本发明属于微生物技术领域，具体涉及了一种用于降低鸡粪堆肥氨气产生的复合微生物菌剂及其制备方法。
背景技术：
随着我国畜牧业规模化、设施化程度不断提高，畜禽养殖规模逐渐扩大，因此带来的畜禽粪污集中处理和资源化利用成为目前畜禽养殖面临的问题。畜禽粪便好氧堆肥处理时，产生大量臭气，影响周围居民的生活和身体健康，是目前畜牧养殖企业被投诉的热点。由于鸟类的生理结构与哺乳动物存在差异，具有消化道短，饲料中营养物质利用程度低和不排尿等特点，因此，规模化养鸡过程废水产量少，粪便含氮量高于其他畜种。鸡粪的好氧堆肥是鸡粪集中处理的有效方式，鸡粪堆肥所产生的臭气由一百多种成分构成，包括氨气、硫化氢、氮氧化物、挥发性有机物(voc)等，这些臭气成分是微生物发酵粪便中有机质的代谢产物。
氨气是鸡粪堆肥所产臭气的主要成分之一，其浓度高，是我国恶臭受控物质之一。目前，脱除氨气的主要方法有物理法、化学法和生物法。其中物理法主要包括水吸收法、吸附法、扩散稀释法等；化学法主要采用化学洗涤法；生物法主要采用生物过滤法等。
堆肥过程中产生的氨氮(nh3-n)多以离子态氨(nh4+)和非离子态氨(nh3)两种形式存在于堆肥环境中。生物脱氨以自然界中分离的氨氮降解微生物为基础，利用微生物的代谢特点，将溶解在水中的nh3-n吸附并吸收进入体内，进行氮素转化，从而降低堆体中nh3-n含量，减少氨气释放。其中氮素转化途径是利用硝化细菌将溶解于水中nh3-n氧化成no3--n，之后利用反硝化细菌将no3--n还原成n2或n2o。生物脱氨具有经济、高效、无二次污染等特点，是有效的脱除氨氮方法，对其研究也备受重视。
近几年来，功能微生物菌剂在环保领域得到广泛应用，但仍存在许多问题，由于堆肥过程是一个变温过程，单一微生物菌种受到生长温度的限制，不能在整个堆肥变温过程中保证脱臭效果。而多菌复合的微生态制剂(如em菌)，由于菌种种类多样，堆肥过程中氨气的去除效率有限。实践证明，针对某种特定污染物的复合功能菌剂具有更好的使用效果。在畜禽粪便臭气处理中，专利201010201488.6申请公开了一种适用于养猪场的生物除臭剂，该除臭剂优选了粉红掷孢酵母、植物乳杆菌和细黄链霉菌三个菌种，并通过活化、一级扩大、二级扩大、摇床扩大、配制、检测、液体包装等步骤制成，该生物除臭剂在养猪场施用具有显著的除臭效果。专利201110242979.x申请公开一种用于牛粪堆肥减少氨释放和保氮的复合菌剂，该除臭剂优选了普利茅斯沙雷氏菌、鞘氨醇单胞菌、产碱杆菌，并通过一定比例的复配获得了一种用于牛粪堆肥减少氨释放和保氮的复合菌剂，菌剂适用于在牛粪堆肥处理中。专利201610240599.5申请公开一种除臭有机堆肥发酵菌剂及其应用，该除臭剂包含毕赤酵母菌剂、假单胞杆菌菌剂、米根霉菌菌剂和那不勒斯硫杆菌菌剂，菌剂使用降低堆料中nh4+-n的含量，并提高肥料肥力。由于鸡具有消化道短、粪尿合一的特殊排泄方式，导致其排泄物浓稠，营养物质丰富，氮含量高，有研究表明鸡粪发酵液中的nh4+-n是牛粪的15倍，猪粪的4倍，鸡粪中的固有菌群也与其他畜种粪便存在差异，且目前尚未见有用于降低鸡粪堆肥发酵过程氨气释放的高效复合微生物菌剂。
技术实现要素：
本发明针对畜禽粪便集中处理过程中的臭气问题，提供一种用于降低鸡粪堆肥氨气释放的微生物复合菌剂。本发明从鸡粪和以鸡粪为原料的堆肥样品中，通过人工驯化、条件富集和脱氨氮能力筛选获得多株脱氨氮(nh3-n)菌株，并通过研究其生物特性与复配后的氨气脱除效果，从而提供了一种新的微生物复合菌剂。
为实现上述发明目的，本发明所采用的技术解决方案为：从鸡粪堆肥样品中，分离并筛选多株具有氨氮降解能力的菌株，根据获得菌株的降解氨氮(nh3-n)能力、适宜生长温度和生物学特性，挑选三株细菌，对其进行鉴定及16srdna序列分析。根据菌属特点，将三株细菌分别命名为成团泛菌pantoeaagglomeranshaas-1、努比卤地无氧芽孢杆菌anoxybacillusrupiensishaas-2和产气肠杆菌enterobacteraerogeneshaas-3，并于2017年9月22日将其保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号，武汉大学保藏中心，保藏编号分别为：成团泛菌haas-1，cctccno：m2017526；努比卤地无氧芽孢杆菌haas-2，cctccno：m2017527；产气肠杆菌haas-3，cctccno：m2017528。
