一种肾癌预后评估生物标志物及其检测试剂和应用的制作方法

本发明涉及医学生物检测技术领域，具体涉及一种肾癌预后评估生物标志物及其检测试剂和应用。

背景技术：

肾癌是一种高度异质性的肿瘤，即使临床分期相同的患者，预后也存在显著差异。早期肾癌患者根治术后，20-30％的病人最终会出现复发转移，进展期肾癌患者5年生存率不到30％。如果能够对早期肾癌患者进行准确、有效地预后评估，将可以辅助临床实践选择、指导患者复查周期，实现对肿瘤进展早发现、早治疗。因此，筛选鉴定新的、有效的肾癌预后分子标志物，特别是早期肾癌，具有重要的临床意义。

长链非编码rna(longnon-codingrna,lncrna)是长度大于200个核苷酸的非编码rna，其表达具有明显的组织和细胞特异性，作用方式多样，可以从表观遗传、转录、翻译等多个水平对基因表达进行调控。lncrna能够广泛地参与细胞分化、个体发育等生命过程，其异常表达与包括肿瘤在内的多种人类重大疾病密切相关。lncrna是近年来肿瘤研究的热点，其具有高度的器官特异性，因此lncrnas有望成为肾癌患者预后判定的生物学标志物，为肿瘤标志物研究开辟了一个全新的突破口，为肾癌预后评估提供新方向。lncrna作为肾癌预后标志物的价值至今尚未见大样本多中心研究报道。

血清学标志物的筛选鉴定和在疾病诊断、预后判定、疗效评估中的应用一直是医学领域的研究热点。非编码rna作为血清学标志物的研究取得了很大进展，例如已有多种microrna被发现可以用于疾病的诊断、预后及疗效评估。但是，lncrna在血清学标志物中的应用研究还非常少。lncrna作为肾癌血清学预后标志物的价值至今尚未见文献报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种长链非编码rnarecal(lncrna-recal)的新用途。

本发明的另一个目的在于提供一种检测血清中lncrna-recal的试剂盒。

在前期的研究中，本发明人利用国际上三组不同种族的大规模肾透明细胞癌转录组测序数据(americacohortfromtcgaproject,n＝530(参见文献cancergenomeatlasresearchnetwork.comprehensivemolecularcharacterizationofclearcellrenalcellcarcinoma[j].nature,2013,499(7456):43)；japancohortfromegas00001000509,n＝100(参见文献satoy,yoshizatot,shiraishiy,etal.integratedmolecularanalysisofclear-cellrenalcellcarcinoma[j].naturegenetics,2013,45(8):860-867)；europecohortfromicgcproject,n＝91(参见文献scelog,riazalhosseiniy,gregerl,etal.variationingenomiclandscapeofclearcellrenalcellcarcinomaacrosseurope[j].naturecommunications,2014,5:5135))，结合临床预后信息，通过单因素cox回归分析筛选出与肾癌预后具有显著相关性的lncrnas，最终筛选出一条在三个肾癌队列中均与患者总体生存率具有显著相关性的lncrna(ensg00000238113)，由于该lncrna尚未报道，我们将其命名为renalcancerassociatedlncrna(recal)。进一步地，本发明人利用长期随访的、来自三个独立队列(changhaicohort(n＝1326),长征队列(n＝353),南京队列(n＝229))的1908例肾癌患者，对lncrna-recal作为肾癌预后标志物的效能进行了验证。以上结果提示lncrna-recal可以作为肾癌预后评估判断的生物学标志物。

为评估lncrna-recal的预后分层价值，我们根据美国梅奥医院(mayoclinic)制订的ssign危险评分系统，依据肿瘤分期(stage)、大小(size)、分级(grade)和坏死(necrosis)情况(参见文献zigeunerr,huttererg,chromeckit,etal.externalvalidationofthemayoclinicstage,size,grade,andnecrosis(ssign)scoreforclear-cellrenalcellcarcinomainasingleeuropeancentreapplyingroutinepathology[j].europeanurology,2010,57(1):102-111)，将每个队列分为3个亚组，即ssign0-3(低风险组)、ssign4-7(中风险组)、ssign>8(高风险组)，对每个亚组进行kaplan-meier曲线分析，发现在低风险组，lncrna-recal表达对肾癌预后的区分能力最显著。以上结果提示lncrna-recal表达在低风险肾癌患者中的预测价值更大，提示lncrna-recal可以作为早期肾癌的预后标志物，具有重要临床意义。

进一步地，本发明人建立了人血清中lncrna-recal的检测方法和提供了血清中lncrna-recal检测的试剂盒，通过对肾癌病人术前血清的检测，我们首先发现在血清中能够检测到lncrna-recal，并且术前血清中的lncrna-recal含量高的肾癌患者预后更差，提示lncrna-recal可以作为肾癌血清学预后标志物。

