本发明属于植物基因工程领域,涉及一种蒺藜苜蓿myb类转录因子mtmyb1的应用,具体涉及来源于蒺藜苜蓿的在花中高表达并与花器官形态发育、花期和生育延长及植株茎生叶片数、侧枝数目相关的myb类转录因子mtmyb1在植物生殖器官、花期和生育期，以及株型改造中的应用。
背景技术：
蒺藜苜蓿(medicagotruncatulag.)，又称为截形苜蓿或者截叶苜蓿，属于豆科苜蓿属的一年生植物，也是豆科研究的一种模式植物。随着蒺藜苜蓿基因富集区的基因组测序和注释的完成，反向遗传学渐渐成为基因功能研究的一种有效方法。tnt1是烟草中的一种逆转录转座子，研究表明tnt1在蒺藜苜蓿组织培养阶段可产生大规模的插入突变，并且没有特异的插入位点，但更倾向于插入外显子序列，利用反向遗传学的方法可以筛选出突变体从而研究感兴趣的基因。蒺藜苜蓿tnt1插入突变体nf5676出现一系列表型特征，包括开花时间和生育期延长，花器官变异，侧枝增多，荚果变小等性状。通过tnt1插入位点分析，发现该突变体中tnt1反向插入蒺藜苜蓿mtmyb1基因的第三个外显子4089-4094bp的位置。因此，对mtmyb1进行进一步的功能验证。
在植物中myb转录因子家族成员很多，并且它们的功能很广泛，它们几乎在植物发育和代谢的各个方面都发挥调控作用，例如，参与次生代谢反应、参与植物逆境胁迫应答反应、植物激素应答反应、细胞形态和模式建成以及植物生长发育的多个方面，还能调节植物的生物钟等。根据myb结构域重复序列的数量以及位置对myb类转录因子进行分类，将其分为四个亚家族，分别是1r-myb、2r-myb、3r-myb和4r-myb。目前，一些有关蒺藜苜蓿myb转录因子的研究已被报道。蒺藜苜蓿myb2作为转录抑制因子调节花青素和原花青素的生物合成，myb5是原花青素合成的主要调节者，而且myb2受myb5上调表达，过表达myb2，蒺藜苜蓿根毛和拟南芥种子中花青素和原花青素含量下降。马利超等(2012)利用蒺藜苜蓿pistillata(pi)基因作为模板，经过表达谱分析，共筛到97个花器官的特异表达基因，这些基因来自不同的基因家族，如mads-box、myb、far、cyp等，比较这些基因和它们同源基因的表达模式，发现直系同源基因在不同植物中的表达模式和功能不完全相同，这些研究结果为今后进一步探索植物花器官发育的分子机制提供了线索。wang等(2017)对蒺藜苜蓿全基因组的myb转录因子分析，包括家族特征，进化和表达分析，确定了166个myb基因，它们大多数都属于r2r3-myb亚家族，在各种器官中进行基因表达分析显示大多数myb基因差异表达，表明它们在调节蒺藜苜蓿器官生长和发育中的潜在作用。尽管myb类转录因子数目众多，但是不同的myb类转录因子在生物功能上发挥的作用不完全相同，因而，新的myb类转录因子的功能仍需进一步的实验验证。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供公开一个蒺藜苜蓿myb类转录因子基因mtmyb1。
本发明的另一目的是提供该基因在花器官形态、花期及株型改造中的基因工程应用。
本发明的目的可通过如下技术方案实现:
蒺藜苜蓿基因mtmyb1,核苷酸序列为seqidno.1。
本发明所述的蒺藜苜蓿myb类转录因子基因mtmyb1编码的蛋白质，其氨基酸序列为seqidno.2。
含有本发明所述的蒺藜苜蓿myb类转录因子基因mtmyb1的表达载体。
本发明所述的蒺藜苜蓿myb类转录因子基因mtmyb1优选在植物花器官、花期和/或株型改造中的基因工程应用。
所述的植物花形态表现为花瓣向内弯曲，花期和生育期表现延长，株型表现为茎生叶片增多，侧枝数目增加。
使用mtmyb1构建植物表达载体时,在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选,可对所用植物表达载体进行加工,如加入可在植物中表达的选择性标记基因(gus基因、gfp基因等)或者抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物、潮霉素标记物等)的抗性基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以表型性状筛选转化植株。
携带有本发明mtmyb1的植物表达载体可通过使用ti质粒、ri质粒、植物病毒载体、直接dna转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织,并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是水稻、小麦、玉米等单子叶植物,也可以是烟草、拟南芥、大豆、油菜、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜蓿等双子叶植物。
有益效果:
