一种从微生物发酵液中分离纯化胞二磷胆碱钠的方法与流程

本发明属于生物化学分离技术领域，具体地，涉及一种从微生物发酵液中分离纯化胞二磷胆碱钠的方法。

背景技术：

胞二磷胆碱钠（图1）为核苷衍生物，可以通过降低脑血管阻力，增加脑血流而促进脑物质代谢，改善脑循环。另外，可增强脑干网状结构上行激活系统的机能，增强锥体系统的机能，改善运动麻痹，故对促进大脑功能的恢复和促进苏醒，有一定作用。临床用于急性颅脑外伤和脑手术后的意识障碍。

关于胞二磷胆碱钠的生产，主要有（1）化学合成；（2）酶促合成；（3）微生物发酵合成转化等几种。对于胞二磷胆碱钠的分离纯化，国内外报道的比较少，传统的分离纯化工艺不仅工序繁杂、收率低、分离成本比较高，而且对环境的污染较大。张剑等(cn101130797a)提出将转化液上碳柱，纯水冲洗碳柱，再用乙醇-碱溶液洗脱，收集，再进行大孔离子交换树脂纯化。这种碳柱与交换柱结合的形式，碳柱死吸附严重导致收率低，碳柱洗脱、树脂再生产生大量的废水，污水处理量极大。胡建荣（cn102010454a）提出，使用色谱柱或者硅胶柱来进行胞磷酸胆碱钠的纯化，成本较高，规模化生产难以实现，所得产品纯度偏低，均在98%以下，洗脱液中大量有机溶剂回收困难。藤原好孝等(日本特公昭62-16497)对化学法合成的cdp-choline溶液，使用强酸性离子交换树脂rhpk-25.4-60(h型)柱和弱碱性离子交换树脂rwa-30(oh型)柱两道工序分离纯化，hplc纯度可达98％，收率未见报道。

这些方法都实现了胞二磷胆碱钠的分离，但均存在工艺复杂、产品得率偏低、产生大量废水固渣，环保压力大、分离成本高、等若干个缺点。

本发明中的胞二磷胆碱钠来源于特定大肠杆菌发酵所得胞二磷胆碱钠发酵液（cdp-choline发酵液）。通过基因工程手段改造大肠杆菌（k12系）获得以葡萄糖和氯化胆碱为底物合成胞二磷胆碱的工业菌株，通过增殖，诱导，底物的流加，产物浓度中控等发酵、反应得到胞二磷胆碱钠的发酵液。此发酵液中，存在着大量的菌体与色素，以及没有被转化完的底物氯化胆碱、无机磷酸盐、硫酸盐、铵盐、钙、镁和葡萄糖等，另外还有细胞自溶产生的杂质：蛋白和核酸等化合物。杂质成分要远远多于化学合成或者酶促合成，分离难度极大。本发明不仅成功实现了杂质多分离难的问题，还主要具备环保压力小、低成本、高品质、高得率等优点。

技术实现要素：

发明目的：本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，从品质、收率、成本、污染程度等综合考虑，提供一种品质好、收率高、成本低、污染少的从大肠杆菌发酵液中分离纯化胞二磷胆碱钠的方法。

