一种外泌体微量DNA的建库方法与流程

本发明涉及外泌体检测技术领域，具体涉及一种外泌体微量dna的建库方法。

背景技术：

研究发现，外泌体(exosome)是一类40-150nm大小、含有许多可分析的dna、mrna、microrna、lncrna、circrna等核酸物质以及蛋白分子和脂质分子的生物活性双脂膜囊泡体。研究发现从血液、尿液、唾液、泪液、乳液、淋巴液等体液中均可分离获得高纯度外泌体，并且体外分离的外泌体较为稳定且核酸片段覆盖所有染色体信息，是细胞间、亚细胞间信号通讯、细胞存活、凋亡、细胞稳态平衡的重要介质。目前研究者们已能够通过生物分子技术手段筛选出前列腺癌、结直肠癌、胰腺癌等多种肿瘤的外泌体mrna、microrna等生物标志物并且能够一定程度上反映疾病发展进程；自2014年发现外泌体dna的存在后，利用双脱氧法(sanger)测序、液滴聚合酶链反应(dropletdigitalpolymerasechainreaction，ddpcr)等方法，已发现肿瘤患者来源的外泌体中存在细胞核及线粒体dna分子片段含有肿瘤基因突变信息，并且具有较高的检出率和灵敏度，可作为肿瘤等疾病的早期筛查和发展进程的生物分子标记。然而，目前外泌体检测技术包括sanger测序、ddpcr检测覆盖度低，通量低；而二代高通量测序建库方式，包括dna片段化、加接头、修复、片段选择等操作，操作过程复杂，耗时较长，所需要的dna起始量较高，亦不适合微量外泌体dna的建库。因此，开发一种适于外泌体微量dna的建库技术进一步解析外泌体dna与疾病的关联分析十分重要。

研究发现，tn5转座酶能够随机介导双链dna的片段化并短时间内添加寡核苷酸片段，这使得tn5酶能够应用于二代测序的文库制备中。但是目前针对外泌体dna文库的构建，尚无tn5酶的应用案例。

技术实现要素：

针对外泌体微量dna建库技术的空白与不足，本发明首次实现了外泌体微量dna的tn5高通量文库构建，解决了现有外泌体dna建库技术的操作复杂、周期长、通量低等问题，为基于外泌体dna分子诊断与应用奠定技术基础。

因此，本发明提供一种外泌体微量dna的建库方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)tn5酶复合物制备：将包含转座子末端序列和标签序列的dna序列与tn5酶包埋成tn5酶复合物；

(2)外泌体裂解及转座：将外泌体、上述tn5酶复合物和含有igepal的反应缓冲液共同孵育，使外泌体裂解并使外泌体dna片段化；

(3)片段纯化及扩增：对片段化的外泌体dna进行纯化，然后对纯化的外泌体dna进行扩增，得到外泌体dna文库。

需要说明的是，经过片段纯化及扩增以后得到的外泌体dna文库，不局限于特定测序平台的测序文库，这种外泌体dna文库可以根据各测序平台的要求制成相应的测序文库，例如通过在两端添加接头形成带接头的双链线性测序文库；或者通过变性得到单链然后环化得到环状dna文库。

因此，作为一个优选的技术方案，本发明的方法还包括：

(4)文库环化及酶切：将扩增产物变性并环化以形成环化单链dna，然后酶切去除未环化的dna，得到外泌体dna测序文库。

优选地，上述方法还包括：提取样本中的外泌体。

优选地，通过梯度离心从样本中除去大的沉淀物，上清经微孔滤器过滤和超速离心得到微量外泌体。

优选地，上述样本是体液或细胞培养液。

优选地，上述体液包括血液、尿液、唾液、泪液、乳液、淋巴液。

优选地，上述大的沉淀物包括细胞、细胞碎片和血小板。

优选地，上述梯度离心是300-1500g离心。

优选地，上述微孔滤器是孔径为0.22μm的滤器。

优选地，上述超速离心是154,000g离心。

优选地，上述提取样本中的外泌体的步骤中，还包括加入dnasei消化不需要的dna。

优选地，外泌体dna建库起始量小于1000pg。

优选地，上述步骤(1)中，上述标签序列是pcr扩增序列或测序接头序列。

优选地，上述步骤(1)中，上述dna序列包括seqidno：1～3。

优选地，上述步骤(1)中，上述tn5酶复合物制备包括分别将seqidno：1和seqidno：2退火，seqidno：1和seqidno：3退火；然后将退火产物混合并加入tn5酶孵育形成上述tn5酶复合物。