成团泛菌pantoeaagglomeranshaas-1,革兰氏阴性细菌，以周生鞭毛运动，能产生黄色素，兼性厌氧，是具有代谢和发酵类型的化能异养菌，发酵d-葡萄糖和其它糖类可产酸，氧化酶阴性，接触酶阳性，吲哚阴性，其16srdna如seq.id.no1所示。
努比卤地无氧芽孢杆菌anoxybacillusrupiensishaas-2，革兰氏阳性菌，兼性厌氧，可发酵乳糖、葡萄糖、海藻糖等多种糖类，氧化酶阴性，过氧化氢酶阳性，吲哚阴性，甲基化试验阴性，其16srdna如seq.id.no2所示。
产气肠杆菌enterobacteraerogeneshaas-3为革兰氏阴性的兼性厌氧杆菌，为肠内细菌，不产胞子且具有小的荚膜，其有周鞭毛，可以活动，其16srdna如seq.id.no3所示。
本发明通过试验分析了上述成团泛菌、努比卤地无氧芽孢杆菌和产气肠杆菌在不同温度(30℃和60℃)下的生长情况，以及菌株在筛选培养基中的氨氮降解情况。研究显示，成团泛菌haas-1和产气肠杆菌haas-3适宜生长温度为30℃，努比卤地无氧芽孢杆菌haas-2在30℃和60℃条件下均可扩大培养，60℃为其适宜生长温度。筛选培养基c/n以25:1时，成团泛菌haas-1、努比卤地无氧芽孢杆菌haas-2和产气肠杆菌haas-3在适宜生长温度下，72h氨氮的降解效率分别为32.2％、44.7％和46.1％。
一种用于降低鸡粪堆肥氨气释放的复合微生物菌剂，由团泛菌haas-1、努比卤地无氧芽孢杆菌haas-2和产气肠杆菌haas-3复合而成，成团泛菌haas-1、努比卤地无氧芽孢杆菌haas-2和产气肠杆菌haas-3的菌体体积比为1～3:1～3:1～3。
优选地，如上所述的一种用于降低鸡粪堆肥氨气释放的复合微生物菌剂，该复合微生物菌剂中成团泛菌haas-1、努比卤地无氧芽孢杆菌haas-2和产气肠杆菌haas-3的菌体体积比为2:2.5:1.5。
优选地，如上所述的一种用于降低鸡粪堆肥氨气释放的复合微生物菌剂，成团泛菌haas-1、努比卤地无氧芽孢杆菌haas-2、产气肠杆菌haas-3分别于2017年9月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号分别为：cctccno：m2017526，cctccno：m2017527；cctccno：m2017528。
一种用于降低鸡粪堆肥氨气释放的复合微生物菌剂的制备方法，将成团泛菌haas-1、产气肠杆菌haas-3和努比卤地无氧芽孢杆菌haas-2分别置于lb液体培养基中，在200rpm，适宜培养温度下震荡培养24h，至细菌悬液od值为0.8～1.0，菌体浓度＞108cfu/ml时，将三种菌体以体积比1～3:1～3:1～3混合。
上述复合菌剂的制备时所采用的lb液体培养基的组分及配比为：tryptone(胰蛋白胨)，10g；yeastextract(酵母提取物)，5g；nacl，10g；蒸馏水1000ml。lb液体培养基的ph值7.0-7.2。
本发明还涉及一种用于降低鸡粪堆肥氨气释放的复合微生物菌剂的应用，包括如下步骤：鸡粪与谷壳(秸秆)等辅料以3:1比率混匀，获得堆肥发酵原料，向发酵原料中添加复合菌剂，混匀后进行堆肥发酵；利用复合菌剂降解氨氮的能力以及不同菌株对温度的适应性来降低堆体中的氨氮含量，当复合菌剂添加量为堆料重量的2.5％时，可使鸡粪好氧堆肥氨气产生量下降68.4％。堆肥发酵原料的c/n比控制在20-30:1，含水量控制在55％-65％之间；复合菌剂使用对翻堆没有特别的要求，保证具有维持堆肥中微生物菌种活力所需的氧气即可，也可参照实施例中的翻堆频率。
本发明与现有技术相比较，具有如下显著优点：本发明的复合菌剂，各菌种之间合理配伍，共生协调，互不拮抗，其应用于鸡粪堆肥过程，能显著降低氨气排放，环保、有效地减少了堆肥过程中的臭气量，使用方便，且本发明的复合菌剂制备方法简便、易行，适合生产。
