本发明涉及分子生物学领域，特别涉及一种苯丙酮尿症的检测试剂盒，该试剂盒适合于在中国西北地区应用。
背景技术：
苯丙酮尿症(phenylketonuria,pku)是一种最常见常染色体隐性遗传代谢病，因苯丙氨酸羟化酶(phenylalaninehydroxylase,pah)基因突变导致pah活性降低或丧失，苯丙氨酸(phenylalanine,phe)在肝脏中代谢紊乱所致。未经治疗的pku患者血液和组织中phe浓度增高由于过量的phe和旁路代谢产物的神经毒性作用而渐出现发育迟缓、智力缺陷、语言障碍、小头畸形、孤独症、皮肤湿疹和癫痫抽搐等不同程度且不可逆的智能损害。苯丙氨酸血症(pku)一种先天性氨基酸代谢障碍，以苯丙氨酸羟化酶活性缺乏，致血浆苯丙氨酸浓度升高为特征，常造成严重智能迟缓。苯丙氨酸是人体必需的氨基酸之一。正常人每日需要的摄入量约为200～500毫克，其中1/3供合成蛋白，2/3则通过肝细胞中苯丙氨酸羟化酶(pah)的转化为酪氨酸，以合成甲状腺素、肾上腺素和黑色素等。苯丙氨酸转化为酪氨酸的过程中，除需pah外，还必须有四氢生物蝶呤(bh4)作为辅酶参与。基因突变有可能造成相关酶的活性缺陷，致使苯丙氨酸发生异常累积。本病在遗传性氨基酸代谢缺陷疾病中比较常见，其遗传方式为常染色体隐性遗传。
pku发病率有种族和地区差异，白人发病率较高，黑人和黄色人种较低。发病率在欧洲为约1/10,000，北爱尔兰约为1/4400,德国约为1/7000,日本约为1/120,000,我国的pku发病率约为1/11,188，其中北方地区发病高于南方地区。而北方地区中西北地区明显高于全国平均水平，其中陕西地区发生率为1/7358，宁夏地区为1/3423，青海地区1/3850，新疆地区为1/5719，甘肃地区发生率1/3420，明显高于国内平均水平，这可能西北地区独特的地理位置和民族构成有关。而本地区的pku筛查覆盖率和治疗率均落后于发达城市，大部分患儿得不到及时的诊治，导致高苯丙氨酸血症和智力低下，不仅严重地影响了人口的素质，增加了婴儿死亡率，而且给家庭和社会带来不可估量的损失。因此pku的早期诊断、早期治疗，有效预防患者患儿的出生，对于控制该pku的发生和发展显得尤为重要。
根据西北地区人群中pku发病率推算该地区pah基因突变携带频率可达到4％，因此建立一种快速、高效、低成本的基因检测手段，在本地区开展孕前人群的携带者筛查，并对高风险夫妇进行产前诊断，从而在根本上预防pku患者的发生，将pku的预防从出生后的新生儿筛查提前到了孕前或孕期，这对于pku防治将意义重大。
pah基因数据库登记的突变已经有500余种，大部分是复合杂合子，主要位于编码区的小的遗传学变化。在pah基因中只影响一个或几个氨基酸，其对酶活性的影响主要依赖于突变的形式和位置。pah基因突变类型多样，可分为致病突变和沉默突变。其中有300余种是错义突变占61.93％，其余依次为缺失突变13.45％、剪接位点突变10.89％，沉默突变6.06％，无义突变4.92％等。致病突变影响pah基因转录和翻译及蛋白质的异常折叠、聚合，以及加速降解，从而影响pah的活性。沉默突变对pah的活性无影响。pah基因突变位置多变，所有的外显子、内含子、上下游的非翻译区均发现突变，致病突变大多位于外显子或内外显子的交接区。发生突变的基因的区域频率亦不同，其中e7占16.10％，e6占13.61％，余依次为e10、e11、e12等。pku的突变呈现明显的异质性，不同种族和地区人群之间pku突变部位及分布具有较大的差异。欧洲人pku患者的常见突变位于外显子12和内含子12，分别为r408q(31％)和ivsl2nt+lg>a(11％)；东方pku患者pah基因突变数较多,涉及13个外显子。常见的突变位于外显子7、12、6、3和11等，主要位点为r413、r243q、y240c、r252q、r111x、y356x、ivs4nt-1g＞a等。
目前，关于苯丙酮尿症常规的临床诊断方法主要有血苯丙氨酸测定、尿液蝶呤谱分析、血红细胞二氢生物喋啶还原酶活性测定、头颅核磁共振检查等，这些传统方法不仅不能对患者进行早期诊断，而且对于明确鉴别杂合子和正常个体有一定困难。
目前用于已知突变位点筛查的方法主要有：等位基因特异寡核苷酸(allelespecificoligonucleotide,aso)探针斑点杂交、等位基因特异性pcr/多重等位基因特异性pcr(allelespecificpolymerasechainreaction,as-pcr/multiplexallele-specificpcr,mas-pcr)、taqman分型技术、dna微阵列芯片(dnamicroarraychip)、多色探针溶解曲线分析技术(muticolormeltingcurveanalysis,mmca)、snapshot方法、massarray核酸质谱技术等，每种检测技术均有其优势和局限性。aso、as-pcr、mas-pcr和taqman分型技术相对通量较低，适合于临床数个突变位点的少量样本检测，其具有成本相对较低，操作灵活的特点。dna微阵列芯片、mmca、snapshot、massarray方法均属于高通量检测方法，可以同时检测多达几百个样本的数十个位点。
