专利名称：6α-甲基泼尼松龙中间体的生物脱氢制备方法
技术领域：
本发明涉及甾体药物中间体的制备方法，特别涉及一种孕甾药物中间体的生物脱
氢制备方法。
背景技术：
6a-甲基泼尼松龙(methylprednisolone， CAS :83-43-2 ;简称甲泼尼龙)是一 种皮质激素药物，它具有抗炎，抗内毒素，抑制免疫，抗休克等药理作用，可以制成临床用针 剂，在临床上具有非常重要的作用。分子式如下
1，2位脱氢工序甲泼尼龙生产过程中的一个关键步骤，直接影响到甲泼尼龙的 质量和收率。现有技术中脱氢工艺一般用SeOj兑氢，Se(^是剧毒物质，污染大，且反应 收率低，一般只有55^，产物质量差，产物中残留的微量Se(^很难消除。中国专利申请 200710201635. 8公开了一种甲泼尼龙脱氢物的制备方法，采用节杆菌生物脱氢的方法对甲 泼尼龙中间体1，2位进行生物脱氢。然而该申请公开的技术方案中既没有公开生物脱氢所 采用菌株的任何保藏信息，又没有公开生物脱氢所采用的培养基的配方，由于现有技术中， 采用不同菌株与不同的培养基时生产脱氢物的收率有很大的差别，造成该专利申请其公开 的技术方案无法实施。
发明内容
为克服现有技术中的缺陷，本发明提供一种新的甾体药物1，2位的生物脱氢方 法。其特征是，以式(1)化合物为底物采用简单节杆菌生物脱氢的方法得到式(2)化合物。
反应式如下
&为H， 0Ac ; &为011;或者1 2，1 3为双键或环氧；
R4为H， a -OH， P _0H，或=0 ;
Rs为H， CHs或者二 CH2
化合物(1)不为以下几种化合物 (1)6 a -甲基-lip ，17a-二羟基-孕甾-4-烯-3，20_二酮；
(2)6 a -甲基-17a ，21_二羟基-孕甾_4_烯3， 11， 20-三酮-21
(3)6 a -甲基-lip ，17 a ，21_三羟基-孕甾_4_烯-3， 20-二酮-21
(4)6 a -甲基-17a-羟基-孕甾_4_烯-3， 11 ， 20-三酮；
(5)6 a -甲基-lip ，17 a ，21 —三羟基-孕甾_4_烯-3， 20-二酮。
所述的生物脱氢具体工艺为将式(1)化合物粉碎或以溶剂溶解，投入已培养好 节杆菌的发酵罐中进行生物脱氢反应，转化后提取得到脱氢物即化合物(2)。所述溶剂选 自但不仅限于甲醇、乙醇、四氢呋喃、二氧六环，DMF (N， N- 二甲基甲酰胺)中的一种或几种， 溶解倍数为常温下能将底物溶解的最小倍数，所述粉碎投料的式(1)化合物优选微粉化为 09。(90%通过粒径)《lOOym的微粒。所述的甾体药物中间体即化合物(1)优选以下几种 化合物中的任意一种 ，17a-二羟基-孕甾-4-烯-3，20_二酮； (2) 17 a ，21_二羟基_孕甾_4_烯3， 11， 20-三酮-21.