附图说明
附图1为本发明所述的各菌株单菌株降解氨氮能力随时间变化折线图1。
附图2为本发明所述的各菌株菌落形态结构及光学显微镜(油镜)下的结构。
附图3为本发明所复合菌剂进行鸡粪堆肥发酵试验时,氨气产量随时间变化折线图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规化试剂商店购买得到的。下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。以下实施例中，用于制备各个培养基的水均为去离子水。以下实例中，培养基配制完成后均在121℃温度下湿热灭菌30min。
实施例1成团泛菌haas-1、努比卤地无氧芽孢杆菌haas-2和产气肠杆菌haas-3的驯化、分离、纯化、筛选及鉴定
一、菌株的驯化、分离和纯化
1、菌株的驯化
在武汉市江夏区某建有鸡粪槽式堆肥无害化处理设备的某规模化养鸡场，采集鲜鸡粪、不同堆肥时期(升温期、高温期和腐熟期)的发酵料各50ml，将样品混合后取30ml，置于密闭的高氨气浓度环境，对样品中的微生物进行驯化，驯化期为15d。驯化过程中，每日对样品进行翻动，同时通过水分添加保持样品湿度。
2、常温脱氨氮菌株及高温脱氨氮菌株的富集
将所驯化的样品置于装有灭菌玻璃珠及100ml灭菌蒸馏水的锥形瓶内，于30℃，150r/min震荡2h，打散菌胶团，静置20min后，取2份上清液，各5ml分别接种于装有50ml富集培养基的2个锥形瓶中。富集培养样品，2份样品分别在30℃，150r/min的条件下和60℃，150r/min的条件下，恒温水浴摇床培养2天，取1ml培养液再次接种于富集培养基中，如此连续富集5代。
其中富集培养基成分为：葡萄糖10.0g，(nh4)2s042.0g，nacl1.0g，mgs04·7h201.0g，k2hp04·2h201.0g，fes04·7h200.4g，微量元素溶液1.0ml，水1000ml，ph值7.2-7.4。
微量元素溶液：edta10.0g，znso41.2g，cacl21.5g，mncl2·4h2o1.0g，feso4·h2o2.0g，(nh4)6mo7o24·4h2o1.0g，cuso4·5h2o1g，cocl2·6h2o1.0g，水1000ml，ph值7.2-7.4。
3、菌株的分离纯化
取富集培养至第5代的培养液1ml于1.5ml的离心管中，按10-1浓度梯度分别稀释至10-2、10-3、10-4、10-5，后取200μl，涂布于分离平板上，分别取上述四种稀释后的培养液50μl用无菌涂布棒涂布于lb固体培养基，根据富集温度条件培养24h后观察菌落形态特征，挑取生长快、菌落大、数量多的菌落，采用三线法进行纯化，纯化3代后，分别进行4℃斜面保存，另取菌液置于lb液体培养基中扩培,并在-20℃冰箱中甘油保存备用。
其中lb固体培养基：agar(琼脂粉)15g；tryptone(胰蛋白胨)，10g；yeastextract(酵母提取物)，5g；nacl，10g；蒸馏水1000ml。
lb液体培养基：tryptone(胰蛋白胨)，10g；yeastextract(酵母提取物)，5g；nacl，10g；蒸馏水1000ml。
二、菌株的筛选
菌株筛选采用纳氏试剂比色法：取1ml菌液并接种于100ml筛选培养基，60℃条件富集获得的菌株于60℃、150r/min条件下培养3d，30℃条件富集获得的菌株于30℃、150r/min条件下培养3d，每隔12小时采用纳氏试剂分光光度法检测培养基中nh4+-n浓度。通过筛选获得haas-1、haas-2、haas-3等多株具有高氨氮降解能力的菌株，haas-1、haas-2和haas-3的氨氮降解能力如图1所示。
三、菌株的鉴定
1、将haas-1、haas-2和haas-3菌株接种在lb固体培养基平板上，观察菌落形态特征。haas-1、haas-2和haas-3菌株的菌落见图2(a1/a2/a3)，100倍显微镜放大照片见图2(b1/b2/b3)。