snapshot、massarray方法均基于dna微测序的检测原理，通过分析单碱基延伸产物进行基因分析。snapshot用不同荧光标记ddntp，在通过毛细管电泳分析带有不同荧光的延伸产物的长度和荧光种类来确定目标突变位点的基因型。massarray则直接通过质谱分析单碱基延伸产物的分子量，从而确定延伸突变位点的基因型，其灵敏度和特异性均高于snapshot。
massarray核酸质谱技术于2000年问世，是基于massarray分子量阵列基因分析系统的新技术，能对基因组进行全方位的定性和定量研究。基本原理是将样品分散在基质分子中并形成晶体。当用激光照射晶体时，基质从激光中吸收能量，样品解吸附，基质-样品之间发生电荷转移使得样品分子电离，电离的样品在电场作用下飞过真空的飞行管，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测，即通过离子的质量电荷之比(m/z)与离子的飞行时间成正比来分析离子，并测得样品分子的分子量。例如，检测dna样品时，dna离子按其质量大小先后通过检测器，dna片段越短，越早到达检测器。该系统整合了pcr技术和质谱技术，因此同时拥有了高灵敏度和高精确度。同时massarray基因质谱技术无需杂交，不存在潜在的杂交错配干扰，无需荧光染料等标记物，直接以核酸样本的分子量为标记对核酸进行精确的定性、定量分析，适用于各种类型的核酸分析实验，包括：snp基因型及gwas验证、基因表达及cnv定量、dna甲基化定位定量、基因突变检测及病原体分子分型等诸多应用。massarray集成了微阵列芯片的技术优势，可以在一张芯片上同时检测384个样本，每个样本可检测多达数十个的目标突变位点。因此massarray基因分型技术高通量、快速、准确、低费用的优点可以满足大规模突变筛查的要求。
技术实现要素：
本部分发明采用飞行时间质谱(maldi-tof-ms)技术建立一种快速、高通量的pah基因热点突变检测方法。通过第一部分的发明结果，筛选了频率较高的突变位点，通过引物及检测体系的验证，对105例pku患者进行突变检测结果显示，该方法检测结果与sanger测序结果完全一致。
在一种实施方式中，本发明提供一种苯丙酮尿症的检测试剂盒，所述试剂盒包括检测pah基因至少以下突变位点的试剂：c.728g>a、c.611a>g(5.58％)、c.1068c>a、c.1238g>c、c.442-1g>a、c.1197a>t、c.721c>t、c.331c>t、c.842+2t>a和c.194t>c。
在一种实施方式中，本发明提供的苯丙酮尿症的检测试剂盒包括检测pah基因至少以下突变位点的试剂：c.728g>a、c.611a>g、c.1068c>a、c.442-1g>a、c.1197a>t、c.1238g>c、c.331c>t、c.842+2t>a、c.194t>c、c.764t>c、c.782g>a、c.721c>t、c.1199g>a、c.526c>t、c.208_210deltct、c.1222c>t、c.781c>t、c.1301c>a、c.694c>t、c.498c>g、c.739g>c、c.838g>a、c.1199g>c、c.473g>a、c.740g>t、c.910c>a、c.1315+6t>a、c.1045t>c、c.482t>c、c.59_60ag>cc、c.1256a>g、c.505c>a、c.1252a>c、c.1174t>a和c.688g>a。
在一种实施方式中，本发明提供的苯丙酮尿症的检测试剂盒包括检测pah基因至少以下突变位点的试剂：c.728g>a、c.611a>g、c.1068c>a、c.442-1g>a、c.1197a>t、c.1238g>c、c.331c>t、c.842+2t>a、c.194t>c、c.764t>c、c.782g>a、c.721c>t、c.1199g>a、c.526c>t、c.208_210deltct、c.1222c>t、c.781c>t、c.1301c>a、c.694c>t、c.498c>g、c.739g>c、c.838g>a、c.1199g>c、c.473g>a、c.740g>t、c.910c>a、c.1315+6t>a、c.1045t>c、c.482t>c、c.59_60ag>cc、c.1256a>g、c.505c>a、c.1252a>c、c.1174t>a和c.688g>a。
