本发明属于生物工程技术领域，涉及工业微生物的育种，特别是一种高产核酸的酿酒酵母工程菌。
背景技术：
核酸酵母工业是我国新兴产业。核糖核酸(简称核酸,rna)广泛应用于食品工业、医药工业和农业生产上。在食品工业方面,核酸是开发新型食品调味品必不可少的原料。风行世界的第二代味精(强力味精)、第三代味精(风味味精)、特鲜酱油等新型调味品,都是核酸及其衍生物应用的结果。在医药工业上,核酸是制造治疗冠心病、肿瘤、心肌梗塞等疾病药物的原料。在农业上,核酸及其衍生物广泛用作农作物(如水稻、瓜果、豆类等)的生长促进物质。
酿酒酵母胞内rna主要包括：信使rna，核糖体rna，转运rna和非编码rna。其中核糖体rna是其中含量最多的一类rna，占rna总量的82％左右，也是其中相对分子质量最大的一类rna。所以增加胞内核糖体rna的产量或者生成速率是一种有效的选育高核酸酿酒酵母的方法。
近年来随着对食品安全性的考虑，越来越多的研究集中在选育高核酸酿酒酵母的工作方面，而非假丝酵母等不属于gras(generallyrecognizedassafe)的菌株。
杨依顺,丁玥,曹静,等.酿酒酵母发酵制备rna的研究[j].药物生物技术,2013(4):310-313.利用氯化钾敏感性，通过des化学诱变，筛选一株酿酒酵母，rna含量提高了25％。
文章chuwattanakulv,kimyh,sugiyamam,etal.constructionofasaccharomycescerevisiaestrainwithahighlevelofrna.[j].journalofbioscience&bioengineering,2011,112(1):1通过敲除酿酒酵母中rrn10基因，然后通过ems诱变筛选获得回复突变株，最后通过在突变株内整合表达rrn10基因，获得高产核酸的酵母菌株，使核酸含量提高了30％。
文章petersonmr,emrsd.theclasscvpscomplexfunctionsatmultiplestagesofthevacuolartransportpathway.[j].traffic,2001,2(7):476-486，曾经公开了液泡蛋白分选受体pep1(也称为vps10或vpt1)的功能，指出其在蛋白质分泌过程中起到非常关键的作用。其主要涉及可溶性cpy蛋白从液泡前的细胞器(例如核内体)到液泡之间的运输。文章marcusson,ericg,horazdovsky,etal.thesortingreceptorforyeastvacuolarcarboxypeptidaseyisencodedbythevps10gene[j].cell,1994,77(4):579中指出：亚细胞分级的方法将pep1(也称为vps10或vpt1)基因定位于高尔基体后期，用于从核内体到高尔基体的蛋白质分选。在酿酒酵母中pep1蛋白处于细胞质尾部结构域，通过从高尔基体到核内体的反复循环执行多轮分选：蛋白片段cpy的分选信号pep1蛋白与p2pcy相互作用，形成受体——配体复合体，该复合体被包装成小泡，pep1蛋白释放p2pcy，然后受体pep1回到高尔基体继续新一轮的分选，cpy前体物继续被运输到液泡，直到其活性形成。当pep1缺失时，虽然cpy蛋白质从内质网运输到高尔基体的过程是连续的，但是由于缺少细胞质的尾部结构受体，因此cpy前体物质被分泌到内质网，并不能被运输到液泡，进而不能激活其活性，从而影响细胞的生理活性。
目前本技术领域针对于液泡蛋白分选受体的研究基本关注于该蛋白的功能性对于细胞生理活性的影响。
技术实现要素：
本发明的目的是解决产核酸酵母菌株菌种性能低，核酸产量低的问题，提供一株高产核酸的酿酒酵母。
为解决上述技术问题，本发明技术方案如下：
一株高产核酸酿酒酵母工程菌，是以酿酒酵母菌为出发菌株，通过基因工程手段过表达液泡蛋白分选受体基因pep1(也称为vps10或vpt1)得到，所述pep1基因序列如seqidno.1所示。
所述pep1基因的geneid为：852264。
进一步地，所述高产核酸酿酒酵母工程菌是通过构建强启动子与液泡蛋白分选受体基因pep1以及筛选标记基因的连接片段，通过同源重组的方法，将连接片段以rdna非转录间隔区域1(nts1)作为插入位点整合到宿主菌酿酒酵母的基因中，从而获得重组工程菌。
进一步地，所述rdna为酿酒酵母25srdna(geneid:9164935)、5.8srdna(geneid:9164934)、18srdna(geneid:9164923)序列，rdna核酸序列见核酸序列表seqidno.2。