因此，我们认为，lncrna-recal具备作为肾癌预后评估血清学标志物的可能性。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

lncrna-recal在制备评估肾癌预后的检测试剂或试剂盒中的应用，其特征在于其在用ensemble数据库中的登录号为ensg00000238113。

所述的lncrna-recal优选在制备评估肾癌预后的血清学检测试剂或试剂盒中的应用。

检测所述的lncrna-recal的引物、探针或基因芯片。

引物优选自p1、p2、p3、p4中的任意一对，优选p1；其中，p1由seqidno.1所示的上游引物和seqidno.2所示的下游引物组成；p2由seqidno.3所示的上游引物和seqidno.4所示的下游引物组成；p3由seqidno.5所示的上游引物和seqidno.6所示的下游引物组成；p4由seqidno.7所示的上游引物和seqidno.8所示的下游引物组成。

所述的引物、探针或基因芯片在制备评估肾癌预后的检测试剂或试剂盒中的应用，优选在制备评估肾癌预后的血清学检测试剂或试剂盒中的应用，进一步优选在制备评估早期肾癌预后的血清学检测试剂或试剂盒中的应用。

一种评估肾癌预后的试剂盒，该试剂盒用于检测生物样本中lncrna-recal。

该试剂盒优选通过逆转录、实时定量pcr技术检测生物样品中lncrna-recal的表达量。

该试剂盒优选包括：上述的对lncrna-recal具有检测特异性的探针、基因芯片，或pcr引物；进一步优选引物p1、p2、p3、p4；最优选p1。

所述的生物样品优选选自：获自对象的新鲜组织或细胞、福尔马林固定或石蜡包埋组织或细胞、血液或体液；进一步优选血清。

在本发明的一种实施方式中，该试剂盒的组成包括：

1.逆转录系统

由逆转录体系缓冲液、随机引物n6、dntps、逆转录酶和rna酶抑制剂组成；

2.引物系统

由1对real-timepcr的上、下游引物组成，引物序列如下：

上游引物为：gttgcggttggttggc(seqidno:1)；

下游引物为：tttcttgaatctgtgctggtc(seqidno:2)；

引物由上下游引物等量混合至5μm。

3.扩增系统

由sybrpremixextaq^tm试剂组成。

上述用于检测血清中lncrna-recal的试剂盒的检测方法，具体步骤如下：

按常规方法抽血并取血清，富集血清中的rna；

由逆转录系统将rna逆转录成cdna；

用扩增系统进行real-timepcr扩增，测定lncrna-recal的含量。

本发明所述的肾癌为肾透明细胞癌。

有益效果：

本发明的lncrna-recal可以作为肾癌预后评估的血清学标志物，本发明为肾癌患者预后评估提供了新的临床指标和手段。

附图说明

图1为组织中lncrna-recal表达水平与三个筛选队列中肾癌患者总体生存率的相关性；左为美国队列，中为日本队列，右为欧洲队列。

图2为组织中lncrna-recal表达水平与三个验证队列中肾癌患者肿瘤特异性生存率的相关性；左为长海队列，中为长征队列，右为南京队列。

图3为组织中lncrna-recal表达水平与两个验证队列中肾癌患者无进展生存率的相关性；左为长海队列，右为长征队列。

图4为组织中lncrna-recal表达水平与长海队列中不同亚组肾癌患者肿瘤特异性生存率的相关性；左为低风险组，中为中风险组，右为高风险组。

图5为组织中lncrna-recal表达水平与长征队列中不同亚组肾癌患者肿瘤特异性生存率的相关性；左为低风险组，中为中风险组，右为高风险组。

图6为组织中lncrna-recal表达水平与南京队列中不同亚组肾癌患者肿瘤特异性生存率的相关性；左为低风险组，中为中风险组，右为高风险组。

图7为组织中lncrna-recal表达水平与长海队列中不同亚组肾癌患者无进展生存率的相关性；左为低风险组，中为中风险组，右为高风险组。

图8为组织中lncrna-recal表达水平与长征队列中不同亚组肾癌患者无进展生存率的相关性；左为低风险组，中为中风险组，右为高风险组。

图9为4对引物检测lncrna-recal在血清中的表达量；

图10为血清中lncrna-recal表达水平与肾癌患者肿瘤特异性生存率的相关性；

具体实施方式

现结合实施例和附图，对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。

实施例1：lncrna-recal的筛选

为了筛选预测肾癌预后风险的lncrna，我们首先利用国际上三组不同种族的大规模肾透明细胞癌转录组测序数据(americacohortfromtcgaproject,n＝530；japancohortfromegas00001000509,n＝100；europecohortfromicgcproject,n＝91)，结合临床预后信息，通过单因素cox回归分析筛选出与肾癌预后具有显著相关性的lncrnas，共29条。随后，我们分别以每条lncrna的表达值中位数为界，将每个队列分为高低表达两组，进行log-rank分析，最终筛选出一条在三个肾癌队列中均与患者总体生存率具有显著相关性的lncrna(ensg00000238113)，由于该lncrna尚未报道，我们将其命名为renalcancerassociatedlncrna(recal)(见图1)。

