本发明涉及一种具有降血糖作用的鱿鱼墨多糖寡糖的制备方法，属于鱿鱼下脚料鱿鱼墨的加工技术领域。
背景技术：
鱿鱼是世界上捕捞量最多的海洋水产资源之一，我国对鱿鱼的年捕捞量高达数十万吨。鱿鱼墨是鱿鱼加工产业的下脚料，约占鱿鱼体重的1.3％。鱿鱼墨在药用方面历史悠久，《本草拾遗》记载鱿鱼墨性惊、味涩、入心经、活血化淤、凉血止血。鱿鱼墨在日本作为一种重要的食品和保健品原材料被广泛利用，而我国目前对鱿鱼墨的利用率和高值化水平较低，鱿鱼墨中丰富的生物活性物质尚未得到较好的利用，既污染环境，又浪费资源。现代医学研究已证明，鱿鱼墨具有抗肿瘤、提高免疫力、抗炎症、抗辐射及促凝血等作用。因此，将鱿鱼墨进行精深加工，变废为宝，促进鱿鱼墨资源的高值化利用，具有较高的经济价值和社会效益。
鱿鱼墨多糖是鱿鱼墨中主要的功能性化合物之一，它是以与蛋白肽结合成肽多糖的形式存在，糖类部分主要含有等分子质量的葡萄糖酸、n-乙酰半乳糖胺、岩藻聚糖等；肽链部分的组成氨基酸包括：天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、丙氨酸。目前已证明鱿鱼墨多糖具有抗肿瘤、提高免疫力、抗胃溃疡、保护肠道黏膜等生物活性。目前对鱿鱼墨多糖的提取主要是利用酶解醇沉法，例如专利“一种鱿鱼墨汁多糖及其制备方法”，是利用脂肪酶和木瓜蛋白酶对鱿鱼墨汁进行复合酶解，再利用乙醇或丙酮对多糖进行沉淀或得多糖的方法。该方法的优点是分离和提取较简便，但酶解提取率并不高，蛋白去除不够彻底，另外还引入了化学纯的丙酮，有引入有机溶剂的风险。再例如论文《鱿鱼墨多糖和黑色素的研究》，是利用两次木瓜蛋白酶酶解，乙醇沉淀多糖，三氯乙酸脱除多余的蛋白，获得多糖。该方法的优点是经三氯乙酸脱除蛋白后，多糖产物中的蛋白含量明显减少，但酶解效率依然不高。此外，鱿鱼墨多糖的分子量较大，均分子量高达50～60kda，不利于人体吸收，在保证多糖链不变的情况下，将多糖降解为寡糖，可以极大的促进人体对寡糖的吸收利用。目前，尚无鱿鱼墨多糖寡糖的研究报道。
技术实现要素：
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的不足，提供一种方法简便，易进行生产控制，能避免有机溶剂引入带来的安全隐患，能提高寡糖被人体吸收的比例，增加鱿鱼墨多糖寡糖的比活性，提取率较高的具有降血糖作用的鱿鱼墨多糖寡糖的制备方法。
本发明的目的是通过如下技术方案来完成的，一种鱿鱼墨多糖寡糖的制备方法，它以鱿鱼墨汁为原料，所述的制备方法包括以下步骤：
(1)鱿鱼墨汁加入等体积的蒸馏水浸泡10～12h，4,500r/min离心10～15min，取上清液；沉淀部分加入2倍体积蒸馏水洗涤后，重复离心，合并两次离心的上清液；
(2)在取得的鱿鱼墨上清液中加入木瓜蛋白酶和中性蛋白酶进行复合酶解，并间歇式以超声波处理辅助酶；
(3)酶解反应结束后，95～100℃灭酶10min，7,500r/min离心15～20min以除去杂质，上清液中加入4～4.5倍体积的无水乙醇对鱿鱼墨多糖进行沉淀，静置30min，7,500r/min离心10～15min，取沉淀，沉淀溶解于10倍体积的10～12％的三氯乙酸溶液以除去多余蛋白质，室温下静置2h，7,500r/min离心10～15min，沉淀部分即为鱿鱼墨多糖；
(4)将鱿鱼墨多糖溶于水中，置于微波装置中，60～80℃温度下进行微波处理，400～600w处理10～20min。