优选地，上述步骤(2)中，上述igepal在反应体系中的浓度是0.04～2(体积)％，优选0.2(体积)％。

优选地，上述步骤(2)中，上述tn5酶复合物在反应体系中的体积占比是1.9～8.3(体积)％，优选4.3(体积)％。

优选地，上述步骤(3)中，上述纯化是磁珠纯化。

优选地，上述步骤(3)中，上述扩增包括使用tn5引物的扩增和使用测序平台接头引物的扩增。

优选地，上述tn5引物包括seqidno：4和seqidno：5。

优选地，上述测序平台接头引物包括seqidno：6和seqidno：7。

优选地，上述步骤(3)中，上述扩增条件包括：72℃5分钟；98℃1分钟；98℃15s，63℃30s，72℃1分钟，6～15个循环，优选8个循环；72℃5分钟。

优选地，上述步骤(4)中，上述环化使用桥接寡核苷酸序列。

优选地，上述桥接寡核苷酸序列如seqidno：8所示。

优选地，上述步骤(4)中，上述环化的条件为37℃孵育30～80分钟，优选60分钟。

优选地，上述步骤(4)中，上述酶切使用外切酶ⅰ(exoⅰ)和外切酶ⅲ(exoⅲ)；

优选地，上述外切酶ⅰ和外切酶ⅲ的体积比2:1至5:1，优选3:1。

传统的外泌体建库技术，通量低，操作过程繁琐，耗时较长，并且所需要的dna起始量高。本发明首次利用tn5酶对外泌体微量dna进行建库，该方法操作简便，样本起始量低，建库效率高，且能直接用于上机测序，推动外泌体研究与应用技术开发进程，具有重大而深远的意义。

附图说明

图1为本发明实施例的外泌体微量dna的建库方法流程图；

图2为本发明实施例中外泌体完成文库扩增、纯化后的文库片段分布图；

具体实施方式

下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本发明能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他元件、材料、方法所替代。在某些情况下，本发明相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本发明的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。

如图1所示，本发明实施例的外泌体微量dna的建库方法，包括如下步骤：

(1)外泌体制备：通过梯度离心从样本中除去大的沉淀物，上清经微孔滤器过滤和超速离心得到微量外泌体。样本可以是体液或细胞培养液，体液可以包括血液、尿液、唾液、泪液、乳液、淋巴液等。大的沉淀物包括细胞、细胞碎片和血小板，通过梯度离心，例如300-1500g离心，优选300-500g离心，能够充分去除细胞、细胞碎片和血小板等大的沉淀物。微孔滤器优选孔径为0.22μm的滤器。超速离心，例如可以是154,000g离心，离心时间例如2小时。无论是梯度离心，还是超速离心，均在4℃条件下进行。在优选的实施例中，还包括加入dnasei消化不需要的dna。经该步骤，能够得到外泌体dna，可以以小于1000pg的量，例如800pg、600pg、400pg、200pg的量，作为建库起始投入dna量。本发明实施例的方法，对建库起始量的要求低于常规建库方法，因此是一种微量dna的建库方法。

(2)tn5酶复合物制备：将包含转座子末端序列和标签序列的dna序列与tn5酶包埋成tn5酶复合物。标签序列可以是pcr扩增序列或测序接头序列。在优选的实施例中，包含转座子末端序列和标签序列的dna序列可以是seqidno：1～3。在优选的实施例中，tn5酶复合物制备包括分别将seqidno：1和seqidno：2退火，seqidno：1和seqidno：3退火；然后将退火产物混合并加入tn5酶孵育形成tn5酶复合物。

(3)外泌体裂解及转座：将外泌体、tn5酶复合物和含有igepal(octylphenoxypolyethoxyethanol，igepalca-630，sigma，货号i8896)的反应缓冲液共同孵育，使上述外泌体裂解并使外泌体dna片段化。igepal在反应体系中的浓度是0.04～2(体积)％，优选0.2(体积)％。tn5酶复合物在反应体系中的体积占比是1.9～8.3(体积)％，优选4.3(体积)％。