优选地，所述出发菌株为酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)w303a。
优选地，所述强启动子为强启动子pgk1。
优选地，所述筛选标记基因为kan基因片段。
优选地，所述宿主菌为酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)w303a。
本发明的另一目的在于提供上述高产核酸酿酒酵母工程菌的构建方法，具体步骤如下：
(1)将强启动子pgk1连接到载体质粒yep352上，得到重组质粒yep352-pgk1；
(2)以酿酒酵母w303a的总dna基因组为模板，pcr扩增，得到pep1基因片段，将pep1基因片段连接到重组质粒yep352-pgk1上，得到重组质粒yep352-pgk1-pep1；
(3)以重组质粒yep352-pgk1-pep1为模板经pcr扩增，得到强启动子pgk1和pep1连接片段；
(4)以出发酿酒酵母菌株w303a基因组为模板pcr得到插入位点rdna非转录间隔区域1的上游同源臂和下游同源臂；
(5)将步骤(3)(4)中得到的片段以及筛选标记kan片段通过醋酸锂转化法转化到出发酿酒酵母菌株中，其中上游同源臂、kan片段、pgk1和pep1连接片段、下游同源臂顺序连接，并筛选得到多拷贝表达pep1基因的工程菌。
进一地，所述步骤(1)中，所述上游同源臂为rdna-a片段，所述下游同源臂为rdna-b片段。
优选地，所述带有筛选标记的kan片段的获得方法为：以质粒puc6为模板pcr得到筛选标记基因kan片段。
本发明的另一目的是提供将上述高产核酸酿酒酵母工程菌应用于生产核酸中的用途。
优选地，所述高产核酸酿酒酵母工程菌的发酵方法如下：
种子液培养：将菌泥从斜面上挑取一环，将酿酒酵母工程菌接种到ypd培养基试管中，28-30℃、180-190rpm条件下培养10-12h，得到种子液；
发酵培养：将种子液按照接种量3-5％(体积百分比)接种于ypd液体培养基中，28-30℃、180-190rpm条件下发酵培养4h。
上文中，所述整合位点参照文章如下：
sunh,zangx,liuy,etal.expressionofachimerichuman/salmoncalcitoningeneintegratedintothesaccharomycescerevisiae,genomeusingrdnasequencesasrecombinationsites[j].appliedmicrobiology&biotechnology,2015,99(23):10097-106.
有益效果：
1、而到目前为止，现有公开文献中还并未涉及蛋白分选受体pep1与核酸高产的关系、二者是否存在关联性等问题。而本发明提供的高产核酸酿酒酵母工程菌能够在保持良好发酵性能的前提下，多拷贝过表达液泡蛋白分选受体基因pep1，意外获得了显著提高核酸产量的技术效果。不仅克服了产核酸酵母菌株菌种性能低的问题，显著提高其生长性能与发酵活力，同时显著提高了核酸的产量。
2、本发明选育得到的酿酒酵母核酸生成量明显提高。在经过摇瓶发酵验证后，过表达pep1菌株核酸含量达到了14.70％，出发菌株w303a核酸含量为9.32％，提高了57.72％。
附图说明
图1是目的片段以及重组质粒构建验证电泳图；其中，图(a)中m为marker，1为pgk启动子电泳条带；图(b)中m为marker，1为质粒yep352-pgk的pcr验证条带；图(c)中，m为marker，1为pcr扩增得到的pep1基因；(d)图，m为marker，1为将片段pep1连接到yep352-pgk1上的pcr验证电泳图(重组质粒yep352-pgk1-pep1)；
图2目的片段的电泳图，其中m泳道为10000bpdnamarker，1泳道是rdna-b片段电泳条带，1084bp；2泳道是kan片段电泳条带，1613bp；3泳道是启动子与pep1连接片段电泳条带，6512bp；4泳道是rdna-a片段电泳条带，1462bp；
图3是目的片段与酵母基因组同源重组示意图，其中(1)所示为出发酿酒酵母菌株单倍体基因组；
图4是构建成功的酿酒酵母工程菌验证电泳图，其中m泳道为5000bpdnamaker，1泳道为验证引物m1-u/m1-d的pcr产物，2泳道为验证引物m2-u/m2-d的pcr产物；
图5是过表达pep1菌株与出发菌株的生长曲线。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
