40天直至子座长度达14-16cm采收，其中，所述栽培的培养基成分包括：大米：营养液为1：1-1.2，所述每1l营养液包括：葡萄糖10-12g，优选10g，黄豆粉8-10g，优选8g，蚕蛹粉0.8-1g，优选1g，奶粉0.8-1g，优选1g，kh2po41-1.5g，优选1g，维生素b1微量。

优选的，一种上述细柄棒束孢新菌种细柄棒束孢cctccno：m2017430的栽培方法，主要包括将分离母种，并纯化母种后，制备液体原种，将液体原种接种到栽培的培养基后，进行栽培管理，所述栽培管理的主要步骤包括：在20-25℃、空气相对湿度60-70％的条件下避光培养约3-4天，再于80％的空气相对湿度下，每天光照10小时，12-15天发生原基，继续培养38-40天直至子座长度达14-16cm采收，其中，所述栽培的培养基成分包括：大米：营养液为1：1-1.2，所述每1l营养液包括：葡萄糖10g，黄豆粉8g，蚕蛹粉1g，奶粉1g，kh2po41g，维生素b1微量。

优选的，所述栽培管理的主要步骤包括：

(1)在20-25℃、空气相对湿度60-70％的条件下避光培养3-4天，此时菌丝已基本长到培养基底部；

(2)约3-4天后再于70％-80％的空气相对湿度条件下，每天光照8-10小时，12-15天发生孢梗束的原基；

(3)继续培养38-40天直至子座长度达14-16cm，采收。

优选的，上述步骤(1)的避光培养3-4天后，再向栽培袋中充入无菌空气/洁净空气，使栽培袋膨胀产生充裕空间，为子实体的生长发育创造良好的空间条件。

优选的，所述分离母种过程使用的分离母种培养基为综合pda培养基和蚕蛹粉，优选占pda培养基0.5-0.8％的蚕蛹粉。

在一个优选的实施例中，所述综合pda培养基包含以下重量百分比的组分：马铃薯20％、葡萄糖2％、琼脂2％、磷酸二氢钾0.3％、硫酸镁0.15％、维生素b1微量，其余为水。

在一个优选的实施例中，所述分离母种过程使用的分离母种培养基为马铃薯20％、葡萄糖2％、琼脂2％、磷酸二氢钾0.3％、硫酸镁0.15％、维生素b1微量、0.5％蚕蛹粉，其余为水。

优选的，所述分离母种步骤包括：将野生细柄棒束孢子实体的菌肉组织(例如0.2-0.5mm*0.2-0.5mm的菌肉组织)无菌接入分离母种培养基中，20-25℃暗培养，直至菌丝长满培养基，例如在一个优选的实施例中，将菌肉组织接入分离母种培养基斜面中，20-25℃暗培养，直至菌丝长满斜面。

其中，将野生细柄棒束孢子实体的菌肉组织接入分离母种培养基的一种方法可以为将采集回来的野生细柄棒束孢子实体在无菌条件下用75％酒精擦拭表面，撕开，以无菌方式将0.2-0.5mm*0.2-0.5mm的菌肉组织接入分离母种培养基。

优选的，所述纯化母种过程使用的纯化母种培养基为孟加拉红培养基和蚕蛹粉，优选占孟加拉红培养基0.5％的蚕蛹粉。

在一个优选的实施例中，所述孟加拉红培养基包含以下重量百分比的组分：蛋白胨0.5％、葡萄糖1％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁(mgso4·7h2o)0.05％、琼脂2％、1/3000孟加拉红溶液10％、氯霉素0.01％、其余为水。

在一个优选的实施例中，所述纯化母种培养基包含以下重量百分比的组分：蛋白胨0.5％、葡萄糖1％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁(mgso4·7h2o)0.05％、琼脂2％、1/3000孟加拉红溶液10％、氯霉素0.01％、0.5％蚕蛹粉，其余为水。

优选的，所述纯化母种步骤包括：将上述长满分离母种培养基中的菌种转接，于20-25℃暗培养，待菌丝生长而细菌尚未生长时对菌丝尖端进行挑取、转接。

优选的，所述制备液体原种的原种培养基包括以下重量百分比的组分：马铃薯20％、葡萄糖2％、磷酸二氢钾0.3％、硫酸镁0.15％、维生素b1微量、0.5％蚕蛹粉，其余为水。

上述原种培养基为液体培养基。

优选的，所述制备液体原种的步骤包括：将上述挑取的菌丝尖端，转接到原种培养基中，20-25℃摇床暗培养，待菌种长满培养基，得到液体原种。

优选的，上述摇床暗培养的转速可以为例如180rpm。

优选的，上述菌种长满培养基的时间约为3-4天。

优选的，上述原种培养基分装于250ml、500ml、1000ml的锥形瓶中。

优选的，将液体原种接种到栽培的培养基的步骤包括：将栽培的培养基制作栽培袋，再将液体原种稀释50-300倍，例如200倍后，再向栽培袋中接入液体原种，例如每个栽培袋接入10ml原种稀释液。