技术方案：本发明提供了一种从微生物发酵液中分离纯化胞二磷胆碱钠的方法，包括以下步骤：

（1）胞二磷胆碱大肠杆菌发酵液经加热，絮凝，固液分离得到清液，清液经超滤、纳滤连续式预处理得到预处理液；

（2）预处理液通过预柱进行预处理，流出液经纯化柱吸附，再经氯化钠溶液洗脱，高纯度洗脱液合并后经减压浓缩、醇沉结晶，得到胞二磷胆碱钠粗品；

（3）将胞二磷胆碱钠粗品溶解，经活性炭脱色后过滤，滤液经减压浓缩，醇沉结晶后真空干燥，得到胞二磷胆碱钠成品。

本发明所述的从微生物发酵液中分离纯化胞二磷胆碱钠的方法，方法合理，其中提及的胞二磷胆碱发酵液来源于大肠杆菌发酵所得。步骤（1）采用加热，絮凝，固液分离相结合的方式，有效提取胞二磷胆碱，并除去菌体固渣，采用超滤和纳滤连续式操作，去除大部分色素、蛋白、部分盐类，减轻了步骤（2）预处理液中的杂质，大大提高了树脂对胞二磷胆碱的吸附能力，减少了树脂用量，使洗脱和树脂再生所产生的废水量减少。步骤（2）采用预柱处理，去除杂质阴离子及色素，提高了纯化柱的吸附能力，延长树脂使用周期，分离成本低，产品容易结晶，可得到含量在95-99%的胞二磷胆碱钠粗品。经步骤（3）精制，可得到高纯度、高收率的胞二磷胆碱钠成品。此法周期相对短，且总收率在65-70%之间，优于其他报道（约50%总收率）的胞二磷胆碱钠分离纯化技术。

进一步的，上述的从微生物发酵液中分离纯化胞二磷胆碱钠的方法，所述胞二磷胆碱大肠杆菌发酵液加热后加入絮凝剂絮凝，加热温度为70-100℃，加热时间为30-60min。

进一步的，上述的从微生物发酵液中分离纯化胞二磷胆碱钠的方法，所述絮凝剂为酸溶性壳聚糖或者聚丙烯亚胺（pei），用量为0.05-1%。最优选的是絮凝剂酸溶性壳聚糖，作为一种优选，酸溶性壳聚糖用量为0.05-0.2%。

进一步的，上述固液分离方式为板框过滤或者碟式离心分离或者陶瓷膜微滤，碟式分离离心力为10000-11000g，陶瓷膜孔径为100000-500000道尔顿，微滤压力为0.2-0.5mpa，陶瓷膜微滤作为一种优选，能去除所有菌体和悬浮杂质，200000道尔顿作为优选孔径。

进一步的，上述超滤膜和纳滤膜优选中空纤维超滤膜，膜材料为聚醚砜，超滤压力一般控制在0.7-1.2mpa。纳滤压力一般控制在1.0-2.0mpa，超滤、纳滤温度均控制在30-45℃，通过上述预处理可将cdp-choline发酵液中的菌体以及大分子蛋白质、大分子色素、硫酸根离子、磷酸根离子、大部分一价盐、进行去除。

进一步的，上述的从微生物发酵液中分离纯化胞二磷胆碱钠的方法，所述步骤（1）中固液分离所得清液经2000-20000道尔顿的超滤膜超滤，100-500道尔顿的纳滤膜纳滤。作为一种优选，固液分离所得清液经8000-10000道尔顿的超滤膜超滤，200道尔顿的纳滤膜纳滤。

进一步的，上述的从微生物发酵液中分离纯化胞二磷胆碱钠的方法，所述步骤（2）中减压浓缩至胞二磷酸胆碱钠浓度为200-400g/l；结晶条件是：加入料液体积3-6倍的乙醇，于4-25℃、80-120rpm的条件下搅拌12-24h；晶体过滤后用60-90%乙醇按体积比1:1淋洗。通过步骤（2），可将残留色素大部分留于母液中，从而得到hplc纯度99.9%以上,含量95-99%的胞二磷胆碱钠粗品。

进一步的，上述的从微生物发酵液中分离纯化胞二磷胆碱钠的方法，所述预柱为强碱性阴离子交换树脂，所述纯化柱为强碱性阴离子交换树脂。

进一步的，上述的从微生物发酵液中分离纯化胞二磷胆碱钠的方法，所述强碱性阴离子交换树脂预柱和强碱性阴离子交换树脂纯化柱为201*7、201*4、202中的一种或几种；上柱流速1-5bv/h，洗脱流速0.5-3bv/h；所述氯化钠溶液浓度为0.05-0.5mol/l。优选的是：预柱上柱流速1.5-2.5bv/h，纯化柱上柱流速1.5-2.5bv/h，洗脱流速1-1.5bv/h，洗脱剂氯化钠浓度为0.2mol/l。预柱和纯化柱均为强碱性阴离子树脂，为201*7、201*4、202中的一种或几种，优选201*4。