(3) IIP ，17 a ，21-三羟基-孕甾_4_烯-3， 20-二酮-21
(4) 17 a -羟基-孕甾-4-烯-3， 11， 20-三酮；
(5) 6 a -甲基-lla ， 17 a ，21_三羟基-孕甾_4_烯-3， 20-二酮-21
(6) 11a ，17a-二羟基-孕甾-4-烯-3，20-二酮；
(7) lla ，17a ，21-三羟基-孕甾_4_烯_3， 20-二酮-21-醋酸酯;
(8) 6a_甲基-lla-羟基-孕甾-4， 16-二烯-3， 20-二酮；
(9) 11a-羟基-16a ，17a-环氧-孕甾-4-烯-3，20_二酮；
(10) 11 a _羟基_孕甾-4， 16- 二烯-3， 20- 二酮；
(11) 6 a -甲基-lla-羟基-16a ，17a-环氧-孕甾-4-烯-3，20_二酮；
(12) 6 a -甲基-11 a ，21- 二羟基-16a ，17a -环氧-孕甾_4_烯-3， 20- 二
酮-21
(13)6-次甲基-lla ，17a-二羟基-孕甾-4-烯-3，20-二酮；
作为底物的化合物(1)的投料浓度为《4% (相对于发酵液容积)；优选投料浓度 为1% 3%，发酵温度30 34"，生物脱氢反应时间36 72小时。 生物脱氢反应结束后终止反应，优选采用将发酵液升温至70 9(TC而使菌体灭 活的方法，终止反应后用优选采用溶媒萃取发酵液的形式提取脱氢产物。所述萃取用溶媒 优选乙酸乙酯。 所述生物脱氢所使用的的简单节杆菌(拉丁命名Arthrobacter simplex)，优选
以下几种菌株AS 1.754、 AS 1.94*(均由中国科学院微生物研究所提供)。 所述的生物脱氢反应可以采用以下发酵工艺 斜面培养一级培养一二级培养一加入化合物(1)发酵 进行生物脱氢反应一终止反应 所述的生物发酵工艺还可采用任何公知的生物发酵工艺方法，如参考《生物合成
药物学》(化学工业出版社，2000年出版，褚志义主编；666 675页)中公开的生物发酵工艺。 所述的生物脱氢所用的培养基优选采用以下配比 斜面培养基(％ ):葡萄糖1.3，酵母膏1.3，琼脂2.0，以及余量的蒸馏水， pH7. 0-7.2，用于斜面培养 发酵培养基(％):葡萄糖l.O，酵母膏O. 16， KH2P040.25，玉米浆0. l，以及余量的 蒸馏水，pH 7. 0-7. 2，用于一级、二级培养和最终的生物脱氢反应中。 与现有技术中采用Se02脱氢的工艺相比采用本发明所述的生物脱氢工艺，脱氢转 化率可以达到70 90%，并且避免了剧毒的含硒杂质的残留，此外，本发明提供的生物脱 氢工艺可以适用于多种甾体中间体，即可以适用于合成甲泼尼龙的多条合成路线，使得合 成甲泼尼龙时合成路线的选择更为灵活。 下面结合具体实施方式
进一步说明本发明所述的技术方案，具体实施方式
中公开 的技术方案是对本发明技术方案的进一步说明，不能解释为对本发明的限制。
具体实施例方式底物转化率的测定转化率用反应过程中转化为产物的底物质量占初始底物总质 量的百分比来表示。采用HPLC测定，分离柱为C18柱，检测波长为240nm，流动相是乙腈 水(体积比)=60 : 40的溶于流速为1. 5mL/min。采用面积归一法计算底物转化率。
斜面培养将斜面培养基分装于15mL的试管中，灭菌30min后摆成斜面。斜面于 37t:培养箱中放置2d，观察无染菌情况即可进行接种。接种后斜面于3(TC下培养2d，然后
置于4t:冰箱中保存。 —级培养从生长良好的简单节杆菌斜面上取菌体，接入装有30ml培养基的 250mL三角瓶中，30 34°C ， 180r/min振荡培养，24小时 二级培养将完成一级培养后的发酵液以5%接种量接入装有150ml培养基的 lOOOmL二级种子培养三角瓶中，以同样的条件进行二级培养，二级培养时间为24小时