在一种实施方式中，本发明提供一种利用飞行时间质谱技术的苯丙酮尿症检测试剂盒，所述试剂盒检测如下突变位点的试剂：c.728g>a、c.611a>g、c.1068c>a、c.442-1g>a、c.1197a>t、c.1238g>c、c.331c>t、c.842+2t>a、c.194t>c、c.764t>c、c.782g>a、c.721c>t、c.1199g>a、c.526c>t、c.208_210deltct、c.1222c>t、c.781c>t、c.1301c>a、c.694c>t、c.498c>g、c.739g>c、c.838g>a、c.1199g>c、c.473g>a、c.740g>t、c.910c>a、c.1315+6t>a、c.1045t>c、c.482t>c、c.59_60ag>cc、c.1256a>g、c.505c>a、c.1252a>c、c.1174t>a和c.688g>a，其分成两个组反应进行检测，第一组检测以下突变位点：c.526c>t、c.505c>a、c.1222c>t、c.1238g>c、c.1068c>a、c.838g>a、c.1301c>a、c.1256a>g、c.59-60ag>cc、c.842+2t>a、c.194t>c、c.442-1g>a、c.498c>g、c.473g>a和c.1315+6t>a；和第二组检测以下突变位点：c.1199g>a、c.1199g>c、c.782g>a、c.764t>c、c.331c>t、c.781c>t、c.910c>a、c.728g>a、c.1197a>t、c.688g>a、c.1045t>g、c.1174t>a和c.721c>t。
在一种实施方式中，利用飞行时间质谱技术的苯丙酮尿症检测试剂盒，针对拟检测目标基因位点的区域设计特异性扩增引物对与延伸引物如下：
c.526c>t：多重pcr扩增引物对和延伸引物分别是：seqidno:27，seqidno:28；和seqidno:29；
c.505c>a：多重pcr扩增引物对和延伸引物分别是：seqidno:30，seqidno:31；和seqidno:32；
c.1222c>t：多重pcr扩增引物对和延伸引物分别是：seqidno:33，seqidno:34；和seqidno:35；
c.1238g>c：多重pcr扩增引物对和延伸引物分别是：seqidno:36，seqidno:37；和seqidno:38；
c.1068c>a:多重pcr扩增引物对和延伸引物分别是：seqidno:39，seqidno:40；和seqidno:41；
c.838g>a:多重pcr扩增引物对和延伸引物分别是：seqidno:42，seqidno:43；和seqidno:44；
c.1301c>a:多重pcr扩增引物对和延伸引物分别是：seqidno:45，seqidno:46；和seqidno:47；
c.1256a>g:多重pcr扩增引物对和延伸引物分别是：seqidno:48，seqidno:49；和seqidno:50；
c.59-60ag>cc:多重pcr扩增引物对和延伸引物分别是：seqidno:51，seqidno:52；和seqidno:53；
c.842+2t>a:多重pcr扩增引物对和延伸引物分别是：seqidno:54，seqidno:55；和seqidno:56；
c.194t>c:多重pcr扩增引物对和延伸引物分别是：seqidno:57，seqidno:58；和seqidno:59；
c.442-1g>a:多重pcr扩增引物对和延伸引物分别是：seqidno:60，seqidno:61；和seqidno:62；
c.498c>g:多重pcr扩增引物对和延伸引物分别是：seqidno:63，seqidno:64；和seqidno:65；
c.473g>a:多重pcr扩增引物对和延伸引物分别是：seqidno:66，seqidno:67；和seqidno:68；
c.1315+6t>a:多重pcr扩增引物对和延伸引物分别是：seqidno:69，seqidno:70；和seqidno:71；
c.1199g>a:多重pcr扩增引物对和延伸引物分别是：seqidno:72，seqidno:73；和seqidno:74；
c.1199g>c:多重pcr扩增引物对和延伸引物分别是：seqidno:72，seqidno:73；和seqidno:74；
c.782g>a:多重pcr扩增引物对和延伸引物分别是：seqidno:75，seqidno:76；和seqidno:77；
c.764t>c:多重pcr扩增引物对和延伸引物分别是：seqidno:78，seqidno:79；和seqidno:80；
c.331c>t:多重pcr扩增引物对和延伸引物分别是：seqidno:81，seqidno:82；和seqidno:83；
