DNA编码化合物库中On-DNA芳硝基化合物还原成On-DNA芳胺化合物的方法与流程

本发明属于有机合成技术领域，具体涉及一种dna编码化合物库中on-dna芳硝基化合物还原得到on-dna芳胺化合物的方法。

背景技术：

美国scripps研究院的sydneybrenner和richardlerner教授于1992年提出了dna编码化合物库(dnaencodedlibrary，简称del)的概念(参考文献：proc.natl.acad.sci.,1992,89,5381，专利：us5573905)，该方法通过将一个有机小分子试剂与一段独特序列的dna在分子水平进行连接(即对小分子试剂进行dna标记)，利用组合化学的“组合-拆分”策略通过两个至多个循环快速地构建数量巨大的化合物库，该化合物库中每一个化合物都由不同有机小分子试剂残基组成，并由相应的唯一碱基序列的dna标识，将极少量的dna编码化合物库与靶标进行亲和筛选，与靶标没有吸附的化合物库分子先被洗掉，留下的与靶标有吸附的化合物库分子再洗脱下来，这时得到的化合物库分子浓度很低，常规手段难以分析和识别，但是通过dna独有的聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，简称pcr)可以把得到的与靶标有吸附的化合物库分子中的dna部分进行复制扩增直至得到的dna量可以被dna测序仪识别，测序后的数据再通过构建dna编码化合物库时创建的有机小分子试剂与每个具体dna碱基序列之间的关系表来解码，进而找到可以识别具有潜在活性分子相对应的具体化合物对应的有机小分子试剂，我们再通过传统的有机合成方法把这些有机小分子试剂组合在一起得到筛选的目标分子，再检测并确认其对靶标的生理活性。

dna编码化合物库的构建方法主要有三种，第一种是以美国ensemble公司为主利用dna模板技术得到的dna导向分子库(dna-templatedchemicallibrarysynthesis，简称dtcl)，第二种是以美国gsk公司，x-chem公司和国内的成都先导公司为主利用dna标记技术得到的dna记录分子库(dna-recordedchemicallibrary，简称drcl)，第三种是以瑞士philogen公司为主基于片段的药物设计(fragment-baseddrugdiscovery，简称fbdd)技术得到的编码自组装分子库(encodedself-assemblingchemicallibraries，简称esac)，目前工业上被大量运用的构建dna编码化合物库的方法主要是第二种，该方法操作简单，成本更低，能更快速地利用组合化学方法得到含有海量的化合物的dna编码化合物库。

除了dna起始片段(详见本公司发明专利申请号：201711263372.3，201711318894.9)外，需要有大量的dna标签和可以按照一定顺序进行反应的有机小分子试剂。dna标签的编码可以通过一定的计算机程序来获得(详见本公司发明专利申请号：201711247220.4)，再通过dna合成仪得到具体的dna碱基序列的引物；有机小分子试剂的获得，可以使用一定的计算机程序来对获得的试剂清单进行筛选得到(详见本公司发明专利申请号：201810378969.0)。

del库领域目前最主要的工作之一是dna上化学反应的开发，简称on-dna化学反应。因为dna必须在一定比例的水相中，ph范围，温度范围，金属离子浓度和无机盐浓度下才能保持稳定，因此，具有较好的dna回收率和底物适应性广的on-dna化学反应，才是大规模应用于dna编码化合物库的合成需要的。on-dna化学反应的种类越多，条件越丰富，在dna编码化合物库的设计时的选择性才越多，最终dna编码化合物库的合成成功率才越高，得到的dna编码化合物库的多样性才越丰富。

目前公开报道的on-dna化学反应种类大概有50多种，每种的反应条件少则一种，多则十几种，可以说，在其他情况一样的情况下，掌握on-dna化学反应种类和条件越多的公司，在dna编码化合物库的设计和合成中的优势就越大。