本发明所使用的酿酒酵母是可以采用任何来源的酿酒酵母工程菌。
实施例1yep352-pgk-pep1质粒构建(以下所述的强启动子pgk1即包括pgk1启动子(pgk1p)和pgk1终止子(pgk1t)片段)
以含有pgk1的质粒为模板，(例如以申请号为201410277435.0专利公开的质粒puc-pgk1为模板)使用引物pgk1-u(seqidno.17所示序列)和pgk1-d(seqidno.18所示序列)进行pcr扩增，得到pgk1启动子和终止子连接片段(1771bp)，使用限制性内切酶kpni酶切质粒yep352,使用重组酶，并利用引物两端设计的15-20bp同源臂，连接得到yep352-pgk1重组质粒。酿酒酵母w303a基因组为模板，使用引物p-u(seqidno.19所示序列)和p-d(seqidno.20所示序列)pcr扩增得到pep1(seqidno.1所示序列)片段，4740bp。使用限制性内切酶xhoi酶切yep352-pgk1重组质粒,使用重组酶，并利用引物两端设计的15-20bp同源臂，连接得到yep352-pgk1-pep1重组质粒(其中，xhoi酶的酶切位点在pgk1p和pgk1t之间)。
利用验证引物pgky-u(seqidno.21所示序列)以及pgky-d(seqidno.22所示序列)对强启动子pgk1进行验证；利用验证引物py-u(seqidno.23所示序列)以及py-d(seqidno.24所示序列)对pep1片段进行验证。
如附图1，目的片段以及重组质粒构建验证电泳图，其中m泳道为5000bpdnamaker。图(a)中1泳道是强启动子pgk1电泳条带，1771bp，大小正确；图(b)第1泳道是质粒yep352-pgk1的pcr验证条带，2823bp，条带大小正确，强启动子pgk1连接正确；图(c)中，1泳道是pcr扩增得到的pep1基因，长度为4740bp，由图知，条带大小正确，条带单一；(d)图，是将片段pep1连接到yep352-pgk1上的pcr验证电泳图，条带大小为1309bp，由图可知，pep1连接正确。
整个过程所用引物见表1。
表1构建载体过程中的pcr引物
实施例2高产核酸酿酒酵母工程菌的构建
(以下所述的强启动子pgk1即包括pgk1启动子(pgk1p)和pgk1终止子(pgk1t)片段)
菌株主要构建过程如下(如附图2、3)：
1)目的片段的获得
首先以酿酒酵母w303a基因组为模板，使用引物rdna-au(seqidno.5所示序列)和rdna-ad(seqidno.6所示序列)，pcr扩增得到上游同源臂rdna-a片段(seqidno.3所示序列)，1462bp；以酿酒酵母by23基因组为模板，使用引物rdna-bu(seqidno.11所示序列)和rdna-bd(seqidno.12所示序列)，pcr扩增得到下游同源臂rdna-b片段(seqidno.4所示序列)，1084bp；以质粒puc6为模板，使用引物kan-u(seqidno.7所示序列)和kan-d(seqidno.8所示序列)，pcr得到kan片段，1613bp；以由实施例1制备的重组质粒yep352-pgk1-pep1为模板，使用引物pep1-u(seqidno.9所示序列)和pep1-d(seqidno.10所示序列)，pcr得到强启动子pgk1和pep1连接片段，6512bp。
整个过程所用引物见表2。
表2工程菌构建过程中的pcr引物
如附图2，目的片段的电泳图，其中m泳道为10000bpdnamarker，1泳道是rdna-b片段电泳条带，1084bp，大小正确；2泳道是kan片段电泳条带，1613bp，大小正确；3泳道是启动子与pep1连接片段电泳条带，6512bp，大小正确；4泳道是rdna-a片段电泳条带，1462bp，大小正确；
2)多拷贝过表达pep1酿酒酵母工程菌的构建
将步骤(1)中获得的4个片段用醋酸锂转化法将其转化到酿酒酵母工程菌w303a中，其中上游同源臂rdna-a、kan片段、pgk1p-pep1-pgk1t连接片段、下游同源臂rdna-b顺序连接，获得多拷贝过表达pep1酿酒酵母工程菌(如附图3)。
多拷贝过表达pep1酿酒酵母工程菌的验证(如图4)：
分别设计两组引物，即为：m1-u(seqidno.13所示序列)，m1-d(seqidno.14所示序列)，m2-u(seqidno.15所示序列)，m2-d(seqidno.16所示序列)，以生长较好单倍体转化子中质粒为模板，进行pcr扩增，验证重组子。将得到的pcr产物分别进行0.8％的琼脂糖凝胶电泳。分别得到一3930bp条带，一3000bp条带，说明片段已成功重组到酿酒酵母单倍体基因组中，并且重组位置也正确。