c.781c>t:多重pcr扩增引物对和延伸引物分别是：seqidno:84，seqidno:85；和seqidno:86；
c.910c>a:多重pcr扩增引物对和延伸引物分别是：seqidno:87，seqidno:88；和seqidno:89；
c.728g>a:多重pcr扩增引物对和延伸引物分别是：seqidno:90，seqidno:91；和seqidno:92；
c.1197a>t:多重pcr扩增引物对和延伸引物分别是：seqidno:93，seqidno:94；和seqidno:95；
c.688g>a:多重pcr扩增引物对和延伸引物分别是：seqidno:96，seqidno:97；和seqidno:98；
c.1045t>g:多重pcr扩增引物对和延伸引物分别是：seqidno:99，seqidno:100；和seqidno:101；
c.1174t>a:多重pcr扩增引物对和延伸引物分别是：seqidno:102，seqidno:103；和seqidno:104；
c.721c>t:多重pcr扩增引物对和延伸引物分别是：seqidno:105，seqidno:106；和seqidno:107。
相对于其他的突变检测技术，massarray具有以下技术优势：
1)突变检测位点多，覆盖率高：massarray一个反应可对多达36个的变异位点进行基因分型。本发明中第一反应组中同时对15个突变进行了分型，第二反应组包括13个位点，两个反应组可检测pah基因常见的28个突变。发明人采用此检测方案，对50例临床诊断的pku患者进行pah基因诊断，突变检出率达到74％(95％ci,65％-83％)，大大提高了pah基因突变检测的覆盖率。目前较常用的突变分型技术如荧光定量pcr、高分辨熔解曲线(highresolutionmelting,hrm)、arms-pcr等技术一次反应只能检测一个突变位点，突变检出效率很低。
2)通量高，操作简单周期短：massarray所采用的是384或者96芯片，可在一张芯片上完成多达384个反应的同时检测，按照每个反应20个位点计算，完成一张芯片检测相当于近8000个单位点单样本的检测反应。而且massarray主要步骤只需要多重pcr扩增和单碱基延伸两步反应，操作过程简单，可在一天内完成。因此该方法适合于人群中进行大规模、大范围的基因突变筛查。
3)高准确率，高稳定性：massarray方法直接检测单碱基延伸产物的分子量，通过分子量的变化直接判读分型结果，不需要荧光标记，避免了荧光标记的质量对结果的影响，而且检测系统为非杂交依赖性，不存在潜在杂交错配的干扰。基于探针杂交的检测方法通常不能准确区分探针覆盖区域的碱基改变，往往需要进一步sanger测序进行验证。本发明中对105例样本进行检测，检测结果与sanger测序完全一致。
4)低成本：massarray是基于时间飞行质谱分析检测的方法，直接检测dna产物，在探针设计上不需要荧光标记，不需要化高昂的费用用于探针的荧光标记；而且其探针并非预制在芯片上，由于质谱检测的芯片是通用型的，不同的检测通过合成不同的引物和探针直接进行调整，检测灵活，降低了试剂根本。虽然质谱仪购置成本较贵，但是如用于大规模筛查，其平均每个样本的成本就很低。而且相对于sanger测序、生物芯片技术，其检测成本更低，适合于做人群的突变携带者筛查。
具体实施方式
为了使本领域技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合下面结合实施例对本发明作进一步说明，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本申请保护的范围。
实施例1中国西北地区pku患者的pah基因突变谱的建立
收集整理2007年1月至2017年1月在甘肃省妇幼保健院新生儿筛查中心、医学遗传学中心确诊的苯丙酮尿症患者共475个核心家系，患者来自于西北地区，包括甘肃、陕西、宁夏、青海、新疆西北地区。根据分型标，依据患者治疗前血苯丙氨酸浓度将475例患者分为三种类型：经典型pku(classicalpku，phe≥1200μmol/l)253例；中间型pku(mildpku，phe:360～1200μmol/l)150例；轻度高苯丙氨酸血症(mhp，phe:120～360μmol/l)72例。所有患儿均通过了phe负荷试验和尿蝶呤分析结合临床症状排除了四氢生物喋呤缺乏症。在患儿家属的知情同意下，采集患儿及父母静脉血3ml，edta抗凝，-20℃储存，长期保存样本置于-80℃超低温冰箱，建立遗传病生物样本库。静脉血标本采集困难的患儿采集干滤纸血片标本，室温干燥后，2-8℃保存。