优选的，所述制作栽培袋的方法包括：向栽培袋中加入营养液，再加入大米，将袋口封闭(例如套上塑料环再扣上配套的盖子)，得到栽培袋，并灭菌，例如高温高压湿热灭菌。

进一步优选的，所述的栽培袋为聚丙烯菌种袋，例如17cm*35cm耐高温的透明聚丙烯菌种袋。

优选的，所述稀释方法包括：向液体原种中加入无菌水，得到稀释后的原种液。

在一个优选的实施例中，所述细柄棒束孢新菌种(cctccno：m2017430)的栽培方法，包括：

1、分离母种：将野生细柄棒束孢子实体的菌肉组织(例如0.2-0.5mm*0.2-0.5mm的菌肉组织)无菌接入分离母种培养基中，20-25℃暗培养，直至菌丝长满培养基，例如在一个优选的实施例中，将菌肉组织接入分离母种培养基斜面中，20-25℃暗培养，直至菌丝长满斜面；

2、纯化母种：将上述长满分离母种培养基中的菌种转接，于20-25℃暗培养，待菌丝生长而细菌尚未生长时对菌丝尖端进行挑取、转接；

3、制备液体原种：将上述挑取的菌丝尖端，转接到原种培养基中，20-25℃摇床暗培养，转速可以为例如180rpm，待菌种长满培养基，得到液体原种；

4、将液体原种接种到栽培的培养基：将栽培的培养基制作栽培袋，再将液体原种稀释50-300倍，例如200倍后，再向栽培袋中接入液体原种，例如每个栽培袋接入10ml原种稀释液；

5、栽培管理，包括：

(1)在20-25℃、空气相对湿度60-70％的条件下避光培养3-4天，此时菌丝已基本长到培养基底部；

(2)约3-4天后再于70％-80％的空气相对湿度条件下，每天光照8-10小时，12-15天发生孢梗束的原基；

(3)继续培养38-40天，直至子座长度达14-16cm，采收。

在另一个优选的实施例中，所述细柄棒束孢新菌种(cctccno：m2017430)的栽培方法，除包括上述方法步骤外，还包括培养基如下：

所述分离母种过程使用的分离母种培养基包括以下重量百分比组分：马铃薯20％、葡萄糖2％、琼脂2％、磷酸二氢钾0.3％、硫酸镁0.15％、维生素b1微量、0.5％蚕蛹粉，其余为水；

所述纯化母种培养基包含以下重量百分比的组分：蛋白胨0.5％、葡萄糖1％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁(mgso4·7h2o)0.05％、琼脂2％、1/3000孟加拉红溶液10％、氯霉素0.01％、0.5％蚕蛹粉，其余为水；

所述制备液体原种的原种培养基包括以下重量百分比的组分：马铃薯20％、葡萄糖2％、磷酸二氢钾0.3％、硫酸镁0.15％、维生素b1微量、0.5％蚕蛹粉，其余为水；

所述栽培的培养基成分包括：大米：营养液为1：1-1.2，所述每1l营养液包括：葡萄糖10-12g，优选10g，黄豆粉8-10g，优选8g，蚕蛹粉0.8-1g，优选1g，奶粉0.8-1g，优选1g，kh2po41-1.5g，优选1g，维生素b1微量。

本发明栽培得到的细柄棒束孢的子实体性状为：孢梗束高14-16cm，直径0.1-0.2cm，群生或近丛生，无分枝，孢梗束柄纤细，呈现浅黄色至黄色，光滑，上部多膨大。

与野生状态相比，在人工驯化栽培后子实体的长度大大增加。

在本发明的第三方面，本发明还提供一种上述细柄棒束孢新菌种细柄棒束孢cctccno：m2017430或细柄棒束孢cctccno：m2017430提取物在制备预防和/或治疗肿瘤药物中的用途。

优选的，所述肿瘤包括乳腺癌。

优选的，所述乳腺癌为肿瘤细胞mcf-7引起的乳腺癌。

优选的，所述细柄棒束孢cctccno：m2017430提取物为有机溶剂提取物，进一步优选为酯类提取物，例如乙酸乙酯提取物。

在一个优选的实施例中，提供了一种细柄棒束孢cctccno：m2017430乙酸乙酯提取物在制备预防和/或治疗肿瘤药物中的用途，肿瘤包括乳腺癌，例如抗肿瘤细胞mcf-7。