(4)片段纯化及扩增：纯化片段化的dna，然后扩增片段化的dna。纯化优选磁珠纯化。扩增条件包括：72℃5分钟；98℃1分钟；98℃15s，63℃30s，72℃1分钟，6～15个循环，优选8个循环；72℃5分钟。在优选的实施例中，扩增包括使用tn5引物的扩增和使用测序平台接头引物的扩增。tn5引物包括seqidno：4和seqidno：5。测序平台接头引物包括seqidno：6和seqidno：7。

(5)文库环化及酶切：将扩增产物变性并环化以形成环化单链dna，然后酶切去除未环化的dna，得到外泌体微量dna文库。在优选的实施例中，环化使用桥接寡核苷酸序列，例如，如seqidno：8所示的桥接寡核苷酸序列。环化的条件为37℃孵育30～80分钟，优选60分钟。在优选的实施例中，酶切使用外切酶ⅰ(exoⅰ)和外切酶ⅲ(exoⅲ)，外切酶ⅰ和外切酶ⅲ的体积比2:1至5:1，优选3:1。

为了更加清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明进行进一步的说明，步骤中的条件为最优条件是说明性的，具体保护范围应该以权利要求为准。

实施例1

1.外泌体制备

收集胚胎干细胞培养液新鲜或在4℃冰箱放置不超过24h的细胞培养液50ml，在300g离心10分钟，去除细胞等大的沉淀物；上清液在4℃条件下1500g离心10分钟，去除细胞碎片和血小板等大的沉淀物；上清液经过0.22μm滤器过滤后，在4℃环境下，154,000g离心2h，然后沉淀用200μl含有10udnasei的pbs重悬，在37℃孵育30分钟，然后加入60ml的pbs缓冲液，4℃环境下，154,000g离心2h，弃上清，用50μl的pbs缓冲液重悬沉淀，即完成外泌体的制备。

2.tn5酶复合物制备

合成5’端磷酸化的序列a及序列b和序列c，序列如下：

序列a:5’-[phos]ctgtctcttatacacatct-3’(seqidno：1)；

序列b:5’-tcgtcggcagcgtcagatgtgtataagagacag-3’(seqidno：2)；

序列c:5’-gtctcgtgggctcggagatgtgtataagagacag-3’(seqidno：3)。

将序列a、b和c稀释成(100μm)，然后序列a和b分别取20μl混合成管1，序列a和c分别取20μl混合成管2，然后管1和管2在pcr仪中完成预处理，条件如下：

75℃，15分钟；60℃，10分钟；50℃，10分钟；40℃，10分钟；25℃，30分钟。

然后将管1和管2混合后取出12.5μl，加入87.5μltn5酶管中，轻轻吹打20次，25℃反应1h完成tn5酶复合物制备，冻存于-20度备用。

3.外泌体裂解及转座

在冰上配置表1所示的裂解液，配制完成充分混匀，其中10％igepal裂解试剂在42μl体系中加入0.84μl；移液器轻轻混匀1-3下，37℃，30分钟孵育，裂解结束，每管加入23.5μl无核酸酶的水(nf-h2o)，此时每管42μl，轻弹管壁混匀离心。

表1

在上述转座后产物中加入72μlagencourtampurexp磁珠，吹打10次混匀，室温静置5分钟后，放到磁力架上，静置2分钟，磁珠被吸附，液体变澄清后弃上清，加入150μl80％乙醇，静置30秒，弃上清，将80％乙醇吸干净，晾干至磁珠表面不反光，约5分钟；加入10μlnf-h2o溶解，吹打10次混匀，室温静置2分钟；上磁力架，静置3分钟，液体澄清，将上清dna进行pcr反应。