正常对照样本：按照随机数字表法，随机抽取2016年6月在甘肃省妇幼保健院新生儿筛查中心筛查的新生儿血斑样本100例，参与抽样的样本血phe浓度均<120μmol/l。
全血基因组dna采用北京天根公司的全血基因组dna提取试剂盒(dp348)进行提取。用滤纸收集的患者全血样本采用chelex-100法提取基因组dna。使用nanodrop2000超微量分光光度计检测提取dna浓度及纯度，对于提取结果进行质量控制，浓度>20ng/μl，a260/a280>1.7，浓度和纯度达不到质控要求的样本重新进行提取。提取dna样本分3管置于-20℃长期保存，短期内使用的样本-4℃备用。
一.pah基因外显子扩增引物设计与合成
检索ucsc数据库获得pah基因参考基因序列(ng_008690.1)和cdna序列(nm_000277.1)，采用primer5.0引物设计软件设计13对引物，分别扩增苯丙氨酸羟化酶基因1-13外显子及侧翼序列(表1)。引物合成委托上海生工生物工程技术有限公司合成，采用page法进行纯化。atgaaaccaggaagcaccag
表1.苯丙氨酸羟化酶基因全长外显子扩增引物序列及扩增片段长度
二.外显子pcr扩增
pcr反应体系如下表2：
表2pah基因外显子pcr扩增体系
pcr反应条件如下：
三.pcr反应产物电泳检测
pcr产物用2％的琼脂糖凝胶电泳，将5μlpcr产物与1μl电泳缓冲液混合后上样，电泳条件为120v电压，30分钟。选择电泳检测目的条带清晰单一的产物进行后续测序反应。
四.sanger测序
1.测序反应前pcr产物纯化(使用天根生物科技有限公司pcr产物纯化试剂)
1)吸附柱预处理：向纯化吸附柱中加入500μl平衡液bl，12,000rpm，离心1min，弃掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管。
2)将50μl与250μl结合液pb充分混合后加入吸附柱中，放置2分钟，室温下12,000rpm，离心30s，弃掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管。
3)向吸附柱中加入600μl漂洗液pw，室温下放置5min，12,000rpm，离心30s，弃掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管。
4)重复步骤。
5)将吸附柱放回收集管，12,000rpm，离心2min，彻底去除漂洗液。室温放置10min，彻底挥发残留的乙醇。
6)将吸附柱放入新的1.5ml离心管中，并向其中加入30μl洗脱缓冲液eb，室温放置5min，12,000rpm，离心2min，收集dna溶液备用。
2.测序反应体系及条件
测序反应体系如下表：
表3测序反应体系
测序反应条件：
3.测序反应产物纯化
1)每管测序反应产物内加入纯化试剂31μl(95％乙醇/7.5m乙酸铵30:1)，在混悬器上充分震荡混匀。
2)在4℃离心机中，4000rpm，离心30min，弃上清。
3)每管加入70％乙醇50μl，在4℃离心机中，4000rpm，离心30min，弃上清。
4)避光晾干或者放pcr仪上烘干，95℃10s。
5)再在室温晾干至无酒精味。
6)每管加入10μl甲酰胺hidi(abi)，室温放置10min。
4.毛细管电泳检测
测序产物经纯化后在abi3500dx测序仪上进行毛细管电泳，所用毛细管为50cm,电泳胶为pop7(abi),电压：19.5kv，电泳峰图采用abi开发的软件sequencinganalyst进行序列分析。测序结果采用chromas2.33查看序列及峰图，用dnastar.lasergenev7.1软件包中的seqman软件比对样本序列与正常参考序列，确定变异位点。
采用spss16.0软件进行统计学分析，比较不同突变位点在不同类型患者中的分布频率差异采用χ2检验。
五.pku患者中pah基因突变检测结果
在475个pku家系的950个等位基因中检测到896个突变，检出率为94.32％(表5)。其中253个经典型pku家系中检出率为96.25，150个中间型pku家系中检出率为94.79％，74个轻度高苯丙氨酸血症(mhp)家系中检出率为88.89％。
475例患者中425例检测到两个突变等位基因，46例患者检测到一个突变，4例患者未检测到突变。所有患者检测到的突变均进行了父母来源验证，未发现新发突变。
表4中国西北地区pku患者中pah基因突变谱
六.pku患者中pah基因突变分布特点