通过活性成分分析可以知道，本发明的细柄棒束孢cctccno：m2017430为高蛋白成分菌种，蛋白含量高达51.4g/100g，并且含有虫草素。

经过发明人反复试验研究，摸索得到了适合于本发明所述细柄棒束孢新菌种的栽培培养基和栽培方法，可成功实现细柄棒束孢的人工栽培，人工栽培后其子实体的长度较野生菌种大大增加，头潮生物转化率在33.36％左右，出菇期短。

附图说明

图1为实施例1的栽培得到的细柄棒束孢子实体；

图2为实施例2的野外采集的细柄棒束孢新菌种；

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明进行进一步说明。

实施例1

一、细柄棒束孢新菌种(cctccno：m2017430)的栽培方法，培养基如下：

分离母种培养基的组分(重量百分比)为：马铃薯20％、葡萄糖2％、琼脂2％、磷酸二氢钾0.3％、硫酸镁0.15％、维生素b1微量、0.5％蚕蛹粉，其余为水。

纯化母种培养基的组分(重量百分比)为：蛋白胨0.5％、葡萄糖1％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁(mgso4·7h2o)0.05％、琼脂2％、1/3000孟加拉红溶液10％、氯霉素0.01％、0.5％蚕蛹粉，其余为水。

原种培养基的组分(重量百分比)：马铃薯20％、葡萄糖2％、磷酸二氢钾0.3％、硫酸镁0.15％、维生素b1微量、0.5％蚕蛹粉，其余为水。

栽培的培养基的组分(重量体积比)：大米：营养液为1：1-1.2，每1l营养液组分：葡萄糖10g，黄豆粉8g，蚕蛹粉1g，奶粉1g，kh2po41g，维生素b1微量。

二、细柄棒束孢新菌种(cctccno：m2017430)的栽培方法，步骤如下：

1、分离母种：

将分离母种培养基组分，分装试管，在0.11mpa大气压、121℃高温高压湿热灭菌30min，取出冷却摆成斜面。采集回来的野生细柄棒束孢子实体在无菌条件下用75％酒精擦拭表面后，撕开，以无菌操作方式接入0.2-0.5mm*0.2-0.5mm的内部菌肉组织。置于25℃培养箱中恒温暗培养，待菌丝长满斜面后后则可进行转接，母种长满斜面的时间大概在10-15天之间。

2、纯化母种：

制作纯化母种培养基，分装试管，在0.11mpa大气压、121℃高温高压湿热灭菌30min，对于分离后在真菌菌丝边缘上长出半透明的细菌菌落，感染细菌的菌种进行转接，置于25℃培养箱中恒温暗培养，待菌丝生长而细菌尚未生长时进行尖端菌丝的挑取与转接。

3、制备液体原种：

制作液体原种培养基，分装250ml锥形瓶，在0.11mpa大气压、121℃高温高压湿热灭菌30min，取出冷却，无菌操作接入分离转接的菌种，置于25℃摇床中恒温暗培养，待原种长满培养基，原种长满的时间大概在3-4天之间。

4、将液体原种接种到栽培的培养基：

将培养液装入17cm*35cm耐高温的透明聚丙烯菌种袋，再装入大米。装好后在袋口套上塑料环，扣上配套的盖子，得到制好的人工驯化培养袋料。在0.147mpa大气压、128℃高温高压湿热灭菌30min，取出冷却后无菌操作接入稀释后的液体原种，稀释方法为用1％的无菌水将液体原种稀释至200倍，每袋接种量为10ml。接种后在25℃±1℃、空气相对湿度60-70％的培养室中避光培养。

5、栽培管理：

(1)、在20-25℃、空气相对湿度60-70％的条件下避光培养3-4天，此时菌丝已基本长到培养基底部，向栽培袋充入无菌空气(洁净空气)使聚丙烯栽培袋膨胀产生充裕空间，为子实体的生长发育创造良好的空间条件；

(2)、约3-4天后再于80％空气相对湿度的洁净培养房，每天光照10小时，12-15天发生孢梗束的原基；

(3)、继续培养38-40天直至子座长度达14-16cm，采收。

三、栽培结果如下：

1、出菇期：出菇期约2个月，可出菇1潮。

2、产量：每个菇袋所产棒束孢为19.35克，头潮生物转化率在33.36％左右。

3、栽培得到的子实体性状：孢梗束高14-16cm，直径0.1-0.2cm，群生或近丛生，无分枝。孢梗束柄纤细，呈现浅黄色至黄色，光滑，上部多膨大，如图1所示。

与野生状态相比，该菌种在人工驯化后子实体的长度大大增加。

实施例2菌种鉴定

于浙江乌岩岭国家级自然保护区双坑口保护站采集到本发明的菌种野生子实体，如图2所示，通过组织分离法得到其纯培养物，通过液体培养收集菌丝，低温(40℃)烘干，使用液氮研磨，利用ezup柱式真菌基因组dna抽提试剂盒，进行dna基因组的提取，得到的dna溶液。

