四种GypenosideL和GypenosideLI乙酰化衍生物及其制备抗肿瘤药物的用途的制作方法

本发明涉及四种由绞股蓝皂苷gypenosidel和gypenosideli乙酰化产生的化合物，以及这四种乙酰化衍生物在制备治疗肿瘤药物中的用途，属于中药现代化领域。

背景技术：

“绞股蓝”(gynostemmapentaphyllum(thunb.)makino.)，为葫芦科绞股蓝属草质多年生攀援植物，壮族医学称为“国虾薄”，为我国中医及壮医常用药材^[1]。其分布广泛，易于种植管理，在我国秦岭以南地区均可种植，以陕西，福建，广西，湖北居多。绞股蓝叶中具有丰富的与人参皂苷结构相似的绞股蓝皂苷成分，且一年内可多次采集，相对于人参而言，绞股蓝皂苷更加廉价易得，故其极具经济开发价值^[2]。

经高温高压方法处理后，绞股蓝热处理产物与原植物相比，具有更强的抗肿瘤活性。热处理过程中产生了原药材中没有的gypenosidel和gypenosideli两种皂苷类化合物，并具有良好的抗肿瘤细胞活性^[3]。不同肿瘤细胞所处环境不同对于药物分子的吸收效率不同，如脑部肿瘤由于血脑屏障的用对于脂溶性大的分子吸收效率更高，故对于有较强活性的抗肿瘤化合物而言，如何提高生物利用率成为现代药学研究的重点之一^[4]。

利用乙酰化方法，产生的四种gypenosidel和gypenosideli乙酰化衍生物与gypenosidel和gypenosideli分子相比，具有更强的脂溶性，而仍保留抗肿瘤活性。乙酰化产生的gypenosidel和gypenosideli衍生物为抗癌药物提供了新的备选方案。

参考文献：

[1]梁启成，钟鸣.中国壮药学[m].广西民族出版社，2005.

[2]张涛，袁弟顺.中国绞股蓝种植资源研究进展[j].云南农业大学学报，2009，23(3)：459-469.

[3]xiang-lanpiao，qianwu，jingyang，etal.dammarane-typesaponinsfromheat-processedgynostemmapentaphyllumshowfortifiedactivityagainsta549cells[j].archivesofpharmacalresearch，2013，vol.36(7)：874-879.

[4]denoran，trapania，laquintanav，etal.recentadvancesinmedicinalchemistryandpharmaceuticaltechnology-strategiesfordrugdeliverytothebrain[j].currtopmedchem，2009，9：182-196.

技术实现要素：

本发明的目的在于合成四种gypenosidel和gypenosideli乙酰化衍生物，该乙酰化衍生物的制备方法，以及这四种乙酰化衍生物在制备治疗肿瘤药物中的用途。

本发明的四种gypenosidel和gypenosideli乙酰化衍生物的制备方法如下：

取gypenosidel和gypenosideli混合物，加入100倍量冰醋酸，105℃条件下加热3小时。将反应后的混合物减压浓缩，干燥得到gypenosidel和gypenosideli及其乙酰化衍生物的混合物。

所述的四种gypenosidel和gypenosideli乙酰化衍生物的分离及鉴定如下：

将干燥的gypenosidel和gypenosideli及其乙酰化衍生物的混合物用甲醇超声溶解后，过0.45μm微孔滤膜，通过半制备液相色谱分离。分离得到4个化合物，用nmr及ms技术手段，根据文献，最终被鉴定为6′-acetyl-gypenosidel、6′-acetyl-gypenosideli、4′-acetyl-gypenosidel、4′-acetyl-gypenosideli(表1、表2、附图1、附图2)。

表1.四种gypenosidel和gypenosideli乙酰化衍生物¹hnmr数据表(600mhz，溶剂cd3od)

表2.四种gypenosidel和gypenosideli乙酰化衍生物¹³cnmr数据表(150mhz，溶剂cd3od)

我们还发现，本发明制备得到的四种化合物对于肝癌、肺癌、胃癌和前列腺癌细胞均具有抑制作用，因此，本发明还提供这四种化合物在制备治疗肿瘤药物中的用途。

附图说明

1.附图1为四种四种gypenosidel和gypenosideli乙酰化衍生物质谱图，由这四种化合物的质谱信息可以发现，四种化合物可能是在绞股蓝皂苷gypenosidel和gypenosideli的化学结构基础之上发生乙酰化，增加了一个乙酰化基团。