如附图4是构建成功的酿酒酵母工程菌验证电泳图，其中m泳道为5000bpdnamaker，1泳道为验证引物m1-u/m1-d的pcr产物，是一条大小3930bp的特异性条带，其大小与预期一致；2泳道为验证引物m2-u/m2-d的pcr产物，经0.8％的琼脂糖凝胶电泳，可看到一条大小3000bp的特异性条带，其大小与预期一致，说明片段已成功重组到酿酒酵母单倍体基因组中，并且重组位置也正确；
实施例3过表达pep1菌株摇瓶发酵实验
1.过表达pep1菌株与出发菌株生长性能的比较
实验组为过表达pep1的酿酒酵母w303a，对照组为酿酒酵母w303a原始菌株。
1)生长曲线测定：
种子液培养：利用接种环，将菌泥从些斜面上挑取一环，将其接种到ypd培养基试管中，30℃、180rpm条件下培养12h。
发酵培养：将种子液接种于100mlyepd液体培养基中，每隔一小时或两小时(根据生长情况决定)取样2ml。将菌液取出1ml，对其稀释一定的倍数至od600值在0.4-0.6范围，在波长600nm处测定其吸光度。根据其吸光度值和取样时间对应的关系，作生长曲线。
结果如附图5所示，与出发菌株w303a相比，过表达pep1菌株的生长性能并未受到任何影响，并且在相同初始od值时，过表达菌株的发酵终止时间(到达od600＝1的时间)为4小时，而出发菌株的发酵终止时间(到达od600＝1的时间)为6小时，过表达菌株较出发菌株提早大约2个小时，由此说明本发明的工程菌的发酵活力显著提高。
2.胞内总rna的提取与测定：
(以下测定核酸的方法来自文献
chuwattanakulv,kimyh,sugiyamam,etal.constructionofasaccharomycescerevisiaestrainwithahighlevelofrna.[j].journalofbioscience&bioengineering,2011,112(1):1.)
实验组为过表达pep1的酿酒酵母w303a，对照组为酿酒酵母w303a原始菌株。
1)干重曲线：利用接种环，将菌泥从些斜面上挑取一环，将其接种到ypd培养基试管中，30℃、180rpm条件下培养12h。将一级种子液接种于100mlyepd液体培养基中，每隔2个小时取样测定其600nm处吸光度值和干重，以干重(y)对od600(x)作干重曲线y＝0.382x+0.832。
2)菌种发酵培养
一级种子液：利用接种环，分别将菌泥从些斜面上挑取一环，将其接种到ypd培养基试管中，30℃、180rpm条件下培养12h；
将一级种子液接种于50mlyepd液体培养基，使其初始od600相同，30℃、180rpm条件下摇瓶培养至od260＝1.0(指数生长中期)，均分成三管，测量每管的od600，离心，洗涤，收集菌体；菌体以0.5mol/l高氯酸重悬，70℃水浴20min，离心收集上清液，稀释50倍，测量稀释液在260nm的od值，并按以下公式计算胞内总rna含量(％)。
(od260*2500)/(12.224*od600+26.624)
结果见表3，列表3表明：在摇瓶发酵实验中，对照组：原始菌株w303a的核酸含量达到菌体干重的9.32％(质量百分比)，而实验组：本发明得到的过表达菌株的核酸含量达到菌体干重的14.70％，相比较亲本菌株提高了57.72％。这说明本发明得到的菌株可以在一定程度上提高酵母菌株胞内核酸的量，为高产核酸酵母菌株的选育，提供了理论基础。
表3菌株的核酸含量
注：所示数据分别为每组三个平行试验结果的平均值
本文虽然已经给出了本发明的一些实施例，但是本领域的技术人员应当理解，在不脱离本发明精神的情况下，可以对本发明的实施例进行改变。上述实施例只是实例性的，不应以本文的实施例作为本发明权利范围的限定。
序列表
<110>天津科技大学
<120>一株高产核酸酿酒酵母工程菌及其构建方法与应用
<130>2018年3月2日
<141>2018-05-30
<160>24
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>4740
<212>dna
<213>saccharomycescerevisiaepep1(pep1gene)
<400>1
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