(5)微波处理后的溶液进行超声波处理，50～60℃温度下处理时间50～70min，超声声场强度为200～400w/cm2，超声频率为20～25khz；所得溶液经1,000分子量透析袋透析除去小分子化合物，过8,000分子量截留量的pvdf膜以除去大分子化合物，真空冷冻干燥后，得鱿鱼墨多糖寡糖。
作为优选：所述的步骤(3)中，木瓜蛋白酶加入量为12,000～16,000u/l鱿鱼墨汁上清液，中性蛋白酶加入量为5,000～9,000u/l鱿鱼墨汁上清液，酶解温度40～60℃，ph值7～9，酶解反应时间3～5h；酶解反应开始，每隔1h以超声波辅助酶解5～30min，超声声场强度为60w/cm2，超声频率为20～25khz。
本发明以鱿鱼墨汁为原料，采用酸性蛋白酶酶解法酶解鱿鱼墨汁，并利用超声波间歇式辅助酶解，乙醇沉淀法获得鱿鱼墨多糖，三氯乙酸脱除蛋白。获得的鱿鱼墨多糖经微波与超声波先后处理，破坏糖链的糖苷键，获得分子量较小、易于人体吸收、活性较强的鱿鱼墨多糖寡糖，利用膜分离去除活性较低和分子量较大的成分，进一步提高了鱿鱼墨多糖寡糖的纯度和比活力。这将大大提高鱿鱼墨的应用价值，有效增加鱿鱼加工下脚料的经济价值，促进鱿鱼加工产业的发展。
与现有技术相比，本发明的突出优点在于：
1、利用超声波辅助复合酶酶解法分离鱿鱼墨多糖，酶解效率高，方法简便，易进行生产控制，且避免了有机溶剂的引入带来的安全隐患。
2、通过超声波-微波联合降解法打破糖苷键，降解鱿鱼墨多糖为寡糖，对产物结构破坏小，无副反应，反应温和，易于控制寡糖的分子量。
3、按照现有科研成果可知：本发明所得的鱿鱼墨多糖寡糖与天然鱿鱼墨多糖相比较，因其分子量低，而更有利于人体吸收，降血糖生物活性也表明，本发明所得的鱿鱼墨多糖寡糖比本发明所得的鱿鱼墨多糖具有更强的生物活性，可应用于相应的保健品、功能食品或医用配方食品等行业，具有极高的社会、经济意义和应用潜力。
具体实施方法
以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。一种鱿鱼墨多糖寡糖的制备方法，它以鱿鱼墨汁为原料，所述的制备方法包括以下步骤：
(1)鱿鱼墨汁加入等体积的蒸馏水浸泡10～12h，4,500r/min离心10～15min，取上清液；沉淀部分加入2倍体积蒸馏水洗涤后，重复离心，合并两次离心的上清液；
(2)在取得的鱿鱼墨上清液中加入木瓜蛋白酶和中性蛋白酶进行复合酶解，并间歇式以超声波处理辅助酶；
(3)酶解反应结束后，95～100℃灭酶10min，7,500r/min离心15～20min以除去杂质，上清液中加入4～4.5倍体积的无水乙醇对鱿鱼墨多糖进行沉淀，静置30min，7,500r/min离心10～15min，取沉淀，沉淀溶解于10倍体积的10～12％的三氯乙酸溶液以除去多余蛋白质，室温下静置2h，7,500r/min离心10～15min，沉淀部分即为鱿鱼墨多糖；
(4)将鱿鱼墨多糖溶于水中，置于微波装置中，60～80℃温度下进行微波处理，400～600w处理10～20min。
(5)微波处理后的溶液进行超声波处理，50～60℃温度下处理时间50～70min，超声声场强度为200～400w/cm2，超声频率为20～25khz；所得溶液经1,000分子量透析袋透析除去小分子化合物，过8,000分子量截留量的pvdf膜以除去大分子化合物，真空冷冻干燥后，得鱿鱼墨多糖寡糖。