表1drcl的on-dna化学反应种类

在这些反应中，酰胺键的形成是dna编码化合物库合成中十分常用的on-dna化学反应之一，除了常规的羧基和氨基的直接酰胺化反应外，因为库合成的多步反应的特性，经常需要进行功能团的转化，如保护的氨基的脱保护，保护的酯基的水解，其中，芳硝基在还原剂的存在下还原为芳胺也是一种常见的制备芳胺的方法。

on-dna芳硝基化合物的还原方法目前公开报道的文献有三种。第一种是用水合肼为氢源，raneyni为还原剂，在室温下还原on-dna芳硝基化合物为芳胺(参考文献：bioconjugatechem.,2015,1623-1632)；第二种是用水为氢源、硫酸亚铁为还原剂，氢氧化钠存在的情况下，在80℃或更低的温度下还原on-dna芳硝基化合物为芳胺(参考文献：acscomb.sci.,2018,20,251-255)；第三种是用水为氢源、连二亚硫酸钠为还原剂，甲基紫精存在的情况下，在80℃下短时间还原on-dna芳硝基化合物为芳胺(参考文献：bioconjugatechem.,2017,28,2575)。第一种方法的raneyni不是均相溶液，很难通过移液批量加入，过量的ni金属残留对dna也有一定的破坏作用，第二种方法二价fe的使用对于库中金属残留的控制是一个难题，且反应过程中容易产生墨绿色沉淀，后处理困难，强碱的使用也不利于下一步的氨基需要参与的反应，第三种方法经常出现氨基亚硫酸盐的副产物，且难以转化为产物。

为了解决如上问题，我们希望开发一种简便、快捷、不需要金属还原剂的on-dna芳硝基化合物的还原反应，适用于大批量多孔板的dna编码化合物库生产的on-dna芳硝基化合物的还原方法。

技术实现要素：

一、本发明的目的在于提供一种用于dna编码化合物库构建中的on-dna芳硝基化合物经还原反应将硝基还原为氨基制备on-dna的芳胺化合物的方法，其中，on-dna芳硝基化合物的结构式为：dna-ar-no2，所制备得到的on-dna芳胺化合物的结构式如所示：

dna-ar-nh2

其中，结构式中的dna是由经人工修饰的和/或未修饰的核苷酸单体聚合得到的单链或双链的核苷酸链；

其中，结构式中的ar是单环或双环的芳香环，所述on-dna芳硝基化合物的-no2连接于ar的环上，所述on-dna芳胺化合物的nh2连接于ar的环上；

其中，结构式中的dna与ar通过一个化学键或多个化学键连接。一个化学键时，是指结构式中的dna与ar直接相连；多个化学键时，指结构式中的dna与ar之间间隔多个化学键相连，比如，dna与ar之间了通过一个亚甲基(-ch2-)相连，即通过两个化学键连接；或dna与ar通过一个羰基(-co-)连接dna的氨基，也是通过两个化学键连接；或dna与ar通过一个亚甲基羰基(-ch2co-)连接dna的氨基，也是通过三个连续的化学键连接。

具体的，ar可以选自以下基团：

r1为氢、卤素、氨基、硝基、氰基、羟基、巯基、芳基甲酮、烷基甲酮、c1-c12烷基、c1-c6烯烃基、c1-c6炔烃基、c3-c8环烷基、c1-c6烷基氧基、c1-c6烷基氨基中的任意一种至多种的随机组合，ar上可以有一个或多个r1基团；r2为连接dna部分的功能团，具体是一个可以与dna上的功能团互补反应的功能团，可以是氨基、羧基、醛基、芳卤中的任意一种，r2可以直接与ar相连，也可以间隔多个化学键相连；x为o、s、nh或烷基取代氨基中的任意一种。

二、本发明的另一个目的在于提供一种反应条件温和，不使用任何金属催化剂，成本低、后处理简单、环境友好，产率高，适合于大批量多孔板进行的dna编码化合物库的合成中的on-dna芳硝基化合物还原为on-dna芳胺的方法。以dna模板和含有羧酸芳硝基二元化合物原位生成的on-dna芳硝基化合物为原料，以水为氢源，硼试剂为还原剂，以乙腈、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、n-甲基吡咯烷酮、二甲基亚砜、乙醇、甲醇、叔丁醇、异丙醇、四氢呋喃、水、无机盐缓冲液(硼酸盐、磷酸盐、碳酸盐)、有机酸缓冲液(醋酸、hepes、taps、mes)、有机碱缓冲液(三乙胺、三羟甲基氨基甲烷)中的任意一项或几项为溶剂，温度为20-100℃的条件下反应1-24小时，具体反应方程式如下：

