本发明涉及一种化学品的制备方法，尤其涉及一种制备6β-甲基泼尼松龙的方法。
背景技术：
甲基泼尼松龙属于糖皮质激素类药，用于危重疾病的急救，还可用于内分泌失调、风湿性疾病、胶原性病、皮肤疾病、过敏反应、眼科疾病、胃肠道疾病、血液疾病、白血病、休克、脑水肿、多发性神经炎、脊髓炎及防止癌症化疗引起的呕吐等。目前临床上主要用于脏器移植。6β-甲基泼尼松龙是甲基泼尼松龙成品中一个重要的杂质，没有药理活性。为了更好的控制甲基泼尼松龙的质量，必须对其中的杂质进行控制，因此制备该物质作为对照品很有必要。
由于6β-甲基泼尼松龙的合成和纯化存在很大的技术障碍，所以目前还没有专门制备6β-甲基泼尼松龙的方法，急需开发一种制备6β-甲基泼尼松龙的方法，以制备出高纯度的6β-甲基泼尼松龙对照品，利用其对甲基泼尼松龙的杂质进行有效控制，最终提高甲基泼尼松龙的纯度和药理活性。
技术实现要素：
本发明的目的是为解决目前无法制备6β-甲基泼尼松龙对照品，从而难以保证甲基泼尼松龙的纯度和药理活性的技术问题。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种制备6β-甲基泼尼松龙的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）格氏、水解、消除反应：在干燥的格氏试剂制备瓶中加入四氢呋喃、镁片，通入一氯甲烷一定时间后蒸去四氢呋喃，通入氮气保护，待用；在反应瓶中加入6-甲基环氧物1、四氢呋喃，缓慢加入格氏试剂，加热回流至反应完全，降温至20℃以下,得格氏物2；在水解反应瓶中加入冰醋酸、冰块、二氯乙烷，搅拌，缓慢加入格氏物2，继续搅拌至溶清，静置后除去下层水相；在有机相中加入甲醇，滴加硫酸水溶液，常温搅拌至反应完全后得水解物3。，缓慢滴加碱水溶液，调节ph值，加热反应一定时间，同时平均每15分钟调节一次ph值，使体系ph保持在一定值，取样监测hplc控制反应终点；用酸水溶液调节ph值到6～7；减压浓缩除去有机相，加水水析，搅拌，抽滤，在60℃烘料得6β-甲基消除物4；反应式为
（2）脱氢反应：第一步为种子培养：在带夹套的发酵罐中加入以6β-甲基消除物4为底物的发酵培养基，装料，灭菌，冷却到一定温度，接入一定量的简单节杆菌进行发酵；发酵分两个阶段：第一阶段为菌体生长阶段：接种，调节一定温度和空气流量，培养一定时间，菌浓od620达到一定值时，进行投料；第二阶段为微生物转化阶段：投料，调节一定温度和空气流量，转化一定时间，发酵完成；第二步为提取精制：对发酵液进行过滤得到发酵滤饼，对发酵滤饼采用丙酮-水混合溶剂进行提取精制，对提取液进行减压浓缩，得到6β-甲基脱氢物5；反应式为
（3）上碘反应：配制碘液：将碘、无水氯化钙、甲醇投入碘液配制瓶，搅拌；在上碘反应瓶中，投入6β-甲基脱氢物5、甲醇，搅拌加入无水氯化钙，搅拌降温，加入氧化钙，搅拌降温；避光滴加碘液，保温反应至反应完全；倒入醋酸水溶液中，搅拌，水析出料，得6β-甲基上碘物6a和6b的混合物；反应式为
（4）置换反应：将丙酮、三乙胺投入置换反应瓶，降温，滴加醋酸，保温搅拌，加入6β-甲基上碘物6a和6b的混合物，搅拌加热，保温2～3小时后，加热回流反应2～3小时；反应结束，浓缩至干，水析出料，真空烘干得6β-甲基置换物7；反应式为
（5）水解反应：碱液的配制：在碱液配制瓶中投入甲醇和氢氧化钠，搅拌溶解，备用；在水解反应瓶中投入甲醇及6β-甲基置换物7，开始搅拌，滴加氢氧化钠-甲醇溶液，滴毕后于5～10℃保温反应2～3小时，加入冰醋酸中和至ph为6.0～6.2，浓缩近干，水析出料，真空烘干得6β-甲基泼尼松龙粗品8；反应式为
（6）用制备液相纯化，得到6β-甲基泼尼松龙精品。
进一步地，步骤（1）中所述消除反应中，碱水溶液是氢氧化钠水溶液和氢氧化钾水溶液中的一种或其混合物；所述酸水溶液为醋酸、盐酸、硫酸和磷酸中的一种或一种以上混合物的水溶液；
进一步地，步骤（1）中所述消除反应中，所述碱水溶液调节的ph值为8～10，反应温度为30～65℃，反应时间4～24小时。