本发明提供的蒺藜苜蓿myb类转录因子基因mtmyb1在蒺藜苜蓿突变体nf5676的各个组织表达很低或者几乎不表达，而在野生型r108的花器官中表达最高。35s::mtmyb1转基因拟南芥在生长发育过程中出现了一系列的表型变化,与对照植株相比,转基因株系1，5的开花时间延迟，同时生育期也延长。除此之外，mtmyb1过表达拟南芥还出现了茎生叶片增多，侧枝数目增加的表型。本发明公开了该基因进行植物株型形态、生殖器官及花期改造的基因工程改良方法。该方法对培育株型以及生殖器官和花期改变的植物品种特别是豆科作物具有一定的作用。可以通过定向地改造作物的生殖器官形态、开花时期及植株构型,为农作物提高制种效率服务,以及提高农作物特别是大豆的产量和品质服务。
利用植物过量表达载体pmdc83-mtmyb1,将本发明的mtmyb1导入植物体内,可获得花器官变异的转基因细胞系及转基因植株。
附图说明
下面结合附图及实施例对本发明做进一步说明。
图1mtmyb1基因的组织表达分析。
采用实时荧光定量pcr技术对mtmyb1在蒺藜苜蓿突变体nf5676和野生型r108的不同组织表达进行研究，大豆不同组织分别为根、茎、叶、花和荚。
图2mtmyb1的植物过量表达载体的结构示意图。
a：pmdc83-mtmyb1载体结构图；b：pcr检测lr反应产物，其中m1：dnamarkerdl2,000；1-3为阳性克隆；c：重组质粒pmdc83-mtmyb1酶切验证，m2：dnamarkerdl15,000；1为重组质粒样品。
图3转基因拟南芥的pcr鉴定。
m为dnamarkertrans2k；1-7为不同的转基因株系；wt为野生型拟南芥(阴性对照)；h2o为水对照(阴性对照)；p：为pmdc83-mtmyb1重组质粒(阳性对照)。
图4转基因拟南芥的实时荧光定量pcr鉴定。
1-7为不同的转基因株系；wt为野生型拟南芥(阴性对照)。
图535s::mtmyb1转基因拟南芥和野生型植株开花时间和生育期比较。wt：为野生型拟南芥，1,5：转基因株系。
图6拟南芥开花相关基因在35s::mtmyb1转拟南芥和野生型植株中的表达分析。1-flowers：株系1的t1代完全盛开的花；col-flowers：拟南芥野生型col完全盛开的花；1-flowerbuds：株系1的t1代花蕾；col-flowerbuds：拟南芥野生型花蕾。*表示0.01<p<0.05水平下显著差异；**表示p<0.01水平下极显著差异；***表示p<0.001水平下极显著差异。
图735s::mtmyb1转基因拟南芥出现花瓣向内弯曲的变异。a-b:野生型拟南芥植株；c-d：转基因拟南芥植株；白色箭头表示花瓣弯曲的位置。
图8拟南芥花器官发育相关基因在35s::mtmyb1转拟南芥和野生型植株中的表达分析。a：ap1基因的表达；b：ap3，pi和spe3基因的表达。1-flowers：株系1的t1代完全盛开的花；col-flowers：拟南芥野生型col完全盛开的花；1-flowerbuds：株系1的t1代花蕾；col-flowerbuds：拟南芥野生型花蕾。*表示0.01<p<0.05水平下显著差异；**表示p<0.01水平下极显著差异；***表示p<0.001水平下极显著差异。
图935s::mtmyb1转基因拟南芥与野生型株型的表型变化分析。a：拟南芥野生型和转pmdc83空载植株株型比较；b：转mtmyb1拟南芥植株和野生型茎生叶片比较；c：转mtmyb1拟南芥植株和野生型分枝比较。
图10拟南芥侧枝发育相关基因在35s::mtmyb1转基因拟南芥和野生型植株中的表达分析。
具体实施方式
下面结合附图和实施例,并参照数据进一步详细地描述本发明。这些实施例只是为了举例说明本发明,而非以任何方式限制本发明的范围。在以下的实施例中,未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用到的引物,均在首次出现时标明,其后所用相同引物,均以首次标明的内容相同。
实施例1蒺藜苜蓿mtmyb1及其编码基因的克隆与鉴定
依据蒺藜苜蓿数据库中的序列信息，设计mtmyb1基因引物，以蒺藜苜蓿野生型r108花的cdna为模板进行pcr扩增。
上游引物:5'-atggataaaaaaccatgcaac-3'(seqidno.3)
下游引物:5'-ttaatctccattgagtaattgca-3'(seqidno.4)
应用rt-pcr方法，从蒺藜苜蓿花器官总rna中扩增mtmyb1基因。取蒺藜苜蓿花组织，用研钵研碎，加入盛有裂解液的1.5mlep管，充分振荡后，再移入玻璃匀浆器内。匀浆后移至1.5mlep管中，采用植物总rna提取试剂盒(tiangendp404)进行总rna提取。用甲醛变性胶电泳鉴定总rna质量，然后在分光光度计上测定rna含量。以获得的总rna为模板,按照takara公司提供的反转录试剂盒的说明书进行反转录，合成cdna第一链。进行pcr扩增反应。pcr反应体系为:2μlcdna(0.05μg)、上、下游引物各2μl(10μm)、25μl2×phantamaxbuffer、1μldntp(10mm)和1uphantamaxsuper-fidelitydna聚合酶(vazyme),用超纯水补足50μl。pcr程序如下：在bio-radptc200型pcr仪上进行,其程序为94℃预变性3min；94℃变性15s，56℃退火15s，72℃延伸45s,共30个循环；然后72℃延伸5min终止反应，4℃保存。pcr产物回收将其克隆至pgem-teasy载体，测序后获得具有完整编码区的蒺藜苜蓿基因mtmyb1的cdna序列seqidno.1，全长630bp，编码seqidno.2所示的208个氨基酸。