所述的硼试剂为四羟基二硼(b2(oh)4，cas：13675-18-8)、硼酸(h3bo3，cas：11113-50-1)、苯硼酸(ph(oh)2，cas：98-80-6)、4-氯苯硼酸(4-cl-ph(oh)2，cas：1679-18-1)、烯丙基硼酸频哪醇酯(allyl-bpin，cas：72824-04-5)、频哪醇硼烷(hbpin，cas：25015-63-8)、联硼酸频哪醇酯(b2pin2，cas：78183-34-3)、2-蒽硼酸(cas：141981-64-8)、双(新戊基乙二醇)二硼(cas：201733-56-4)、双联(2,4-二甲基-2,4-戊二醇)硼酸酯(cas：230299-46-4)、4,4',5,5'-四甲基-2,2'-联-1,3,2-二氧硼杂环戊烷(cas：230299-23-7)、双[(-)蒎烷二醇]二硼酯(cas：230299-05-5)、联硼酸新戊二醇酯(cas：201733-56-4)、双联邻苯二酚硼酸酯(cas：13826-27-2)、双联(2-甲基-2,4-戊二醇)硼酸酯(cas：230299-21-5)及相应任意一种或几种的混合物。

所述的on-dna芳硝基化合物中，其中，结构式中的dna是由经人工修饰的和/或未修饰的核苷酸单体聚合得到的单链或双链的核苷酸链；

其中，结构式中的ar是单环或双环的芳香环，所述on-dna芳硝基化合物的-no2连接于ar的环上，所述on-dna芳胺化合物的nh2连接于ar的环上；

其中，结构式中的dna与ar通过一个或多个化学键连接。一个化学键时，是指结构式中的dna与ar直接相连；多个化学键时，指结构式中的dna与ar之间间隔多个化学键相连，比如，dna与ar之间了通过一个亚甲基(-ch2-)相连，即通过两个化学键连接；或dna与ar通过一个羰基(-co-)连接dna的氨基，也是通过两个化学键连接。

具体的，ar可以选自以下基团：

r1为氢、卤素、氨基、硝基、氰基、羟基、巯基、芳基甲酮、烷基甲酮、c1-c12烷基、c1-c6烯烃基、c1-c6炔烃基、c3-c8环烷基、c1-c6烷基氧基、c1-c6烷基氨基中的任意一种至多种的随机组合，ar上可以有一个或多个r1基团；r2为连接dna部分的功能团，具体是一个可以与dna上的功能团互补反应的功能团，可以是氨基、羧基、醛基、芳卤中的任意一种，r2可以直接与ar相连，也可以间隔多个化学键相连；x为o、s、nh或烷基取代氨基中的任意一种。

该on-dna芳胺产物的定义中，所用术语不论单独使用还是用在复合词中，代表如下取代基：

卤素：指氟、氯、溴、碘；

c1-c12烷基：指直链或支链烷基；

c1-c6烯烃基：指直链或支链烯烃基，含有一个或多个烯烃基团；

c1-c6炔烃基：指直链或支链炔烃基，含有一个或多个炔烃基团；

c3-c8环烷基：指饱和或不饱和的环烷基。

本发明为on-dna芳胺化合物的合成提供新的方法，本发明的硼试剂是理想的水活化剂，而且硼酸是唯一副产物，与现有的另外三种技术相比，催化剂廉价易得、反应条件温和、选择性高、产率高、后处理简单、不需要检测金属残留、对dna破坏小、适合大批量多孔板的dna编码化合物库的生产。

附图说明

图1为本发明的还原方法的原料制备方法，dna-nh2与203个含有羧基芳硝基的二元化合物使用edci为缩合剂、s-nhs为缩合活化剂，原位反应得到相应的on-dna芳硝基化合物的化学反应式。

图2为本发明的还原方法的原料制备产率情况分布，dna-nh2与203个含有羧基和芳硝基的二元化合物使用edci为缩合剂、s-nhs为缩合活化剂原位反应得到相应的on-dna芳硝基化合物的产率分布(产率以lcms-ltq上的tic峰面积为准)，其中，纵坐标是试剂个数，横坐标是转化率区间，如20％表示10％＜转化率≤20％。

图3为本发明的还原方法的原料制备代表结构式及其产率，dna-nh2与203个含有羧基和芳硝基的二元化合物使用edci为缩合剂、s-nhs为缩合活化剂原位反应得到相应的on-dna芳硝基化合物的代表结构式及其产率(产率以lcms-ltq上的tic峰面积为准)。

图4为本发明参照文献报道的用硫酸亚铁做还原剂，在氢氧化钠存在下还原203个原位生成的on-dna芳硝基化合物为on-dna芳胺化合物的化学反应式。

图5为本发明用四羟基二硼做还原剂还原203个原位生成的on-dna芳硝基化合物为on-dna芳胺化合物的化学反应式。

图6为本发明用硫酸亚铁做还原剂和用四羟基二硼做还原剂，还原相同的203个原位生成的on-dna芳硝基化合物为on-dna芳胺化合物的产率分布比较(产率以lcms-ltq上的tic峰面积为准)，其中，纵坐标是试剂个数，横坐标是转化率区间，如20％表示10％＜转化率≤20％。