进一步的，上述的从微生物发酵液中分离纯化胞二磷胆碱钠的方法，所述步骤（2）中预处理液调节ph2-14；所述高纯度洗脱液合并后调节ph5.5-7.5。

进一步的，上述的从微生物发酵液中分离纯化胞二磷胆碱钠的方法，所述步骤（3）中，将胞二磷胆碱钠粗品复溶于去离子水至30-200g/l，活性炭常温脱色30min后经过0.22μm滤膜过滤，减压浓缩至200-400g/l；结晶条件是：加入料液体积3-8倍的乙醇，于4-25℃、80-120rpm的条件下搅拌12-24h；晶体过滤后用60-90%乙醇按体积比1:1淋洗；真空干燥温度为40-45℃。通过步骤（3），可进一步纯化胞二磷胆碱钠，hplc纯度99.9%以上，含量99%以上。

进一步的，上述的从微生物发酵液中分离纯化胞二磷胆碱钠的方法，所述活性炭为723、767、769中的一种或几种。活性炭来源广，应用方便，去色彻底，效果好。

有益效果：本发明具有以下优点：

1）本发明充分利用膜分离技术来预处理发酵液，依靠连续膜分离来处理发酵液，均可套用至下一批，减低了产品损失率，提高了分离效率和产物收率。通过与离子交换树脂纯化技术相结合，将cdp-choline发酵液固液分离、超滤、纳滤处理后经两根强碱性阴离子柱进行预处理和纯化，在纯化柱之前已除去绝大部分杂质，大大减小了后期纯化分离压力，为粗制、精制阶段的高收率提供了保障。

2）本发明只在精制阶段使用了少量活性炭脱色，整个工艺产生固废很少，符合环保理念。

3）上述的分离工艺与传统的活性炭吸附分离工艺相比，具有工艺流程简单，成本低廉，总收率高、产品品质好的优点。

4）此纯化工艺所得胞二磷胆碱钠，纯度达到99.9%以上。总收率为65-70%，大大优于其他厂家总收率普遍在50-55%的工艺水平。

附图说明

附图1：胞二磷胆碱钠的结构示意图；

附图2：胞二磷胆碱钠的检测图谱。

具体实施方式

下面将通过几个具体实施例，进一步阐明本发明，这些实施例只是为了说明问题，并不是一种限制。

实施例1

按照上述方法制备cdp-choline发酵液8.4l，其中cdp-choline浓度为19.5g/l，共计163.8g。处理工艺如下：

1）8.4l胞二磷胆碱发酵液经100℃加热30min，加入0.2%酸溶性壳聚糖絮凝，产生絮状沉淀经板框过滤器压滤得到清液，清液经超滤收集透过液，透过液经纳滤收集截留液，得到最终的预处理液。其中:超滤膜、纳滤膜均为聚醚砜材质；超滤膜截留分子量为10000道尔顿，超滤工作压力为0.7-0.9mpa，工作温度为30-35℃；纳滤膜截留分子量为500道尔顿，纳滤工作压力为1.0-1.2mpa，工作温度为30-35℃。预处理液共计5.1l，其中cdp-choline浓度为30.1g/l，预处理收率为93.7%。

2）将预处理液调节ph10，以2bv/h的流速上强碱性阴离子交换树脂201*4，流出液再以2bv/h的流速上201*4层析柱吸附。当吸附流出液中cdp-choline浓度为上柱液中浓度的5%时，树脂已饱和，停止继续上柱，然后用2bv去离子水水洗柱，用0.2mol/l氯化钠溶液洗脱，洗脱流速为1.5bv/h,收集hplc纯度95%以上高纯度组分，合并后调节ph6.0，得7.2l，其中cdp-choline浓度为18.9g/l，纯化收率为88.6%。经60℃真空减压浓缩至600ml，其中cdp-choline浓度为220g/l，缓慢滴加3l（5倍料液体积）的无水乙醇，在4℃，120rpm搅拌结晶16h，晶体过滤后用75%乙醇按体积比1:1淋洗，得到hplc纯度99.9%、含量97.2%的胞二磷胆碱钠粗品130.4g。粗制总收率为82.6%。