通过真菌核糖体基因间隔区通用引物its1/its4(引物1its1:tccgtaggtgaacctgcgg，引物2its4:tcctccgcttattgatatgc，进行its-pcr实验，pcr反应液组成(共50μl)为：

反应条件为：

94℃反应5min；94℃反应1min，55℃反应1min，72℃反应1min，30个循环；72℃反应10min。

将得到的pcr扩展产物测序，得到its序列，结合its分子序列比对结果和形态学观察，与现有的细柄棒束孢菌种相似度高达近100％。分子生物学测定其its分子序列的分析结果为细柄棒束孢isariatenuipes。

实施例3

对实施例1的细柄棒束孢的有效成分分析

对实施例1得到的细柄棒束孢进行成分分析，同时采用来自于2008年《中国虫草》，由中国科学院西北高原生物研究所，青海省药品检验所编著的冬虫夏草的分析结果作为参考，检测结果及方法表1所示。

表1细柄棒束孢成分分析结果

由表1的活性成分分析可知，本发明的细柄棒束孢菌种蛋白质含量高达51.4g/100g是含有高蛋白成分的品种，高出冬虫夏草蛋白质含量1倍以上，而且含有冬虫夏草所不具有的虫草素。

实施例4细柄棒束孢菌种抑制肿瘤细胞功能

1、乙酸乙酯提取物的制备

(1)子实体的乙酸乙酯提取物

采用实施例1栽培得到子实体，将子实体进行超微粉碎后用乙酸乙酯浸泡，浸泡在10小时后超声提取，超声100min，提取两次，合并该两次有机相，将收集好的有机相进行抽滤后，将抽滤得到的液体用旋转蒸发仪旋蒸至无液滴状态，得到子实体的乙酸乙酯提取物。

(2)菌丝的乙酸乙酯提取物

将细柄棒束孢菌株进行液体发酵(如实施例1的步骤3的液体原种培养步骤)，收集菌丝体抽滤后60度烘干，烘干的菌丝体用乙酸乙酯浸泡，在10小时后超声提取，超声100min，提取两次，合并该两次的有机相，将收集好的有机相进行抽滤后，将抽滤得到的液体用旋转蒸发仪旋蒸至无液滴状态，得到菌丝的乙酸乙酯提取物。

2、肿瘤细胞培养

用含青霉素、链霉素和10％胎牛血清(fbs)的dmem培养液进行肿瘤细胞mcf-7(乳腺癌细胞)培养。将含有10％fbs的dmem细胞悬液接种于24孔组织培养板上，细胞浓度为1×10⁵cells/ml。将培养物置于37℃、5％co2的组织培养箱中培养4小时待用。

3、抑制肿瘤细胞实验

(1)样品配制

分别将子实体的乙酸乙酯提取物、菌丝的乙酸乙酯提取物用dmso溶解，配制成浓度为50mg/ml的母液，过滤后用含10％胎牛血清(fbs)的dmem培养液将母液分别稀释为25ug/ml，50ug/ml，75ug/ml，100ug/ml，150ug/ml和200ug/ml的样品溶液；作为参考对照，采用蛹虫草的乙酸乙酯提取物，同样操作，得到相同浓度的蛹虫草提取物样品溶液。

(2)培养

小心吸去24孔培养板里的细胞培养液，分别加入终浓度分别为25ug/ml，50ug/ml，75ug/ml，100ug/ml，150ug/ml和200ug/ml的两种样品溶液，每样品三个复孔。然后置于37℃、5％co2组织培养箱中培养48小时。

(3)结果观察及分析

培养结束后，收集细胞，与台酚蓝1：1混合进行拒染法染色。死细胞被染成蓝色，活细胞因有完整的细胞膜而未着色。用细胞计数器测定活细胞数。样品重复三次实验。使用spss.21专用统计软件进行统计，采用配对t检验，p<0.05具有显著性差异。

4、结果

计算0、100、200μg/ml细柄棒束孢子实体提取液，0、100、200μg/ml细柄棒束孢菌丝体提取液、0、100、200μg/ml蛹虫草提取液的细胞存活率，结果如表2所示。

经计算，细柄棒束孢的ic50值为66.42μg/ml。同样的，灵芝的乙醇提取物的ic50值在200-300μg/ml之间。

表2细柄棒束孢与蛹虫草抑制肿瘤细胞对比试验数据表

由表2可知，细柄棒束孢的体外抑制乳腺癌细胞的效果远胜于蛹虫草及灵芝。实验证明，细柄棒束孢体外抑制乳腺癌细胞的效果非常明显。

以上所述，仅为本发明的较佳的具体实施例，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围内。