4.片段纯化与扩增

4.1按照表2配制反应mix，每管加入11μl，轻弹管壁混匀、离心，进行如下pcr反应：

表2

其中，引物b序列为：5’-tcgtcggcagcgtcagatgtgtataagagacag-3’(seqidno：4)；引物c序列为：5’-gtctcgtgggctcggagatgtgtataagagacag-3’(seqidno：5)。

pcr参数条件为：72℃，5分钟；98℃，1分钟；(98℃，15秒；63℃，30秒；72℃，1分钟)×8个循环；72℃，5分钟；4℃保存。

4.2上述每管加入20μlagencourtampurexp磁珠，吹打10次混匀，室温静置5分钟；放到磁力架上，静置2分钟，磁珠被吸附，液体变澄清；弃上清，加入150μl80％乙醇，静置30s，弃上清；将80％乙醇吸干净，晾干至磁珠表面不反光；加入20μlnf-h2o溶解，吹打10次混匀，室温静置2分钟；上磁力架，静置3分钟，将上清转移到八连管中，进行pcr反应。

4.3按照下表3配置pcr扩增体系：

表3

其中，ad153n5序列为：5’-gaacgacatggctacgatccgactttcgtcggcagcgtc-3’(seqidno：6)；

ad153n7序列为：5’-ctgtctcttatacacatctccgagcccacgagac-3’(seqidno：7)。

pcr参数条件为：72℃，5分钟；98℃，1分钟；(98℃，15秒；63℃，30秒；72℃，1分钟)×8个循环；72℃，5分钟；4℃保温。

4.4检查pcr后反应体积，用nf-h2o补足至50μl；加入40μlagencourtampurexp磁珠(0.8×)，吹打混匀，室温静置5分钟；上磁力架2分钟，转移上清至新管中(上清中的dna片段都小于350bp)；加入35μlagencourtampurexp磁珠(0.7×)，混匀，室温静置5分钟；上磁力架2分钟，去掉含小dna片段和rna的上清；保持在磁座上，加入150μl预冷的80％乙醇洗两次(30s)；保持在磁座上5分钟，使得水分蒸发；为洗脱dna，加入20μlnf-h2o，轻轻吹打混匀，室温孵育5分钟；上磁力架2分钟，将上清转移到新管中备用，取2μl样品进行2100hs检测，结果如图2所示。根据tn5接头序列长度120bp和tn5酶打断单个核小体147bp左右，可以判定文库构建成功，作为文库构建中的质控标准，结果显示该建库体系可以完成外泌体文库的有效构建。

5.文库环化及酶切

5.1按照如下表4配制反应体系：

表4

其中，ad153splintoligo:序列为：5’-gccatgtcgttctgtgagccaagg-3’(seqidno：8)。

反应条件是：95℃，3分钟(热盖105℃)，迅速置于冰上10分钟。

5.2按照如下表5配制反应体系：

表5

反应条件是：37℃，60分钟(热盖95℃)，4℃保存。

5.3按照如下表6配制反应体系：

表6

反应条件是：37℃，30分钟(热盖95℃)，4℃保存。

5.4检查pcr管中体积，用te缓冲液补充至128μl，转移至1.5ml离心管；加入170μlpeg32磁珠，吹打混匀，室温静置5分钟；上磁力架5分钟，弃上清；加入0.5ml预冷80％乙醇洗两次(30s)；保持在磁座上5-10分钟，使得水分蒸发；加入42μlte缓冲液，轻轻吹打混匀，室温孵育5分钟；上磁力架5分钟，将上清转移到1.5ml管中，勿吸到磁珠；qubitssdna高灵敏度分析(highsensitivityassay)定量。从文库片段分布、浓度大小等指标显示在单个样本42μl裂解体系时，加入10％igepal体积范围是0.168μl、0.8μl、4.2μl、8.4μl(分别对应0.2x、1x、5x和10x)，优先选择0.84μl(即1x)为培养液、血液来源外泌体裂解最佳条件。

5.5上机测序与分析，具体方法包括：取步骤5.4文库10ng，rca时间30min进行以制备dnb(dna纳米球)后，选择bgiseq500测序平台、pe50+10测序类型进行测序；下机数据分析显示总数据比对率(totalmappedrate)达到92％以上、唯一比对率(uniquemappedrate)达到79％以上，以上数据显示测序质量较稳定，证明本方法构建文库成功。

以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。

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<110>深圳华大生命科学研究院

<120>一种外泌体微量dna的建库方法

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