2.附图2为四种gypenosidel和gypenosideli乙酰化衍生物结构图，通过结合这四种乙酰化衍生物的质谱信息和核磁信息，可推断其发生乙酰化的位置为4’位和6’位，按化学命名法，这四种化合物命名为6′-acetyl-gypenosidel、6′-acetyl-gypenosideli、4′-acetyl-gypenosidel、4′-acetyl-gypenosideli。

3.附图3为乙酰化反应完成后gypenosidel和gypenosideli与其乙酰化化合物的混合物半制备液相分离图，从色谱图可发现，发生乙酰化后生成的这四种化合物相比gypenosidel和gypenosideli而言，保留时间延长，及说明乙酰化产物极性更小，脂溶性更大。

具体实施方式

实施例1gypenosidel和gypenosideli乙酰化衍生物制备实验

4.gypenosidel和gypenosideli乙酰化实验

取gypenosidel和gypenosideli混合物，加入100倍量冰醋酸，105℃条件下加热3h。将所得混合物减压浓缩至干燥状态，即得gypenosidel和gypenosideli与其乙酰化化合物的混合物。

5.gypenosidel和gypenosideli乙酰化衍生物分离及鉴定实验

将获得的gypenosidel和gypenosideli与其乙酰化化合物的混合物加入适量甲醇溶液溶解，过0.45μm微孔滤膜，利用半制备色谱仪进行分离，具体色谱条件如下：

hplc型号：岛津6ad

检测器：uv检测器

检测波长：203nm

色谱柱：thermoc18色谱柱(250×10mm，5μm)

柱温：30℃

流速：5ml/min

流动相：纯水(a)-乙腈(b)

洗脱条件：47％(b)等度洗脱

gypenosidel和gypenosideli与其乙酰化化合物的混合物，分离结果见附图3。

获得四个乙酰化衍生物单体，利用nmr，ms检测获得其核磁数据和质谱数据。

实施例2抗肿瘤实验

1.细胞系及细胞培养

人肺癌细胞a549、肝癌细胞hepg2、胃癌细胞sgc7901、前列腺癌细胞pc-3，以含10％胎牛血清的dmem培养基，与37℃、饱和湿度下、5.0％co2的培养箱中培养，细胞呈单层贴壁生长。实验取对数生长期细胞。

2.cck8法药物肿瘤活性抑制实验

取对数生长期的癌细胞，0.25％胰酶消化，10％胎牛血清的dmem培养基重悬成单细胞悬液。调细胞液浓度为5×10⁴个/ml，接种导96孔板，100μl/孔。24h细胞贴壁后，弃去原有培养基；加入用dmem培养基稀释的质量浓度梯度(0、6.25、12.5、25、50、100μg/ml)的6′-acetyl-gypenosidel、6′-acetyl-gypenosideli、4′-acetyl-gypenosidel、4′-acetyl-gypenosideli100μl/孔，每个质量浓度设5个复孔。孵育24h后，弃去原培养基，按100μl/孔加入含10％cck8的dmem培养基，导37℃，5％co2培养箱孵育3h，用酶标仪于450nm检测吸光度。进行三次平行实验。计算肿瘤细胞半数抑制浓度ic50.计算公式如下：

寇氏改良法计算半数：igic50＝xm-i(p-(3-pm-pn)/4)

1)实验材料及仪器

培养基：dmem培养基(gibco，美国)；

fbs(gibco，美国)；

胎牛血清(gibco，美国)；

胰酶(1∶250，活性＞250u/mg)(gibco，美国)；

96孔板(corning，usa)；

cck8试剂盒(东仁化学科技，上海)；

倒置显微镜(optec，重庆光电仪器有限公司)

酶标仪(伯乐，美国)

xp205电子天平(梅特勒，瑞士)

细胞培养箱(thermoforma，美国)

人肺癌细胞a549、肝癌细胞hepg2、胃癌细胞sgc7901、前列腺癌细胞pc-3(北京协和细胞资源中心)

2)实验方法

人肺癌细胞a549、肝癌细胞hepg2、胃癌细胞sgc7901、前列腺癌细胞pc-3的抑制活性实验实验均采用cck8法。

3)供试样品

阳性对照药物选用人参皂苷rg3；四种gypenosidel和gypenosideli乙酰化衍生物6′-acetyl-gypenosidel、6′-acetyl-gypenosideli、4′-acetyl-gypenosidel、4′-acetyl-gypenosideli。

4)实验结果

对人肺癌细胞a549、肝癌细胞hepg2、胃癌细胞sgc7901、前列腺癌细胞pc-3均具有不同程度抑制活性，实验结果见表3

表3四种四种gypenosidel和gypenosideli乙酰化衍生物ic50值