进一步地，步骤（6）中所述制备液相的固定相为c18，流动相为乙腈-水，流速为20ml/min。
进一步地，所述步骤（6）中，流动相体系为乙腈-水，梯度洗脱条件如下：
进一步地，所述步骤（6）中，色谱柱填料为十八烷基键合硅胶，检测波长254nm。
本发明通过格氏、水解、消除，生成6β-甲基消除物，再经发酵脱氢、上碘、置换、水解、制备液相纯化得到6β-甲基泼尼松龙高纯度对照品，利用其可对甲基泼尼松龙的杂质进行有效控制，最终大大提高甲基泼尼松龙的纯度和药理活性。
具体实施方式
现在结合实施例对本发明作进一步详细的说明，本发明的应用并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通都将落入本发明的保护范围。
下述实施例中，第一步的格氏、水解、消除反应的反应式均为：
第二步的脱氢反应的反应式均为：
第三步的上碘反应的反应式均为：
第四步的置换反应的反应式均为：
第五步的水解反应的反应式均为：
实施例1
第一步，格氏、水解、消除：在250ml干燥反应瓶中，加入四氢呋喃（53ml，5.3v），再加入镁片（6.7g，0.67w），通一氯甲烷至快速升温到55～61℃，降温到反应平稳。将四氢呋喃（80ml，8v）加入反应瓶，保温30～50℃通气至镁溶清，再通气6～8小时，约通入一氯甲烷（20g，2w），密闭保存。然后常压浓缩蒸去四氢呋喃至升温到71～74℃。降至室温后用氮气保护，密闭待用。在250ml反应瓶中加入四氢呋喃（20ml，2v），加入6-甲基环氧物1(10g,1w)，搅拌20～30分钟，然后缓慢加入格氏试剂（60ml，6v），加热升温回流4～5小时，冷却至20℃以下；在500ml反应瓶中加入冰醋酸（20ml，2v）、冰块（66.7g，6.67w）、二氯乙烷（40ml，4v），开搅拌配成混合液，然后将格氏反应液缓慢滴入反应瓶中，搅拌30分钟以上至体系完全溶清，再静置1～3小时，萃取，将下层水层弃去，留上层有机层即为反应液倒入500ml反应瓶中。加入甲醇（60ml，6v），然后将配制好的混合酸液7.7ml(水:硫酸=1v:0.54v）加入反应液中，体系逐渐析出白色固体，于20～30℃保温反应2～3小时，反应完全后开始消除反应。缓慢滴加naoh溶液(naoh:h2o=1w:3v)调ph值在9，平均每15分钟调节一次ph值，加热回流6小时，使体系ph保持在9，回流温度控制在60～65℃，取样hplc控制反应终点。用冰醋酸调节ph值到6～7。减压浓缩除去有机相，加水（100ml，10v）水析，在5℃以下搅拌0.5h，抽滤，在60℃烘料，得6β-甲基消除物4（7.5g，75%）产物hplc(254nm,74%)。
第二步，脱氢反应：发酵培养基成分：葡萄糖7g/l，酵母膏7g/l，玉米浆11g/l，磷酸二氢钾1g/l，ph=7.3，底物为6β-甲基消除物4，在发酵过程中，简单节杆菌将甲6β-甲基消除物4进行氧化脱氢，得到6β-甲基脱氢物5。
发酵过程如下：二级种子培养，在带夹套的10l发酵罐中加入培养基，装料系数0.6，灭菌，冷却到32℃，接入简单节杆菌，接种量为9%，发酵分两个阶段：①菌体生长阶段：接种后，调节空气流量1.0m³/h，温度32℃，培养9h，监测菌浓od620=36%，进行投料。②微生物转化阶段：投料浓度1g/l，投6β-甲基消除物4（7.5g，1w），调节空气流量0.5m³/h，温度为34℃，转化时间为36h，转化率95%。
提取精制：发酵液进行过滤，发酵滤饼采用85%丙酮-水混合溶剂进行提取精制，提取液进行减压浓缩，得到6β-甲基脱氢物5(6.37g，84.9%)，产物hplc(254nm,72%)。
第三步，上碘反应：配制碘液：将碘（6.1g，0.96w）、无水氯化钙（1.30g，0.2w）、甲醇（25ml3.92v）投入50ml碘液配制瓶，搅拌30分钟以上。