生物脱氢与二级培养相同的接种量接入5L发酵罐中，培养温度30 34t:，搅拌 转速180r/min，通气量1. 5L/min，培养24小时后加入底物进行生物脱氢反应。
实施例1 :以1113 ， 17 a - 二羟基-孕甾_4_烯_3， 20- 二酮为底物；
将简单节杆菌(AS 1.94*)依次进行斜面培养、一级培养和二级培养，培养温度为 3rC，将溶于DMF的底物投入5L发酵罐中，投料浓度为1X，反应温度为3rC。反应时间为 60小时，反应完成后升温至7(TC终止反应，采用乙酸乙酯萃取提取发酵液，将有机相浓縮， 测得底物转化率为73.5%。 实施例2 :以17a ，21-二羟基-孕甾_4_烯3， 11， 20-三酮-21-醋酸酯为底物;
将简单节杆菌(AS 1.94*)依次进行斜面培养、一级培养和二级培养，培养温度为 32°C ，将溶于四氢呋喃的底物投入5L发酵罐中，投料浓度为2% ，反应温度为32°C 。反应时 间为48小时，反应完成后升温至7(TC终止反应，采用乙酸乙酯萃取提取发酵液，将有机相 浓縮，测得底物转化率为77. 3%。 实施例3 :以IIP ，17a ，21-三羟基-孕甾_4_烯_3， 20-二酮-21-醋酸酯为底 物； 将简单节杆菌(AS 1.754)依次进行斜面培养、一级培养和二级培养，培养温度为 33t:，将溶于二氧六环的底物投入5L发酵罐中，投料浓度为1%，反应温度为331:。反应时 间为36小时，反应完成后升温至7(TC终止反应，采用乙酸乙酯萃取提取发酵液，将有机相 浓縮，测得底物转化率为81. 6% 。 实施例4 :以17 a -羟基-孕甾_4_烯_3， 11， 20-三酮为底物；
将简单节杆菌(AS 1.94*)依次进行斜面培养、一级培养和二级培养，培养温度为 34°C ，将微粉化的底物投入5L发酵罐中，投料浓度为2% ，反应温度为34°C 。反应时间为36 小时，反应完成后升温至7(TC终止反应，采用乙酸乙酯萃取提取发酵液，将有机相浓縮，测 得底物转化率为80. 1%。 实施例5:以6a-甲基-lla，17a，21-三羟基-孕甾_4_烯_3， 20- 二酮-21-醋 酸酯为底物； 将简单节杆菌(AS 1.94*)依次进行斜面培养、一级培养和二级培养，培养温度为 32°C ，将溶解于乙醇的底物投入5L发酵罐中，投料浓度为0. 5% ，反应温度为32°C 。反应时 间为42小时，反应完成后升温至7(TC终止反应，采用乙酸乙酯萃取提取发酵液，将有机相 浓縮，测得底物转化率为77. 1%。 实施例6 :以11 a ， 17 a - 二羟基-孕甾_4_烯_3， 20- 二酮为底物；
将简单节杆菌(AS 1.94*)依次进行斜面培养、一级培养和二级培养，培养温度为 34t:，将溶解于二氧六环的底物投入5L发酵罐中，投料浓度为2%，反应温度为34°C。反应 时间为36小时，反应完成后升温至7(TC终止反应，采用乙酸乙酯萃取提取发酵液，将有机 相浓縮，测得底物转化率为82. 1%。 实施例7 :以lla ，17a ，21-三羟基-孕甾_4_烯_3， 20-二酮_21_醋酸酯为底 物； 将简单节杆菌(AS 1.754)依次进行斜面培养、一级培养和二级培养，培养温度为 30°C ，将溶于DMF的底物投入5L发酵罐中，投料浓度为2% ，反应温度为30°C 。反应时间为 68小时，反应完成后升温至7(TC终止反应，采用乙酸乙酯萃取提取发酵液，将有机相浓縮， 测得底物转化率为70. 1%。 实施例8:以6a-甲基-lla -羟基-孕甾_4， 16- 二烯_3，20_ 二酮为底物；
将简单节杆菌(AS 1.94*)依次进行斜面培养、一级培养和二级培养，培养温度为
