本发明涉及一种基于多巴胺稳定的油包水型皮克林乳液的制备方法及其固定化酶应用，属于乳化剂技术领域。
背景技术：
皮克林乳液是由固体粒子在油水界面稳定的特殊乳液。其与普通乳液最大的区别在于体系由固体粒子所稳定，而传统乳液是由多种类型的表面活性剂所稳定。皮克林乳液的优势主要包括：成本低，乳化剂用量少；毒性小，环境污染小；容易形成稳定的乳液，受外界ph、温度以及体系种类的影响小。因此，皮克林乳液被广泛应用于药物缓释、酶固定化以及可再生能源等多项体系中。对于固体颗粒稳定的皮克林乳液而言，其稳定性由颗粒的润湿性、颗粒的浓度、颗粒初始分散介质及油水比、水相ph值及添加电解质、助乳化剂的影响等多种因素决定。目前皮克林乳液仍存在成本高、乳液稳定性不足、应用性不好等问题。
多巴胺是一种重要的生物粘合剂，其上的邻苯二酚/醌基结构可以通过螯合作用或者氢键缔合等方式连接在基底上，形成的聚多巴胺(pda)来连接多种物质。目前多巴胺的聚合反应研究多集中在单个粒子模板或膜基底上，比如：多巴胺在sio、tio2、caco3等粒子上的聚合反应，此外还有以o/w型乳滴为模板在油水界面上制备聚多巴胺层的反应，但是还没有关于多巴胺在皮克林乳液中聚合反应的研究报道。目前，已有一些皮克林乳液用于固定化酶的报道，比如：wu等[1]利用疏水改性sio2稳定的皮克林乳液固定化酶，并利用琼脂糖在粒子界面进行固定，用于有机体系的催化反应。这种方法虽然提高了酶的稳定性，但是当有机相去除之后，皮克林乳液的稳定性会遭到破坏，影响其重复利用性。为了克服这一缺陷，需要在皮克林乳液形成过程中实现其组成粒子之间的化学键连。例如：morse等[2]利用聚合物基底粒子在十二烷/水界面形成皮克林乳液，并在制备过程中加入交联剂，使其能够很好地稳定皮克林乳液体系，这种方法克服了酸性体系可能导致的乳液破乳，并在一定程度上提高了固定酶的重复利用性。但是，该方法的操作生产步骤复杂，制备成本高，并且在油水界面进行的酶催化传质阻力大，酶活不高。因此，需要进一步探索新的方法，在提高固定化酶重复利用性的同时不影响其酶活。本发明参考wu等[1]利用疏水改性sio2稳定皮克林乳液的方法，在此基础上在皮克林乳液的制备过程中加入多巴胺，开发了一种利用多巴胺稳定的皮克林乳液及其固定化酶制备方法，可以解决现有皮克林乳液催化反应中遇到的诸多问题。
参考文献：
[1].wu,c.；bai,s.；ansorge-schumacher,m.b.；wang,d.nanoparticlecagesforenzymecatalysisinorganicmedia.adv.mater.2011,23,5694-5699.
[2].morse,a.j.；madsen,j.；growney,d.j.microgelcolloidosomesbasedonph-responsivepoly(tert-butylaminoethylmethacrylate)latexes.langmuir,2014,30(42):12509-12519.