在250ml上碘反应瓶中，投入6β-甲基脱氢物5（6.37g，1w）、甲醇（64ml，10v），搅拌30分钟。加入无水氯化钙（0.77g，0.12w），搅拌降温至约10℃，加入氧化钙（3.20g，0.50w），搅拌降温至0～6℃。避光滴加碘液，以褪色快慢调节滴加速度，保持温度0～6℃，约1小时滴加完毕。滴完后继续于0～6℃保温反应约3小时。在1000ml上碘水析反应瓶中，加入饮用水（637ml，10v）与冰醋酸（6.25ml，0.98v），降温至10℃以下备用。将上碘反应液倒入上碘水析瓶进行酸析，搅拌约30分钟，静置1小时以上，温度10℃以下。过滤，抽干过夜，直接投下步置换反应。取样检测，得6β-甲基上碘物6(8.69g（湿）,136%)，产物6ahplc(254nm,65%),6bhplc(254nm,5%)。避光放置。
第四步，置换反应：丙酮(79ml,9v)、三乙胺(9.48ml,1.1v)投入250ml置换反应瓶，降温至0～10℃，滴加醋酸(6.32ml,0.73v)。控制温度在10℃以下。滴完后搅拌保温30分钟。加入6β-甲基上碘物6a和6b混合物（8.69g，1w），搅拌加热20～25℃，保温2～3小时，后加热至56～60℃回流反应2～3小时。反应结束，常压浓缩0.5小时，进行减压浓缩（真空度0.04～0.09mpa），加热至60℃左右，再冲加水100ml，浓缩至冷凝器基本无液体下流为止。加入饮用水(50ml,5.75v)水析，降温至0～5℃。过滤，滤饼用饮用水冲洗，滤干。于热风循环烘箱55~65℃干燥12小时。得6β-甲基置换物7（7g，80%）产物hplc(254nm,65%)。
第五步，水解反应：碱液的配制：在碱液配制瓶中投入甲醇(14ml,2v)和氢氧化钠(0.29g,0.41)，搅拌约1小时溶解，备用。在水解反应瓶中投入甲醇(175ml,25v)及6β-甲基置换物7(7g,1w)，开搅拌，通入氮气，流量控制在0.5～0.7m3/h，降温至5～10℃，滴加氢氧化钠-甲醇溶液，滴加温度为5～10℃，滴加时间10～15分钟。滴毕后于5～10℃保温反应2～3小时，加入冰醋酸(0.56ml,0.08v)中和至ph为6.0～6.2，关氮气。减压浓缩至近干（真空度0.04～0.09mpa），用水(35ml,5v)水析，降温至0～5℃。过滤，于热风循环烘箱55～65℃干燥12小时。得6β-甲基泼尼松龙粗品8（6.23g，89%）产物hplc(254nm,60%)。
第六步，用制备液相纯化:制备液相的固定相为c18，流动相为含乙腈-水，流速为20ml/min，分离纯化6β-甲基泼尼松龙粗品8（6.23g），纯度hplc(254nm,60%)。
流动相体系为乙腈-水，梯度洗脱条件如下：
色谱柱填料为十八烷基键合硅胶，检测波长254nm。
得到的制备液浓缩去除有机溶剂，水冻干。得到6β-甲基泼尼松龙精品（2.5g，40%），产物hplc(254nm,99.8%)。
实施例2
第一步，格氏、水解、消除：在250ml干燥反应瓶中，加入四氢呋喃（53ml，5.3v），再加入镁片（6.7g，0.67w），通一氯甲烷至快速升温到55～61℃，降温到反应平稳。将四氢呋喃（80ml，8v）加入反应瓶，保温30～50℃通气至镁溶清，再通气6～8小时，约通入一氯甲烷（20g，2w），密闭保存。然后常压浓缩蒸去四氢呋喃至升温到71～74℃。降至室温后用氮气保护，密闭待用。在250ml反应瓶中加入四氢呋喃（20ml，2v），加入6-甲基环氧物1(10g,1w)，搅拌20～30分钟，然后缓慢加入格氏试剂（60ml，6v），加热升温回流4～5小时，冷却至20℃以下；在500ml反应瓶中加入冰醋酸（20ml，2v）、冰块（66.7g，6.67w）、二氯乙烷（40ml，4v），开搅拌配成混合液，然后将格氏反应液缓慢滴入反应瓶中，搅拌30分钟以上至体系完全溶清，再静置1～3小时，萃取，将下层水层弃去，留上层有机层即为反应液倒入500ml反应瓶中。加入甲醇（60ml，6v），然后将配制好的混合酸液7.7ml(水:硫酸=1v:0.54v）加入反应液中，体系逐渐析出白色固体，于20～30℃保温反应2～3小时，反应完全后开始消除反应。缓慢滴加koh溶液(koh:h2o=1w:3v)调ph值在8，平均每15分钟调节一次ph值，加热至反应24小时，使体系ph保持在8，温度控制在30～40℃，取样hplc控制反应终点。用盐酸水溶液调节ph值到6～7。减压浓缩除去有机相，加水（100ml，10v）水析，在5℃以下搅拌0.5h，抽滤，在60℃烘料，得6β-甲基消除物4（6.6g，66%）产物hplc(254nm,60%)。