3）将130.4g胞二磷胆碱钠粗品溶解定容为2.4l，加入1.25g（1%）试剂级活性炭723，常温搅拌30min后过滤，滤清液过0.22μm滤膜，60℃真空减压浓缩至320ml，其中cdp-choline浓度为390.6g/l，缓慢滴加2l（6倍料液体积）的无水乙醇，在4℃，120rpm搅拌结晶16h，晶体过滤后用75%乙醇按体积比1:1淋洗，45℃真空干燥得到胞二磷胆碱钠成品115.2g。hplc纯度为99.9%、含量为99.5%。精制收率为90.4%。

总收率为70.0%。

实施例2

按照上述方法制备cdp-choline发酵液8.0l，其中cdp-choline浓度为21.3g/l，共计170.4g。处理工艺如下：

1）8.0l胞二磷胆碱发酵液经80℃加热45min，加入0.15%酸溶性壳聚糖絮凝，产生絮状沉淀经管式离心得到清液，清液经超滤收集透过液，透过液经纳滤收集截留液，得到最终的预处理液。其中:超滤膜、纳滤膜均为聚醚砜材质；超滤膜截留分子量为5000道尔顿，超滤工作压力为0.9-1.1mpa，工作温度为35-40℃；纳滤膜截留分子量为200道尔顿，纳滤工作压力为1.2-1.5mpa，工作温度为35-40℃。预处理液共计5.0l，其中cdp-choline浓度为31.5g/l，预处理收率为92.4%。

2）将预处理液调节ph7.5，以3bv/h的流速上强碱性阴离子交换树脂201*4，流出液再以3bv/h的流速上201*4层析柱吸附。当吸附流出液中cdp-choline浓度为上柱液中浓度的5%时，树脂已饱和，停止继续上柱，然后用2bv去离子水水洗柱，，用0.3mol/l氯化钠溶液洗脱，洗脱流速为2bv/h,收集hplc纯度95%以上高纯度组分，合并后调节ph7.5，得9.5l，其中cdp-choline浓度为15.3g/l，纯化收率为92.3%。经60℃真空减压浓缩至420ml，其中cdp-choline浓度为338.8g/l，缓慢滴加3.36l（8倍料液体积）的无水乙醇，在10℃，100rpm搅拌结晶16h，晶体过滤后用60%乙醇按体积比1:1淋洗，得到hplc纯度为99.5%、含量为96.5%的胞二磷胆碱钠粗品129.8g。粗制总收率为79.5%。

3）将129.8g胞二磷胆碱钠粗品溶解定容为1.2l，加入1.2g（1%）试剂级活性炭767，常温搅拌30min后过滤，滤清液过0.22μm滤膜，60℃真空减压浓缩至400ml，其中cdp-choline浓度为305.3g/l，缓慢滴加2l（5倍料液体积）的无水乙醇，在10℃，100rpm搅拌结晶16h，晶体过滤后用80%乙醇按体积比1:1淋洗，45℃真空干燥得到胞二磷胆碱钠成品111.8g。hplc纯度为99.9%、含量为99.2%。精制收率为88.5%。

总收率为65.1%。

实施例3

按照上述方法制备cdp-choline发酵液9.3l，其中cdp-choline浓度为23.4g/l，共计217.6g。处理工艺如下：

1）9.3l胞二磷胆碱发酵液经90℃加热40min，加入0.1%酸溶性壳聚糖絮凝，产生絮状沉淀经板框过滤器压滤得到清液，清液经超滤收集透过液，透过液经纳滤收集截留液，得到最终的预处理液。其中:超滤膜、纳滤膜均为聚醚砜材质；超滤膜截留分子量为2000道尔顿，超滤工作压力为1.0-1.2mpa，工作温度为40-45℃；纳滤膜截留分子量为200道尔顿，纳滤工作压力为1.5-2.0mpa，工作温度为40-45℃。预处理液共计6.1l，其中cdp-choline浓度为33.2g/l，预处理收率为93.1%。