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种基于多巴胺稳定的皮克林乳液的制备方法及其固定化酶应用。发明中包括多巴胺界面聚合稳定的皮克林乳液的制备方法以及皮克林乳液界面固定化酶的应用。
具体技术方案如下：
一种基于多巴胺稳定的皮克林乳液的制备方法，其特征是：以参考文献制备的疏水改性sio2粒子[1]作稳定剂，正庚烷作油相，tris缓冲液(10mm,ph8.5)作水相，利用高速均质机搅拌得到sio2粒子稳定的皮克林乳液。将多巴胺加入该皮克林乳液中，于室温下的水浴摇床中孵化，以使其得到黑色的由sio2和聚多巴胺共同稳定的皮克林乳液。
其中，多巴胺在水相中的浓度为0.25-5mg/ml，疏水改性sio2粒子占水相的体积分数为0.25-1.5％(％，w/v)，油水两相体积比为2:1-10:1，高速均质机搅拌速度为10000-20000rpm。
所述的皮克林乳液的油水两相体积比为6:1，多巴胺加入量为2mg/ml，sio2粒子占水相的体积分数为1％(％，w/v)，高速均质机搅拌速度为20000rpm。
本发明制备的多巴胺界面聚合稳定的皮克林乳液在固定化酶上的应用：取自由酶溶液加入tris缓冲液稀释，以稀释后的酶溶液作水相，疏水改性sio2粒子作稳定剂，正庚烷作油相，利用均质机高速搅拌制备皮克林乳液，在制备过程中将酶包覆于水相中。其中，自由酶溶液为10-50μl，疏水改性sio2粒子占水相的体积分数为0.25-1.5％(％，w/v)，油水两相体积比为2:1-10:1。之后将多巴胺加入到乳液中，利用均质机高速搅拌，并于室温下的水浴摇床中孵化，以使其得到黑色的界面负载酶的皮克林乳液。其中，多巴胺在水相中的浓度为0.25-5mg/ml，高速均质机搅拌速度为10000-20000rpm。
所述的自由酶溶液为液体脂肪酶。
本发明涉及一种基于多巴胺稳定的皮克林乳液的制备方法及其固定化酶应用。该方法将多巴胺引入到疏水改性sio2纳米粒子稳定的皮克林乳液中，使其在乳液界面发生聚合，得到一种多巴胺稳定的油包水型皮克林乳液。之后将酶固定在乳液水相以测定皮克林乳液的稳定性及应用性能。本发明制得的多巴胺稳定的皮克林乳液由sio2纳米粒子及聚合物包覆层组成，稳定性良好，可实现多种酶的包覆，使固定化酶具有很好的热稳定性、储存稳定性和重复利用性。本发明的皮克林乳液原料成本低、制备方法易于操作，有很好的经济可行性和实用性。
本发明的有益效果
1)本发明在皮克林乳液中引入了多巴胺，通过其交联作用，直接将酶定向固定在皮克林乳液的油水界面上，这一技术有效地改善了固定化酶在界面的传质并提高了酶的催化反应速率(见附图1、2)。
2)本发明研制的皮克林乳液所需原料少，操作步骤简单，多巴胺在其界面的聚合提高了皮克林乳液的稳定性，使其在高温和长时间储存下仍然具有良好的热稳定性和储存稳定性(见附图4、5)。
3)本发明研制的多巴胺稳定的皮克林乳液中的微水相不容易泄漏，在有机相去除之后，酶及皮克林乳液体系不易遭到破坏，具有良好的重复利用性(见附图6)。
附图说明
图1多巴胺稳定的皮克林乳液的光学显微镜图和乳滴冻干后的sem图。
图2自由酶，无多巴胺稳定的皮克林乳液和多巴胺稳定的皮克林乳液固定化酶在最初1h内的酶活(其中lipase：自由酶；lipase-pda：自由酶与多巴胺的混合体系；lipase-sinds：无多巴胺，只有sio2粒子稳定的皮克林乳液包覆酶的体系；lipase-sin/pdacs：包含聚多巴胺层的sio2稳定的皮克林乳液包覆酶的体系)。
图3(a)多巴胺浓度(b)sio2纳米粒子负载量(c)油水两相体积比ro/w以及(d)酶的负载量对多巴胺稳定的皮克林乳液固定化酶酶活的影响。
图4无多巴胺稳定的皮克林乳液和多巴胺稳定的皮克林乳液固定化酶在不同温度下加热反应1h的相对酶活。
图5自由酶和多巴胺稳定的皮克林乳液固定化酶在4℃下储存不同时间的相对酶活变化情况。
图6多巴胺稳定的皮克林乳液在重复利用过程中的酶活。
具体实施方式
结合附图和具体实施方式对本发明做进一步的详细说明：
多巴胺界面聚合稳定的皮克林乳液
以参考文献制备的疏水改性sio2粒子[1]作稳定剂，正庚烷作油相，tris缓冲液(10mm,ph8.5)作水相，利用高速均质机搅拌得到sio2粒子稳定的皮克林乳液。将多巴胺加入该皮克林乳液中，于室温下的水浴摇床中孵化，以使其得到黑色的由sio2和聚多巴胺共同稳定的皮克林乳液。其中，多巴胺在水相中的浓度为0.25-5mg/ml，疏水改性sio2粒子占水相的体积分数为0.25-1.5％(％，w/v)，油水两相体积比为2:1-10:1，高速均质机搅拌速度为10000-20000rpm。