732°C ，将溶于甲醇的底物投入5L发酵罐中，投料浓度为0. 5% ，反应温度为32°C 。反应时间 为48小时，反应完成后升温至7(TC终止反应，采用乙酸乙酯萃取提取发酵液，将有机相浓 縮，测得底物转化率为75.3%。 实施例9 :lla-羟基-16a ，17a-环氧-孕甾_4_烯_3， 20-二酮为底物；
将简单节杆菌(AS 1.754)依次进行斜面培养、一级培养和二级培养，培养温度为 33°C ，将微粉化的底物投入5L发酵罐中，投料浓度为4% ，反应温度为33°C 。反应时间为42 小时，反应完成后升温至7(TC终止反应，采用乙酸乙酯萃取提取发酵液，将有机相浓縮，测 得底物转化率为78.9%。 实施例10 :以11 a -羟基-孕甾_4， 16- 二烯_3，20_ 二酮为底物；
将简单节杆菌(AS 1.94*)依次进行斜面培养、一级培养和二级培养，培养温度为 34t:，将溶于二氧六环的底物投入5L发酵罐中，投料浓度为1%，反应温度为341:。反应时 间为38小时，反应完成后升温至7(TC终止反应，采用乙酸乙酯萃取提取发酵液，将有机相 浓縮，测得底物转化率为78. 5%。 实施例11 :以6a-甲基-11 a -羟基-16 a ，17a-环氧-孕甾-4-烯-3，20_二 酮为底物； 将简单节杆菌(AS 1.754*)依次进行斜面培养、一级培养和二级培养，培养温度 为30°C ，将溶于四氢呋喃的底物投入5L发酵罐中，投料浓度为1 % ，反应温度为30°C 。反应 时间为72小时，反应完成后升温至7(TC终止反应，采用乙酸乙酯萃取提取发酵液，将有机 相浓縮，测得底物转化率为70. 7. %。 实施例12 :以6a-甲基-lla ，21-二羟基-16a ，17a-环氧-孕甾_4-烯_3， 20-二酮_21-醋酸酯为底物； 将简单节杆菌(AS 1.754)依次进行斜面培养、一级培养和二级培养，培养温度为 31°C ，将溶于乙醇底物投入5L发酵罐中，投料浓度为0. 5 % ，反应温度为31°C 。反应时间为 60小时，反应完成后升温至7(TC终止反应，采用乙酸乙酯萃取提取发酵液，将有机相浓縮， 测得底物转化率为72.9%。 实施例13 :以6-次甲基-11 a ， 17 a - 二羟基-孕甾_4_烯_3，20_ 二酮为底物
将简单节杆菌(AS 1.754)依次进行斜面培养、一级培养和二级培养，培养温度为 34°C ，将微粉化的底物投入5L发酵罐中，投料浓度为2% ，反应温度为34°C 。反应时间为60 小时，反应完成后升温至7(TC终止反应，采用乙酸乙酯萃取提取发酵液，将有机相浓縮，测 得底物转化率为80. 1%。
权利要求
一种甾体药物中间体1，2位的生物脱氢方法，以式(1)化合物为底物采用简单节杆菌生物脱氢的方法得到式(2)化合物，反应式如下R1为H，OAc；R2为OH；或者R2，R3为双键或环氧；R4为H，α-OH，β-OH，或＝O；R5为H，CH3或者＝CH2；化合物(1)不为以下几种化合物6α-甲基-11β，17α-二羟基-孕甾-4-烯-3，20-二酮；6α-甲基-17α，21-二羟基-孕甾-4-烯3，11，20-三酮-21-醋酸酯；6α-甲基-11β，17α，21-三羟基-孕甾-4-烯-3，20-二酮-21-醋酸酯；6α-甲基-17α-羟基-孕甾-4-烯-3，11，20-三酮；6α-甲基-11β，17α，21一三羟基-孕甾-4-烯-3，20-二酮；其特征是将式(1)化合物粉碎或以溶剂溶解，投入已培养好节杆菌的发酵罐中进行生物转化，转化后提取得到脱氢物即化合物(2)。F2008101528777C0000011.tif
2. 如权利要求1所述的生物脱氢方法，其特征是所述溶解底物的溶剂选自甲醇、乙醇、四氢呋喃、二氧六环、DMF中的一种或几种，溶解倍数优选常温下能将底物溶解的最小倍数。