在检测到的896个突变等位基因中频率最高的是c.728g>a(14.00％)、其次是c.611a>g(5.58％)、c.1068c>a(4.95％)、c.1238g>c(4.74％)、c.442-1g>a(4.32％)、c.1197a>t(4.11％)、c.721c>t(4.11％)、c.331c>t(2.95％)、c.842+2t>a(2.95％)、c.194t>c(2.53％)，以上10个突变位点突变频率总和达到50.21％。突变等位基因发生频率最高的是外显子7(33.04％)、其次是外显11(15.29％)、外显子12(12.7％)、外显子5(10.4％)、外显子3(9.15％)、外显子6(8.37％)，这6个高发的外显子占总突变频率的88.61％。
表5pah基因突变在外显子的分析
七.pku患者中pah基因突变分布
通过sanger测序结合mlpa检测技术对475例患者进行了pah基因突变分析，在950个等位基因中检测896个突变等位基因，突变检出率为94.32％，鉴定了128个突变位点。结果提示pah基因存在明显的等位基因异质性。128个突变位点分布于pah基因除外显子4外的所有外显子及侧翼的内含子区域，突变等位基因发生频率最高的是外显子7(33.04％)、其次是外显11(15.29％)、外显子12(12.7％)、外显子5(10.4％)、外显子3(9.15％)、外显子6(8.37％)，这6个高发的外显子占总突变频率的88.61％。提示中国人群中此6个外显子是突变的热点区域。国外学者报道欧洲人群pah基因常见突变位于外显子12及其侧翼的内含子区域，分别为r408w(31％)和ivs12+1g>a(11％)，说明欧洲人群与中国人群在pah基因突变的起源上有显著性差异。
本发明中检测到128个突变位点，其中突变频率最高的c.728g>a(14.00％)、其次是c.611a>g(5.58％)、c.1068c>a(4.95％)、c.1238g>c(4.74％)、c.442-1g>a(4.32％)、c.1197a>t(4.11％)、c.721c>t(4.11％)、c.331c>t(2.95％)、c.842+2t>a(2.95％)、c.194t>c(2.53％)，以上10个突变位点突变频率总和达到50.21％。其中c.728g>a和c.611a>g是通过人群中最常见的两个突变位点，c.194t>c是本发明中首次检测到较高的突变频率。
八.pah基因突变位点的筛选
根据本发明第一部分获得的西北地区pku患者的pah基因突变谱，选择经典型pku患者中突变频率位于前35位的突变位点采用进行飞行时间质谱技术分型，这35个突变占总突变频率的77.68％。其中突变频率前十位的突变位点占所有检测突变的50.21％(表6)
表6中国西北地区pah基因突变热点
实施例2中国西北地区pku患者的pah基因突变谱的massarray的建立
一.massarray基本原理
massarray的核心技术原理为maldi-tof-ms技术，共包含iplex基因型分析、qge基因表达定量分析和iseq病原体比较基因序列分析三种技术。iplex基因分型技术可用于基因型分析、核酸多肽位点的检测中。iplex基因分型法的工作步骤为：第一步，针对拟检测目标基因位点的区域设计特异性扩增引物对与延伸引物，通常一个反应体系中的最大检测重数为36重；第二步，对目标基因区域进行多重pcr扩增；第三步，向扩增反应后的体系中加入虾碱基磷酸酶进行消化反应，从而去除多余的dntps；第四步，向体系中加入对应的延伸引物混合液，进行引物单碱基延伸反应；第五步，对延伸反应产物进行树脂纯化，纯化完成后使用微量点样仪点样，并使样本与芯片上的基质共结晶；最后，利用maldi-tof-ms直接对延伸引物反应前后的分子量进行检测，当目标基因的延伸引物分子量所在位置的峰图被消耗，与此同时延伸产物分子量所在位置有可判定的峰图出现时，证明所检测的样本中存在该突变，详细判读结果需通过sequenom公司开发的typer4.0软件实现。
二.pcr扩增引物及单碱基延伸引物设计合成
检索ucsc数据库获得pah基因参考基因序列(ng_008690.1)和cdna序列(nm_000277.1)，采用sequenom公司开发的assaydesigner4.0软件进行引物设计。在公共数据库中获得pah基因35个突变位点两侧各200bp的序列信息，标注每个位点的准确位置。引物设计的需同时设计扩增引物对和延伸引物，具体的设计原则如下：
pcr扩增引物的设计要求：引物序列应设计在相对保守区域，避开snp位点，除满足基本pcr引物的设计要求外，需注意扩增产物的长度应在100bp-120bp，各引物的退火温度尽量一致，大约在56℃左右。对于突变位点相对集中的位置，可以考虑设计一对pcr扩增引物。多重扩增的引物应充分考虑引物之间的相互干扰和引物二聚体的形成。
单碱基延伸引物的设计要求：延伸引物的长度应在17-28bp之间，3’端的7-9bp范围内的碱基必须与参考序列完全匹配，引物覆盖区域避免出现snp位点，可以通过调整引物在突变位点到的上游或者下游来获得符合要求的引物。质谱分析要求延伸引物的分子量差异小于30da，延伸引物之间、延伸引物与延伸产物之间的分子量差异不小于10da，允许在延伸引物的5’端加上1-5个标签碱基以保证分子量能区分开。