多巴胺聚合稳定的皮克林乳液界面固定化酶的应用
取自由酶溶液加入tris缓冲液稀释，以稀释后的酶溶液作水相，疏水改性sio2粒子作稳定剂，正庚烷作油相，利用均质机高速搅拌制备皮克林乳液，在制备过程中将酶包覆于水相中。其中，自由酶溶液为10-50μl，疏水改性sio2粒子占水相的体积分数为0.25-1.5％(％，w/v)，油水两相体积比为2:1-10:1。之后将多巴胺加入到乳液中，利用均质机高速搅拌，并于室温下的水浴摇床中孵化，以使其得到黑色的界面负载酶的皮克林乳液。其中，多巴胺在水相中的浓度为0.25-5mg/ml，高速均质机搅拌速度为10000-20000rpm。
优选的，本发明所述的皮克林乳液的方案为：多巴胺加入量2mg/ml，油水两相体积比6:1，sio2粒子占水相的体积分数为1％(％，w/v)，高速均质机搅拌速度为20000rpm。
优选的，本发明所述的皮克林乳液固定化酶的自由酶溶液加入量为30μl。
本发明所述的自由酶溶液为液体脂肪酶。
实施例1
取20μl自由酶溶液加入180μltris缓冲液(10mm,ph8.5)，混匀后加入到分散有20mg疏水改性sio2纳米粒子的2ml正庚烷中，高速均质(15000rpm,2min)，之后将0.25mg/ml多巴胺加入到乳液中，均质搅拌1min，并在摇床中孵化24h(180rpm，28℃)，得到多巴胺稳定的皮克林乳液固定化酶体系。
自由酶和固定化酶的催化效果通过正己醇和正己酸在水/正庚烷体系中的酯化反应测得。将含有400mmoll-1正己酸和400mmoll-1正己醇的2ml正庚烷溶液加入到包覆有酶的皮克林乳液中。酶催化反应在37℃，200rpm的水浴摇床中进行1h，取1μl产物用气相色谱分析结果，如图3所示。结果显示：皮克林乳液固定化酶的酶活可以达到25.61uml-1，就自由酶活相比有明显的提高，是自由酶酶活的4倍。
实施例2
取20μl自由酶溶液加入180μltris缓冲液(10mm,ph8.5)，混匀后加入到分散有20mg疏水改性sio2纳米粒子的2ml正庚烷中，高速均质(20000rpm,2min)。之后将2mg/ml的多巴胺加入到乳液中，均质搅拌1min，并在摇床中孵化24h(180rpm，28℃)，得到多巴胺稳定的皮克林乳液固定化酶体系。
自由酶和固定化酶的催化效果通过正己醇和正己酸在水/正庚烷体系中的酯化反应测得。将含有400mmoll-1正己酸和400mmoll-1正己醇的2ml正庚烷溶液加入到包覆有酶的皮克林乳液中。酶催化反应在37℃，200rpm的水浴摇床中进行1h，取1μl产物用气相色谱分析结果，如图3所示。结果显示：皮克林乳液固定化酶的酶活可以达到36.39uml-1，就自由酶活相比有显著的提高，是自由酶酶活的6倍。
实施例3
取20μl自由酶溶液加入180μltris缓冲液(10mm,ph8.5)，混匀后加入到分散有20mg疏水改性sio2纳米粒子的2ml正庚烷中，高速均质(20000rpm,2min)。之后将5mg/ml多巴胺加入到乳液中，均质搅拌1min，并在摇床中孵化24h(180rpm，28℃)，得到多巴胺稳定的皮克林乳液固定化酶体系。
自由酶和固定化酶的催化效果通过正己醇和正己酸在水/正庚烷体系中的酯化反应测得。将含有400mmoll-1正己酸和400mmoll-1正己醇的2ml正庚烷溶液加入到包覆有酶的皮克林乳液中。酶催化反应在37℃，200rpm的水浴摇床中进行1h，取1μl产物用气相色谱分析结果，如图3所示。结果显示：皮克林乳液固定化酶的酶活可以达到25.87uml-1，就自由酶活相比有明显的提高，是自由酶酶活的4倍。
实施例4
取20μl自由酶溶液加入313μltris缓冲液(10mm,ph8.5)，混匀后加入到分散有20mg疏水改性sio2纳米粒子的2ml正庚烷中，高速均质(20000rpm,2min)。之后将2mg/ml多巴胺加入到乳液中，均质搅拌1min，并在摇床中孵化24h(180rpm，28℃)，得到多巴胺稳定的皮克林乳液固定化酶体系。
自由酶和固定化酶的催化效果通过正己醇和正己酸在水/正庚烷体系中的酯化反应测得。将含有400mmoll-1正己酸和400mmoll-1正己醇的2ml正庚烷溶液加入到包覆有酶的皮克林乳液中。酶催化反应在37℃，200rpm的水浴摇床中进行1h，取1μl产物用气相色谱分析结果，如图3所示。结果显示：皮克林乳液固定化酶的酶活可以达到46.14uml-1，就自由酶活相比有显著的提高，是自由酶酶活的7倍。