实施例2mtmyb1在蒺藜苜蓿不同器官中的表达特征
蒺藜苜蓿野生型r108和突变体nf5676种植于温室，光照周期为16h光照/8h黑暗。分别取r108及突蒺藜苜蓿变体nf5676的根、茎、叶、花及开花后10天的荚。取完样后均立即液氮速冻，保存于-80℃超低温冰箱待用。
总rna的提取同实施例1。以蒺藜苜蓿组成型表达基因actin为内参基因，其扩增引物为:actin正向引物序列:5’tcaatgtgcctgccatgtatgt3’(seqidno.7)，actin反向引物序列:5’actcacaccgtcaccagaatcc3’(seqidno.8)。以来自蒺藜苜蓿不同组织或器官的cdna为模板，进行实时荧光定量pcr分析。mtmyb1的扩增引物为:mtmyb1-qpcr-f:5’taaactaccttcgtccaga3’(seqidno.5),mtmyb1-qpcr-r:5’tcaacttgcttaatgtgct3’(seqidno.6)。结果(图1)分析表明,mtmyb1在蒺藜苜蓿突变体nf5676的各个组织表达很低或者几乎不表达，该基因在野生型r108的花器官强优势表达。
实施例3mtmyb1的基因工程应用
利用诺唯赞一步法克隆试剂盒，将mtmyb1重组到pmd19-t克隆载体上。再利用invitrogen公司的
提取初步筛选得到具有潮霉素抗性的转基因拟南芥的基因组dna,使用基因特异性引物mtmyb1-bp-f:seqidno.9,和mtmyb1-bp-r:seqidno.10进行pcr鉴定。能够扩增出约为630bp大小条带的为阳性转基因拟南芥,扩增不出约为630bp大小条带的为阴性植株(图3)。选择pcr鉴定为阳性的植株,以mtmyb1-qpcr-f(seqidno.5)和mtmyb1-qpcr-r(seqidno.6)为引物,进行实时荧光定量pcr检测。结果表明mtmyb1可在转基因拟南芥中表达(图4)。将pcr、实时荧光定量pcr检测均为阳性的转基因植株命名为35s::mtmyb1转基因拟南芥。
对35s::mtmyb1转基因拟南芥进行表型观察。在25℃、长日照的生长条件下,与对照相比，35s::mtmyb1转基因拟南芥稳定出现了开花时间延迟，生育期延长的特性(图5)；在开花后期都出现了花瓣向内弯曲的表型性状(图7)；并且它们的茎生叶片和侧枝数目增多(图9)。而这些表型与突变体类似。为了进一步探究转mtmyb1基因拟南芥表型出现的原因，我们利用实时荧光定量pcr检测了一些拟南芥上与开花时间、花器官发育以及侧枝发育相关基因的表达。以拟南芥组成型表达基因actin为内参基因(seqidno.11；seqidno.12)，以开花时间相关基因的特异性引物co(seqidno.13；seqidno.14),ft(seqidno.15；seqidno.16),flc(seqidno.17；seqidno.18),soc1(seqidno.19；seqidno.20),lfy(seqidno.21；seqidno.22)和fle(seqidno.23；seqidno.24)进行定量检测，结果显示：与野生型相比，转基因株系的花蕾和完全盛开的花中flc表达量增加，同时ft基因的表达量下降，但是转基因植株中soc1的表达量上升，因此推测转基因植株开花推迟与ft表达量下降有关，soc1的表达可能还受别的调控途径的影响(图6)。以花器官发育相关基因的特异性引物ap1(seqidno.25；seqidno.26),ap3(seqidno.27；seqidno.28),pi(seqidno.29；seqidno.30)和spe3(seqidno.31；seqidno.32)进行定量检测，结果显示：转基因株系1的花蕾中b类基因ap3和pi表达量下降，但是在完全盛开的花中表达量上升，而a类基因ap1在花蕾中表达量远高于野生型，在盛开的花中表达量只轻微高于野生型，e类基因sep3的表达低于野生型，根据花发育abce模型，a、b类基因共同控制花瓣发育，推测转基因植株花瓣变异可能与这些基因的表达量变化有关(图8)。以侧枝发育相关基因的特异性引物rax3(seqidno.33；seqidno.34),las(seqidno.35；seqidno.36),brc1(seqidno.37；seqidno.38)和max1(seqidno.39；seqidno.40)进行定量检测，结果显示：brc1基因在转基因株系1和5中表达量下降，而las、rax3和max1基因在两个株系的表达量不一致或者表达量变化不明显。推测转基因植株中brc1基因表达量下降可能引起侧枝增多(图10)。
序列表
<110>南京农业大学
<120>一个蒺藜苜蓿myb类转录因子mtmyb1的应用
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