2、将haas-1、haas-2、haas-3菌株进行分子生物学鉴定：16srdna测序方法，提取细菌基因组dna后进行16srdna序列扩增，用于扩增的pcr反应引物为通用引物：正向引物5’-gagcggataacaatttcacacagg-3’；反向引物5’-cgccagggttttcccagtcacgac-3’。pcr反应体系如下：模板dna1μl，25μltaq酶混合液，2μl正向引物，2μl反向引物，加入无菌去离子水至50μl。pcr扩增条件：94℃预变形5min，之后94℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸90s，经过35次循环后，72℃延伸7min。将获得片段用于高通量测序。haas-1、haas-2和haas-3测序结果参见seq.id.no1、seq.id.no2和seq.id.no3。
实施例2通过本实施例对复合菌剂使用的具体实施方式进行更为详细的说明，但是本发明不限于本实施例。
实施例中所使用的成团泛菌haas-1、努比卤地无氧芽孢杆菌haas-2和产气肠杆菌haas-3均为自主分离筛选获得。菌株的活化及扩大培养均采用lb液体培养基，其组成成分参照具体实施方式一。
一、菌种的活化、扩大培养与复配
1、菌种的活化：将保存的成团泛菌pantoeaagglomeranshaas-1、努比卤地无氧芽孢杆菌anoxybacillusrupiensishaas-2和产气肠杆菌enterobacteraerogeneshaas-3分别接种到装有100mllb培养基的250ml锥形瓶中，接种量为1％。培养条件：成团泛菌pantoeaagglomeranshaas-1和产气肠杆菌enterobacteraerogeneshaas-3，培养温度30～35℃，180rad/min摇床培养；努比卤地无氧芽孢杆菌anoxybacillusrupiensishaas-2培养温度55～60℃，180rad/min恒温水浴摇床培养。
2、菌种的扩大培养，将经活化的三个菌种的培养液分别接种于lb培养基中，扩大培养过程中按1～5％的体积比转接，当发酵液中有效活菌数达到108cfu/ml时终止培养。发酵温度及条件与扩大培养温度条件相同。
3、复合菌剂的制备：将扩大培养得到的三个菌种的发酵液按成团泛菌haas-1、努比卤地无氧芽孢杆菌haas-2和产气肠杆菌haas-3体积份数比1～3:1～3:1～3混合，即得到本实施方式的用于减少鸡粪堆肥氨气释放的复合菌剂。
二、复合菌剂的使用
鸡粪与谷壳以重量比3:1比率混匀，获得堆肥发酵原料，向发酵原料中添加由成团泛菌haas-1、努比卤地无氧芽孢杆菌haas-2和产气肠杆菌haas-3以体积份数比2:2.5:1.5混合制备的复合微生物菌剂，按有机物料重量的2.5％添加复合菌剂并搅拌均匀，呈三角锥型堆放于有顶棚的开放式厂房内，作为实验组。准备相同体积的鸡粪与谷壳以重量比3:1比率混匀。堆肥的前10天每天对物料进行翻堆，保证物料堆的氧气含量，并控制温度在65℃以下。
nh3释放量的高峰出现在第4天，其峰值为217mg·m-3；而不接种复合菌剂的堆肥对照组，nh3释放量的高峰也出现在第4天，其峰值为529mg·m-3。在堆肥发酵的前15天，接种复合菌剂的实验组比未接种复合菌剂的对照组的nh3总释放量降低65％以上(见图3)。以上数据可以说明，本实施例表明，本专利所发明的复合菌剂可大幅度降低堆肥过程中nh3的释放量、减少鸡粪堆肥的氨气污染。
序列表
<110>湖北省农业科学院畜牧兽医研究所
<120>一种用于降低鸡粪堆肥氨气释放的复合微生物菌剂及其制备方法和应用
<160>5
<210>1
<211>1438
<212>dna
<213>成团泛菌（pantoeaagglomeranssp.）haas-1
<400>1
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<213>产气肠杆菌（enterobacteraerogenes）haas-3
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