所述的步骤(3)中，木瓜蛋白酶加入量为12,000～16,000u/l鱿鱼墨汁上清液，中性蛋白酶加入量为5,000～9,000u/l鱿鱼墨汁上清液，酶解温度40～60℃，ph值7～9，酶解反应时间3～5h；酶解反应开始，每隔1h以超声波辅助酶解5～30min，超声声场强度为60w/cm2，超声频率为20～25khz。
实施例1
(1)鱿鱼墨汁加入等体积的蒸馏水浸泡10h，4,500r/min离心15min，取上清液；沉淀部分加入2倍体积蒸馏水洗涤后，重复离心，合并两次离心的上清液。
(2)在取得的鱿鱼墨上清液中加入木瓜蛋白酶和中性蛋白酶进行复合酶解，并间歇式以超声波处理辅助酶。其中，木瓜蛋白酶加入量为14,000u/l鱿鱼墨汁上清液，中性蛋白酶加入量为7,000u/l鱿鱼墨汁上清液，酶解温度55℃，ph值7.5，酶解反应时间5h；酶解反应开始，每隔1h以超声波辅助酶解10min，超声声场强度为60w/cm2，超声频率为20～25khz。
(3)酶解反应结束后，95～100℃灭酶10min，7,500r/min离心15min以除去杂质，上清液中加入4倍体积的无水乙醇对鱿鱼墨多糖进行沉淀，静置30min，7,500r/min离心15min，取沉淀，沉淀溶解于10倍体积的12％的三氯乙酸溶液以除去多余蛋白质，室温下静置2h，7,500r/min离心15min，沉淀部分即为鱿鱼墨多糖。
(4)将鱿鱼墨多糖溶于水中，置于微波装置中，70℃温度下进行微波处理，500w处理15min，
(5)微波处理后的溶液进行超声波处理，55℃温度下处理时间60min，超声声场强度为300w/cm2，超声频率为20～25khz。所得溶液经1,000分子量透析袋透析除去小分子化合物，过8,000分子量截留量的pvdf膜以除去大分子化合物，真空冷冻干燥后，得鱿鱼墨多糖寡糖。
实施例1(3)中，以获得的鱿鱼墨多糖比鱿鱼墨中实际多糖量计算，鱿鱼墨多糖提取率为92.4％。实施例1(5)中，以获得的分子量1,000～8,000da鱿鱼墨多糖寡糖比鱿鱼墨多糖计，寡糖制备得率为81.1％。
实施例2
为验证实施例1步骤(2)中木瓜蛋白酶的加入量对鱿鱼墨多糖提取率的影响，围绕不同的木瓜蛋白酶的加入量，设计单因素实验，其余同实施例1，从而获得对应的鱿鱼墨多糖提取率，如表1所示。
表1不同木瓜蛋白酶加入量对于鱿鱼墨多糖提取率
由表4可以发现，木瓜蛋白酶加入量在12,000～14,000u/l变化时，所得鱿鱼墨多糖提取率呈增加趋势，木瓜蛋白酶加入量在14,000～16,000u/l变化时，鱿鱼墨多糖提取率基本不变，且所得鱿鱼墨多糖提取率约为92.4％。
实施例3
为验证实施例1步骤(2)中中性蛋白酶的加入量对鱿鱼墨多糖提取率的影响，围绕不同的中性蛋白酶的加入量，设计单因素实验，其余同实施例1，从而获得对应的鱿鱼墨多糖提取率，如表2所示。
表2不同中性蛋白酶加入量对于鱿鱼墨多糖提取率
由表2可以发现，中性蛋白酶加入量在5,000～8,000u/l变化时，所得鱿鱼墨多糖提取率呈增加趋势，中性蛋白酶加入量在8,000～9,000u/l变化时，鱿鱼墨多糖提取率基本不变，且所得鱿鱼墨多糖提取率约为93.5％。
实施例4
为验证实施例1步骤(2)中酶解温度对鱿鱼墨多糖提取率的影响，围绕不同的酶解温度，设计单因素实验，其余同实施例1，从而获得对应的鱿鱼墨多糖提取率，如表3所示。
表3不同酶解温度对于鱿鱼墨多糖提取率