其他步骤同实施例1。
实施例3
第一步，格氏、水解、消除：在250ml干燥反应瓶中，加入四氢呋喃（53ml，5.3v），再加入镁片（6.7g，0.67w），通一氯甲烷至快速升温到55～61℃，降温到反应平稳。将四氢呋喃（80ml，8v）加入反应瓶，保温30～50℃通气至镁溶清，再通气6～8小时，约通入一氯甲烷（20g，2w），密闭保存。然后常压浓缩蒸去四氢呋喃至升温到71～74℃。降至室温后用氮气保护，密闭待用。在250ml反应瓶中加入四氢呋喃（20ml，2v），加入6-甲基环氧物1(10g,1w)，搅拌20～30分钟，然后缓慢加入格氏试剂（60ml，6v），加热升温回流4～5小时，冷却至20℃以下；在500ml反应瓶中加入冰醋酸（20ml，2v）、冰块（66.7g，6.67w）、二氯乙烷（40ml，4v），开搅拌配成混合液，然后将格氏反应液缓慢滴入反应瓶中，搅拌30分钟以上至体系完全溶清，再静置1～3小时，萃取，将下层水层弃去，留上层有机层即为反应液倒入500ml反应瓶中。加入甲醇（60ml，6v），然后将配制好的混合酸液7.7ml(水:硫酸=1v:0.54v）加入反应液中，体系逐渐析出白色固体，于20～30℃保温反应2～3小时，反应完全后开始消除反应。缓慢滴加naoh溶液(naoh:h2o=1w:3v)调ph值在10，平均每15分钟调节一次ph值，加热反应4小时，使体系ph保持在10，温度控制在40～45℃，取样hplc控制反应终点。用硫酸水溶液调节ph值到6～7。减压浓缩除去有机相，加水（100ml，10v）水析，在5℃以下搅拌0.5h，抽滤，在60℃烘料，得6β-甲基消除物4（6.0g，60%）产物hplc(254nm,58%)。
其他步骤同实施例1。
实施例4
第一步，格氏、水解、消除：在250ml干燥反应瓶中，加入四氢呋喃（53ml，5.3v），再加入镁片（6.7g，0.67w），通一氯甲烷至快速升温到55～61℃，降温到反应平稳。将四氢呋喃（80ml，8v）加入反应瓶，保温30～50℃通气至镁溶清，再通气6～8小时，约通入一氯甲烷（20g，2w），密闭保存。然后常压浓缩蒸去四氢呋喃至升温到71～74℃。降至室温后用氮气保护，密闭待用。在250ml反应瓶中加入四氢呋喃（20ml，2v），加入6-甲基环氧物1(10g,1w)，搅拌20～30分钟，然后缓慢加入格氏试剂（60ml，6v），加热升温回流4～5小时，冷却至20℃以下；在500ml反应瓶中加入冰醋酸（20ml，2v）、冰块（66.7g，6.67w）、二氯乙烷（40ml，4v），开搅拌配成混合液，然后将格氏反应液缓慢滴入反应瓶中，搅拌30分钟以上至体系完全溶清，再静置1～3小时，萃取，将下层水层弃去，留上层有机层即为反应液倒入500ml反应瓶中。加入甲醇（60ml，6v），然后将配制好的混合酸液7.7ml(水:硫酸=1v:0.54v）加入反应液中，体系逐渐析出白色固体，于20～30℃保温反应2～3小时，反应完全后开始消除反应。缓慢滴加naoh溶液(naoh:h2o=1w:3v)调ph值在9，平均每15分钟调节一次ph值，加热回流6小时，使体系ph保持在9，回流温度控制在60～65℃，取样hplc控制反应终点。用磷酸水溶液调节ph值到6～7。减压浓缩除去有机相，加水（100ml，10v）水析，在5℃以下搅拌0.5h，抽滤，在60℃烘料，得6β-甲基消除物4（7.4g，74%）产物hplc(254nm,72%)。
其他步骤同实施例1。
对以上各实施例中制得的6β-甲基泼尼松龙进行检测，质谱：m/z375(m+h+)，熔点：240-244ºc，与6β-甲基泼尼松龙标准物进行对照，完全符合6β-甲基泼尼松龙的特性。
以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。