实施例2：lncrna-recal的组织学验证

我们利用长期随访的、来自三个独立队列(长海队列(n＝1326),长征队列(n＝353),南京队列(n＝229))的1908例肾癌患者，对lncrna-recal作为肾癌预后标志物的效能进行了验证。通过realtime-pcr技术检测肿瘤组织中lncrna-recal的表达水平，以表达丰度中位数分为高低表达两组，结果表明高表达lncrna-recal的肾癌患者的肿瘤特异性生存率更低(长海队列:p<0.001,hazardration[hr]＝2.313[1.887–2.834],长征队列:p<0.001,hr＝2.368[1.519–3.691],南京队列:p<0.001,hr＝2.546[1.563–4.147]，见图2)，出现肿瘤进展的时间更短(长海队列:p<0.001,hr＝2.312[1.934–2.763],长征队列:p<0.001,hr＝2.694[1.817–3.996]，见图3)。这些结果提示lncrna-recal可能作为肾癌患者预后评估的标志物。

实施例3：lncrna-recal对早期肾癌的预后评估价值

我们根据美国梅奥医院(mayoclinic)制订的ssign危险评分系统，依据肿瘤分期(stage)、大小(size)、分级(grade)和坏死(necrosis)情况[16]，将每个队列分为3个亚组，即ssign0-3(低风险组)、ssign4-7(中风险组)、ssign>8(高风险组)，对每个亚组进行kaplan-meier曲线分析，发现在低风险组，lncrna-recal表达对肾癌预后的区分能力最显著(见图4-6,css；长海队列log-rankp＝8.64e-20；长征队列log-rankp＝5.75e-5；nanjingcohortlog-rankp＝0.002；见图7-8,pfs；长海队列log-rankp＝1.94e-24；长征队列log-rankp＝3.74e-7)，而对高风险组肾癌患者预后的预测能力较差(见图4-6,os；长海队列log-rankp＝0.104；长征队列log-rankp＝0.075；nanjingcohortlog-rankp＝0.803；见图7-8,pfs；长海队列log-rankp＝0.035；长征队列log-rankp＝0.088)。以上结果表明，lncrna-recal对低风险肾癌的预后评估效能更显著，提示其可作为早期肾癌的预后标志物。

实施例4：血清样本的采集、处理及提取其中的小rna

(1)血清样本收集：收集约2ml肾癌患者术前的外周血放入含edta的抗凝管中,静置约1小时。

(2)血清样本处理：采集的外周血样品4000rpm4℃离心10min，取上清分装于ep管中，-80℃保存。

(3)提取血清中rna：每个血清样品均取350μl，按照从ambion公司购买的mirvana^tmparis^tmkit提取rna。

(4)逆转录成cdna：每个样品取相同量rna，用随机引物n6进行逆转录。按照5×m-mlvrtbuffer5μl、m-mlvreversetranscriptase1μl、rrnasin0.5μl(promega公司)、dntps1μl、随机引物n61μl、提取的小rna15ul、depc水(补充h2o使总体积达到25μl)进行逆转录。以上步骤所用的tip头、ep管均经过rna酶灭活处理。

实施例5：引物设计与筛选

(1)引物设计：利用ncbi查得lncrna-recal的全长序列(nr_121647.1)，针对lncrna-recal的序列利用primerpremier5软件设计real-timepcr的上下游引物4对(如表1所示)，由invitrogen公司负责引物合成。

表1：用于检测血清中lncrna-recal设计的4对引物

(2)引物筛选：采用takara公司的sybrpremixextaq^tm试剂和美国appliedbiosystems公司的viia7dx实时定量pcr仪，按照下述体系进行pcr反应：

pcr条件：

按照上述real-timepcr条件，利用3例前期制备的血清样本逆转录产物对4对lncrna-recal引物进行检测。每个样本均做2个复孔，取其平均值分析。

结果4对引物均能检测出信号，且溶解曲线为单峰，其中第1对引物扩增的片段的表达量明显高于其它引物(见图9)，将pcr产物送公司测序，测序结果经比对确实为lncrna-recal。

因此，本发明经过筛选提供了最优化的1对用于检测血清中lncrna-recal的real-timepcr引物，序列如下:

上游引物为：gttgcggttggttggc(seqidno.1)；

下游引物为：tttcttgaatctgtgctggtc(seqidno.2)；

实施例6：lncrna-recal的血清学检测

按照实施例4、5相同的方法，对以往收集的52例肾癌患者术前血清进行lncrna-recal检测，根据lncrna-recal表达值分为高低表达组，结果发现术前血清中的lncrna-recal含量高的肾癌患者预后更差(见图9)，提示lncrna-recal可以作为肾癌预后评估的血清学标志物，也提示lncrna-recal在肿瘤血清学标志物中的应用前景。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

序列表

<110>中国人民解放军南京军区南京总医院

<120>一种肾癌预后评估生物标志物及其检测试剂和应用

<160>8

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>16

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

gttgcggttggttggc16

<210>2

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

tttcttgaatctgtgctggtc21

<210>3

<211>17

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

aaccagccccttcctcg17

<210>4

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

ggttgtccctccttgttgc19

<210>5

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

atttgtccccagtgccttat20

<210>6

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

agcaatcccaccacttttct20

<210>7

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

tcggaagaggtgggatgc18

<210>8

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

cctgataccaaagccttttctc22