由表3可以发现，酶解温度在40～50℃变化时，所得鱿鱼墨多糖提取率呈增加趋势，酶解温度在40～50℃变化时，鱿鱼墨多糖提取率基本不变，且所得鱿鱼墨多糖提取率约为92.3％。
实施例5
为验证实施例1步骤(2)中酶解ph值对鱿鱼墨多糖提取率的影响，围绕不同的ph值，设计单因素实验，其余同实施例1，从而获得对应的鱿鱼墨多糖提取率，如表4所示。
表4ph值对于鱿鱼墨多糖提取率
由表4可以发现，ph值在7～7.5变化时，所得鱿鱼墨多糖提取率呈增加趋势，酶解温度在7.5～8变化时，鱿鱼墨多糖提取率基本不变，且所得鱿鱼墨多糖提取率约为92.4％酶解温度在8～9变化时，鱿鱼墨多糖提取率呈下降趋势。
实施例6
为验证实施例1步骤(2)中酶解时间对鱿鱼墨多糖提取率的影响，围绕不同的酶解时间，设计单因素实验，其余同实施例1，从而获得对应的鱿鱼墨多糖提取率，如表5所示。
表5不同酶解时间对于鱿鱼墨多糖提取率
由表5可以发现，酶解时间在3～4h变化时，所得鱿鱼墨多糖提取率呈增加趋势，酶解时间在3～4h变化时，鱿鱼墨多糖提取率基本不变，且所得鱿鱼墨多糖提取率约为92.3％。
实施例7
为验证实施例1步骤(2)中超声辅助酶解时间对鱿鱼墨多糖提取率的影响，围绕不同的超声波时间，设计单因素实验，其余同实施例1，从而获得对应的鱿鱼墨多糖提取率，如表6所示。
表6不同酶解温度对于鱿鱼墨多糖提取率
由表6可以发现，超声辅助酶解时间在5～10min变化时，所得鱿鱼墨多糖提取率呈增加趋势，超声辅助酶解时间在10～15min变化时，鱿鱼墨多糖提取率基本不变，且所得鱿鱼墨多糖提取率约为92.5％，超声辅助酶解时间在15～30min变化时，鱿鱼墨多糖提取率急速下降，可能是由于超声时间过长破坏了酶的结构。
实施例8
为验证实施例1步骤(4)中微波处理因素对制备获得的鱿鱼墨多糖寡糖得率的影响，围绕步骤(4)中的温度、处理时间和微波强度的三个因素，设计三因素三水平正交实验，其余同实施例1，从而获得对应的鱿鱼墨多糖寡糖得率量，如表7所示。
表7不同温度、处理时间和微波强度的微波处理所得鱿鱼墨多糖寡糖得率
由表7可以发现，温度70℃、处理时间15min，强度为500w的微波处理与温度70℃、处理时间25min，强度为400w的微波处理；温度80℃、处理时间15min，强度为400w的微波处理；温度80℃、处理时间25min，强度为600w的微波处理，所得鱿鱼墨多糖寡糖得率相当，在正交实验中最高，约为81.4％。
实施例9
为验证实施例1步骤(5)中超声波处理因素对制备获得的鱿鱼墨多糖寡糖得率的影响，围绕步骤(5)中的温度、处理时间和超声声场强度的三个因素，设计三因素三水平正交实验，其余同实施例1，从而获得对应的鱿鱼墨多糖寡糖得率，如表8所示。
表8不同温度、处理时间和超声声场强度的超声波处理所得鱿鱼墨多糖寡糖得率
由表8可以发现，温度60℃、处理时间70min，声场强度为400w/cm2的超声波预处理下，鱿鱼墨多糖寡糖得率最高，为82.3％。
实施例10
为验证鱿鱼墨多糖寡糖的降血糖活性，利用高脂饲料饲喂法建立了c57bl/j小鼠高血糖模型，每天分别饲喂鱿鱼墨多糖和鱿鱼墨多糖寡糖80mg/kgbodyweight，持续进行13周，检测小鼠空腹血糖、糖化血红蛋白和口服葡萄糖耐受量变化情况，从而获得鱿鱼墨多糖寡糖的降血糖活性，如表9所示。
表9鱿鱼墨多糖寡糖对高血糖小鼠空腹血糖和糖化血红蛋白的作用
注：##p﹤0.01，与正常组比较；*p﹤0.05，**p﹤0.01，与模组比较。