实施例5
取20μl自由酶溶液加入980μltris缓冲液(10mm,ph8.5)，混匀后加入到分散有20mg疏水改性sio2纳米粒子的2ml正庚烷中，高速均质(20000rpm,2min)。之后将2mg/ml多巴胺加入到乳液中，均质搅拌1min，并在摇床中孵化24h(180rpm，28℃)，得到多巴胺稳定的皮克林乳液固定化酶体系。
自由酶和固定化酶的催化效果通过正己醇和正己酸在水/正庚烷体系中的酯化反应测得。将含有400mmoll-1正己酸和400mmoll-1正己醇的2ml正庚烷溶液加入到包覆有酶的皮克林乳液中。酶催化反应在37℃，200rpm的水浴摇床中进行1h，取1μl产物用气相色谱分析结果，如图3所示。结果显示：皮克林乳液固定化酶的酶活可以达到28.64uml-1，就自由酶活相比有显著的提高，是自由酶酶活的4倍。
实施例6
取20μl自由酶溶液加入180μltris缓冲液(10mm,ph8.5)，混匀后加入到分散有5mg疏水改性sio2纳米粒子的2ml正庚烷中，高速均质(10000rpm,2min)。之后将2mg/ml的多巴胺加入到乳液中，均质搅拌1min，并在摇床中孵化24h(180rpm，28℃)，得到多巴胺稳定的皮克林乳液固定化酶体系。
自由酶和固定化酶的催化效果通过正己醇和正己酸在水/正庚烷体系中的酯化反应测得。将含有400mmoll-1正己酸和400mmoll-1正己醇的2ml正庚烷溶液加入到包覆有酶的皮克林乳液中。酶催化反应在37℃，200rpm的水浴摇床中进行1h，取1μl产物用气相色谱分析结果，如图3所示。结果显示：皮克林乳液固定化酶的酶活可以达到13.81uml-1，是自由酶酶活的2倍。
实施例7
取20μl自由酶溶液加入180μltris缓冲液(10mm,ph8.5)，混匀后加入到分散有30mg疏水改性sio2纳米粒子的2ml正庚烷中，高速均质(20000rpm,2min)。之后将2mg/ml的多巴胺加入到乳液中，均质搅拌1min，并在摇床中孵化24h(180rpm，28℃)，得到多巴胺稳定的皮克林乳液固定化酶体系。
自由酶和固定化酶的催化效果通过正己醇和正己酸在水/正庚烷体系中的酯化反应测得。将含有400mmoll-1正己酸和400mmoll-1正己醇的2ml正庚烷溶液加入到包覆有酶的皮克林乳液中。酶催化反应在37℃，200rpm的水浴摇床中进行1h，取1μl产物用气相色谱分析结果，如图3所示。结果显示：皮克林乳液固定化酶的酶活可以达到33.99uml-1，就自由酶活相比有显著的提高，是自由酶酶活的5倍。
实施例8
取30μl自由酶溶液加入283μltris缓冲液(10mm,ph8.5)，混匀后加入到分散有20mg疏水改性sio2纳米粒子的2ml正庚烷中，高速均质(15000rpm,2min)。之后将2mg/ml的多巴胺加入到乳液中，均质搅拌1min，并在摇床中孵化24h(180rpm，28℃)，得到多巴胺稳定的皮克林乳液固定化酶体系。
自由酶和固定化酶的催化效果通过正己醇和正己酸在水/正庚烷体系中的酯化反应测得。将含有400mmoll-1正己酸和400mmoll-1正己醇的2ml正庚烷溶液加入到包覆有酶的皮克林乳液中。酶催化反应在37℃，200rpm的水浴摇床中进行1h，取1μl产物用气相色谱分析结果，如图3所示。结果显示：皮克林乳液固定化酶的酶活可以达到47.66uml-1，就自由酶活相比有显著的提高，是自由酶酶活的7倍。
实施例9
取50μl自由酶溶液加入263μltris缓冲液(10mm,ph8.5)，混匀后加入到分散有20mg疏水改性sio2纳米粒子的2ml正庚烷中，高速均质(15000rpm,2min)。之后将2mg/ml的多巴胺加入到乳液中，均质搅拌1min，并在摇床中孵化24h(180rpm，28℃)，得到多巴胺稳定的皮克林乳液固定化酶体系。
自由酶和固定化酶的催化效果通过正己醇和正己酸在水/正庚烷体系中的酯化反应测得。将含有400mmoll-1正己酸和400mmoll-1正己醇的2ml正庚烷溶液加入到包覆有酶的皮克林乳液中。酶催化反应在37℃，200rpm的水浴摇床中进行1h，取1μl产物用气相色谱分析结果，如图3所示。结果显示：皮克林乳液固定化酶的酶活可以达到39.71uml-1，就自由酶活相比有显著的提高，是自由酶酶活的6倍。