通过引物设计分析和评价，共设计两组突变检测，包含35个突变位点中的28个突变，其余频率较低的突变位点由于在延伸引物设计过程中与其他位点存在冲突，在本发明中选择放弃了这些位点的检测。其中paneli包括15个突变位点，panelⅱ包括13个位点，突变热点的pcr扩增引物和单碱基延伸引物如下表。引物合成委托上海生工生物科技有限公司合成，采用dhplc方法进行引物的纯化。
1.引物的稀释及质检
1)pcr引物储备液制备：稀释单管扩增引物至终浓度100μmol/l，加入去离子水混合后使得各引物浓度为5μmol/l。
2)单碱基延伸引物储备液制备：稀释单管延伸引物至终浓度500μmol/l，加入引物混合后使得各引物浓度为8μmol/l、10μmol/l、15μmol/l。
3)合成引物进行引物分子量的质检：将引物合成公司合成的引物，通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪(maldi-tof-ms)进行质检，检测实际分子量与理论分子量是否一致，引物纯度是否达到实验要求。
2.多重pcr反应
使用completepcrreagent试剂盒(-20℃)进行多重pcr扩增反应：
1)从-20℃冰箱取出试剂盒，待测dna样本等置于室温融化，祸漩振荡15s，简单离心，确保管壁无夜滴残留。hotstartaq酶需要始终置于冰浴中。
2)pcr反应体系如表8
表8.pcr反应体系
3)将配置好的反应体系震荡混匀，简单离心后加入到384孔板pcr板，并确保加到反应孔底部。
4)将待测样本1μl加入到反应孔的底部，全部加完后立即用封板膜密封384孔板，并轻轻混匀或涡旋384孔板。
5)1000rpm板式高速离心机离心1min，将pcr板置于pcr仪中，设定反应程序，程序如下：
6)约3h后，取出384孔板，1000rpm板式高速离心机离心1min。在进行下一步实验前，反应产物应置于-20℃保存。
3.pcr反应产物电泳检测
pcr产物用2％的琼脂糖凝胶电泳，将5μlpcr产物与1μl电泳缓冲液混合后上样，电泳条件为120v电压，30min。电泳检测结果目的条带清晰方可进行下一步sap反应。
4.sap反应
使用iplexgoldreagent试剂盒进行sap消化反应：
1)从-20℃冰箱中取出上步反应产物，室温融化，4000rpm离心1min。
2)取出sap反应试剂，sapenzyme需始终置于冰浴中，其它试剂置于室温融化，涡旋震荡15sec后简单离心。
3)sap酶混合液配制(表9)
表9sap酶混合液配制
4)将配制好的sap酶混合液分配到384孔板中，每孔加入试剂2μl，移液完成后，小心盖上封板膜，并压牢每个孔，防止pcr程序时出现蒸发等现象。
5)将384板置于pcr上进行sap反应，sap反应条件如下：
37℃40min
85℃5min
4℃∞
5.iplex单碱基延伸反应
使用iplexgoldreagent试剂盒进行延伸反应：
1)从-20℃冰箱中拿出上步反应产物，室温融化，4000rpm离心1min。
2)从-20℃冰箱中拿出iplex延伸反应试剂，将iplexenzyme置于冰浴中，其他试剂在室温下融化，涡旋震荡15sec，简短离心，去除管壁的液体。
3)iplex反应体系配制(表10)：
表10.iplex反应体系
注：＊n指需要检测的样本数量
4)将配制好的iplex反应体系混合液分配到384孔板中，每孔加入上步配制好的反应体系2μl。
5)每孔中加入7μlsap反应后的产物到384孔板，简短离心。
6)移液完成后，小心盖上封板膜，并压牢每个孔，防止pcr程序时出现蒸发等现象。
7)将384孔板置于pcr仪上进行单碱基延伸反应，反应条件如下：
6.iplex单碱基延伸产物去盐
1)在384/6mgdimple板中均匀填充树脂并放置10min使其晾干
2)在384样本板的每个孔中加16μl水
3)将384样本板轻轻翻转过来扣在dimple板上，然后轻敲使树脂落入样本板的每个孔中。
4)将384样本板放置于板式旋转混匀器上，混匀30min
5)混匀结束后将384样本板置于板式离心机中，室温，425×g，离心3min。
7.massarray上机芯片点样
1)去盐后的产物4,000rpm离心4min，使树脂沉淀。
2)核查体积。
a)在主菜单中选择transfer。
b)加载一个method。
c)设定dispensespeed参数。
d)选定volumecheck。
e)选run并且观察体积。
f)依据体积调整dispensespeed参数获得合适的体积。
3)在芯片上点样，方法同体积核查步骤