3. 如权利要求l所述的生物脱氢方法，其特征是所述的底物优选微粉化为D9。《10iim的微粒。
4. 如权利要求1至3中任一所述的生物脱氢方法，其特征是作为底物的化合物(1)的 投料浓度为《4%。
5. 如权利要求1至4中任一所述的生物脱氢方法，其特征是作为底物的化合物(1)的 投料浓度优选1% 3%，发酵温度为30°C 34t:，生物脱氢反应时间为36 72小时。
6. 如权利要求1至5所述的生物脱氢方法，其特征是所使用的简单节杆菌(拉丁命名 Arthrobacter simplex)优选保藏编号分别为AS 1. 754、AS 1. 94*的两种种菌株中的一种 或几种。
7. 如权利要求1至7所述的生物脱氢方法，其特征是所述的生物脱氢反应可以采用以 下发酵工艺。斜面培养一一级培养一二级培养一加入化合物(1)发酵进行生物脱氢反应—终止反应
8. 如权利要求1至8所述的生物脱氢方法，其特征是所述的生物脱氢所采用的培养基优选采用以下配比斜面培养基(％ ):葡萄糖1. 3，酵母膏1. 3，琼脂2. 0，以及余量的蒸馏水，pH7. 0-7. 2， 用于斜面培养；发酵培养基(％ ):葡萄糖l.O，酵母膏O. 16， KH2P040.25，玉米浆0. 1，以及余量的蒸馏 水，pH 7. 0-7. 2，用于一级、二级培养和最终的生物脱氢反应中。
9. 如权利要求1至9所述的生物脱氢方法，其特征是所述作为底物的化合物(1)优选 以下几种化合物中的一种IIP ，17a-二羟基-孕甾-4-烯-3，20_二酮； 17a ，21-二羟基-孕甾-4-烯3， 11， 20-三酮-21-醋酸酯; IIP ，17a ，21-三羟基-孕甾-4-烯-3，20-二酮-21_醋酸酯; 17 a -羟基-孕甾-4-烯-3， 11， 20-三酮；6a-甲基-lla ，17a ，21-三羟基-孕甾-4-烯-3，20-二酮_21-醋酸酯；lla ，17a-二羟基-孕甾-4-烯-3，20_二酮；lla ，17a ，21-三羟基-孕甾_4_烯_3， 20-二酮-21-醋酸酯;6a-甲基-lla-羟基-孕甾-4，16-二烯-3，20_二酮；11a-羟基-16a ，17a-环氧-孕甾-4-烯-3，20_二酮；11 a -羟基-孕甾-4， 16- 二烯-3， 20- 二酮；6a-甲基-11 a-羟基-16a ，17a-环氧-孕甾-4-烯-3，20_二酮；6a-甲基-lla ，21-二羟基-16a ，17a-环氧-孕甾-4-烯_3， 20-二酮-21-醋酸酯。
10. 如权利要求1至9所述的生物脱氢方法，其特征是所述作为底物的化合物(1)更优选以下几种化合物中的一种6a-甲基-lla ，17a ，21-三羟基-孕甾-4-烯-3，20-二酮_21-醋酸酯；6a-甲基-lla-羟基-孕甾-4，16-二烯-3，20_二酮；6a-甲基-11 a-羟基-16a ，17a-环氧-孕甾-4-烯-3，20_二酮；6a-甲基-lla ，21-二羟基-16a ，17a-环氧-孕甾-4-烯_3， 20-二酮-21-醋酸
全文摘要
6α-甲基泼尼松龙中间体的生物脱氢制备方法，以式(1)化合物为底物，采用简单节杆菌生物脱氢的方法得到式(2)化合物，具体工艺为将式(1)化合物粉碎或以溶剂溶解，投入已培养好节杆菌的发酵罐中进行生物转化，提取、分离并精制，干燥后得脱氢物即化合物(2)，脱氢转化率可达70～90％。
文档编号C12P33/02GK101760495SQ20081015287
公开日2010年6月30日 申请日期2008年11月6日 优先权日2008年11月6日
发明者赵琳, 陈松, 陈立营 申请人:天津金耀集团有限公司