图7为本发明用硫酸亚铁做还原剂和用四羟基二硼做还原剂，还原相同的203个原位生成的on-dna芳硝基化合物为on-dna芳胺化合物的代表结构式产率比较(产率以lcms-ltq上的tic峰面积为准)。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1，on-dna芳胺化合物的合成

1.96孔板情况下的具体操作步骤如下：

1)on-dna芳硝基化合物的合成

dna-nh2(例如专利cn108070009a的提及的起始头片段)溶于250mm,ph＝9.4的硼酸缓冲液，配制成1mm浓度溶液，分装到96孔板中，与203个含有羧基和芳硝基的二元化合物使用edci作为缩合剂、s-nhs缩合活化剂反应得到相应的on-dna芳硝基化合物(参考文献：nat.chem.,2015,7,3,241，见图1)，该反应完成后只做乙醇沉淀处理，浓缩干燥后直接用于下一步的还原反应。

203个含有羧基和芳硝基的二元化合物与dna-nh2缩合产率分布见图2，代表试剂结构见图3。

2)on-dna芳胺化合物的合成

用硫酸亚铁为还原剂，氢氧化钠存在的情况下还原反应(见图4)：

原位生成的dna-ar-no2重新溶解于250mm,ph＝9.4的硼酸缓冲液，配制成1mm浓度溶液，用12道移液器分装一半体积的溶液到新的96孔板中。

向原来的203个(3块96孔板)原位生成的dna-ar-no2的每个孔(4.5μl,4.5nmol,1mm硼酸缓冲液(250mm,ph＝9.4))依次加入feso4.7h2o(1.8ul,360nmol,200mm超纯水,80当量)和naoh溶液(0.90ul,900nmol,1000mm超纯水,200当量)，离心，让溶液沉底，涡旋混匀，再次离心后，封膜，96孔板在pcr仪器中80℃下反应6小时(盖温：100℃)，再次每个孔依次补料feso4.7h2o(1.8ul,360nmol,200mm超纯水,80当量)和naoh溶液(0.90ul,900nmol,1000mm超纯水,200当量)，离心，让溶液沉底，涡旋混匀，再次离心后，封膜，96孔板在pcr仪器中80℃下反应6小时(盖温：100℃)。

用四羟基二硼为还原剂还原反应(见图5)：

向新分出的一半体积的原位生成的dna-ar-no2溶液的每个孔(4.5μl,4.5nmol,1mm硼酸缓冲液(250mm,ph＝9.4))加入四羟基二硼(4.5μl,900nmol,200mm超纯水,200当量)，离心，让溶液沉底，涡旋混匀，再次离心后，封膜，96孔板在pcr仪器中80℃下反应2小时(盖温：100℃)，再次每个孔补料四羟基二硼(4.5μl,900nmol,200mm超纯水,200当量)，离心，让溶液沉底，涡旋混匀，再次离心后，封膜，96孔板在pcr仪器中80℃下反应2小时(盖温：100℃)。

反应完毕后乙醇沉淀：

向96孔板的每个孔加入总反应液体积10％的5m氯化钠溶液，封膜，振荡混匀后，加入总体积3倍的在-20℃储存的冷无水乙醇，于-80℃冰箱冷冻2小时，之后拿出在4℃以4000g的离心力离心30分钟，吸除上清液，沉淀用去离子水溶解后于-40℃真空冻干，得到产物，通过酶标仪检测od确认回收率，同时检测lcms确认每个小分子的转化率。

我们共计验证了203个原位生成的dna-ar-no2在硫酸亚铁为还原剂和四羟基二硼为还原剂的还原反应转化率比较，具体转化率比较见图6，代表试剂结构见图7。可见四羟基二硼为还原剂，相比经典的硫酸亚铁为还原剂，可以将还原转化率大于等于80％的试剂个数从37个(占比18.2％)提高到61个(占比30.0％)，提高率达64.8％。

该方法加入试剂种类少，反应液ph更接近中性，不使用任何金属催化剂、后处理简单、环境友好，产率高，不需要后续再次检测金属残留，适合使用多孔板进行的dna编码化合物库的合成。

综上所述，上述各实施例及附图仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。