4)在芯片上点calibrant，注意在method里选中calibrant。
8.massarray上机分析
1.assay导入
1)打开typer4.0
2)选择assayeditor
3)右键单击添加一个新的项目
4)右键新建项目名称或现有项目的名称并选择进口检测组
5)取消snpgroup选项，将自动取消设计文件和浏览阵列组(.xls文件)。
6)可以键入一个新的阵列组id或默认文件名。
7)单击导入，然后关闭。
8)关闭阵列编辑器。
2.样本表格输入
1)根据384加样顺序创建样本清单。
2)打开typer4.0，选择plateeditor。
3)单击sampletab，右键新建样本文件夹。
4)右键新建样本清单。
5)打开并浏览创建的样本清单，输入样本组名称，导入完成。
3.建板
1)打开typer4.0。
2)选择plateeditor。
3)右键单击添加新用户。
4)右键单击添加新项目。
5)右键单击添加板。
6)板型id和选择板式。
7)找到assaytab。
8)选中板中需添加的孔，右键单击并选择添加assay。
9)找到sampletab，选中板中需添加的孔，右键单击并选择添加sample。
10)保存板文件。
4.上机分析
1)在rt计算机上打开rt程序。
2)按下compact上的probescoutplateout按钮，然后把芯片放到scout板上并放回compact中，然后按probein按钮。
3)打开chiplinker并连接chip和plate。
a)双击chiplinker。
b)找到在plateeditor里建立的板。
c)选择iplex模式。
d)选择genotype或者genotype+area模式。
e)选择dispenser类型。
f)输入实验名称。
g)输入芯片条形码。
h)选择添加、创建。
4)把条形码名称输入acquire中，点击barcodereport，结果正确后点击autorunsetuptab。
5)chip扫描。
5.质量控制
1)打开typer4.0，点击typeanalyzer。
2)打开扫描结果。
3)检查质控点。
4)查看assay的得率和分型图。
6.输出分型结果
1)分型图。
2)分别导出每个突变位点原始的基因分型数据和结合分型图后的基因分型数据。
3)检查数据文件的完整性和正确性。
7.检测结果的判读
单碱基延伸产物通过质谱检测，获得延伸产物的分子量，分析软件计算延伸引物自身的分子量以及延伸产物可能的分子量的差值，与软件内预先设定好的每个突变位点延伸引物及可能突变碱基的ddntp的分子量进行比对。通过软件自动分析判读，获得延伸后的相应碱基，判断每个位点的基因型，野生纯合、突变杂合或者突变纯合。并对实验过程中pcr扩增、单碱基延伸的质量进行评价，根据峰图质量，软件自动判别为五个质量等级：a、b、c、d、n，质量依次递减，n代表延伸引物未发生延伸反应，通常理想的结果为a。
三.采用massarray进行pah基因热点突变分型
本发明采用massarray基因分型技术针对28个pah基因热点突变进行分型分析,所有的设计合成的单碱基延伸引物经质谱检测分子量与计算的分子量一致。分型预实验结果与sanger测序结果进行比对，全部符合。
本发明建立了一种基于飞行时间质谱技术的pah基因热点突变检测方法，该方案可以同时对pah基因28个热点突变位点进行基因分型，突变检出率可达到74％(95％ci,65％-83％)。本检测方案与经典的sanger测序相比较，突变检测的准确性完全一致。通过对临床初诊样本的突变筛查结果分析，本方案突变检出率达到74％(95％ci,65％-83％)，临床pku诊断率达到54％(95％ci,40％-68％)。飞行时间质谱技术操作简单，具有高准确性和特异性，可以作为一种高通量、低成本、快速的pah基因突变筛查和诊断的方法。该方案的建立也为未来在pku高发区开展大规模pah基因热点突变携带者筛查提供了技术的保障。
应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。
本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。
序列表
<110>国家卫生计生委科学技术研究所
<120>苯丙酮尿症检测试剂盒
<130>br3421
<160>107
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>20
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<213>人工序列(artificialsequence)
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