2）将预处理液调节ph13，以1bv/h的流速上强碱性阴离子交换树脂201*7，流出液再以1bv/h的流速上201*7层析柱吸附。当吸附流出液中cdp-choline浓度为上柱液中浓度的5%时，树脂已饱和，停止继续上柱，然后用2bv去离子水水洗柱，用0.2mol/l氯化钠溶液洗脱，洗脱流速为1bv/h,收集hplc纯度95%以上高纯度组分，合并后调节ph5.5，得10.4l，其中cdp-choline浓度为18.1g/l，纯化收率为92.9%。经60℃真空减压浓缩至480ml，其中cdp-choline浓度为385.2g/l，缓慢滴加2.4l（5倍料液体积）的无水乙醇，在4℃，80rpm搅拌结晶24h，晶体过滤后用85%乙醇按体积比1:1淋洗，得到hplc纯度99.9%、含量95.3%的胞二磷胆碱钠粗品183.9g。粗制总收率为86.5%。

3）将183.9g胞二磷胆碱钠粗品溶解定容为2.2l，加入1.8g（1%）试剂级活性炭769，常温搅拌30min后过滤，滤清液过0.22μm滤膜，60℃真空减压浓缩至680ml，其中cdp-choline浓度为249.7g/l，缓慢滴加3.1l（4.5倍料液体积）的无水乙醇，在4℃，80rpm搅拌结晶24h，晶体过滤后用85%乙醇按体积比1:1淋洗，42℃真空干燥得到胞二磷胆碱钠成品150.1g。hplc纯度为99.9%、含量为99.7%。精制收率为85.4%。

总收率为68.8%。

实施例4

按照上述方法制备cdp-choline发酵液10.2l，其中cdp-choline浓度为14.2g/l，共计246.8g。处理工艺如下：

1）10.2l胞二磷胆碱发酵液经60℃加热50min，经陶瓷膜微滤得到清液，清液经超滤收集透过液，透过液经纳滤收集截留液，得到最终的预处理液。其中:微滤膜为陶瓷材质，截留分子量为200000道尔顿，工作压力为0.3-0.4mpa，工作温度为50-55℃；超滤膜、纳滤膜均为聚醚砜材质；超滤膜截留分子量为10000道尔顿，超滤工作压力为0.9-1.0mpa，工作温度为35-40℃；纳滤膜截留分子量为100道尔顿，纳滤工作压力为1.5-2.0mpa，工作温度为35-40℃。预处理液共计6.4l，其中cdp-choline浓度为35.8g/l，预处理收率为92.8%。

2）将预处理液调节ph2，以2.5bv/h的流速上强碱性阴离子交换树脂201*7，流出液再以2.5bv/h的流速上201*7层析柱吸附。当吸附流出液中cdp-choline浓度为上柱液中浓度的5%时，树脂已饱和，停止继续上柱，然后用2bv去离子水水洗柱，用0.05mol/l氯化钠溶液洗脱，洗脱流速为3bv/h,收集hplc纯度95%以上高纯度组分，合并后调节ph6.5，得12.2l，其中cdp-choline浓度为16.7g/l，纯化收率为88.9%。经60℃真空减压浓缩至660ml，其中cdp-choline浓度为300.6g/l，缓慢滴加3l（4.5倍料液体积）的无水乙醇，在15℃，100rpm搅拌结晶24h，晶体过滤后用90%乙醇按体积比1:1淋洗，得到hplc纯度为99.8%、含量为95.9%的胞二磷胆碱钠粗品197.2g。粗制总收率为82.5%。

3）将197.2g胞二磷胆碱钠粗品溶解定容为1.3l，加入1.9g（1%）试剂级活性炭767，常温搅拌30min后过滤，滤清液过0.22μm滤膜，60℃真空减压浓缩至520ml，其中cdp-choline浓度为351.0g/l，缓慢滴加2.1l（4倍料液体积）的无水乙醇，在15℃，100rpm搅拌结晶16h，晶体过滤后用80%乙醇按体积比1:1淋洗，40℃真空干燥得到胞二磷胆碱钠成品168.2g。hplc纯度为99.9%、含量为99.6%。精制收率为88.6%。

总收率为67.9%。

实施例5

按照上述方法制备cdp-choline发酵液7.5l，其中cdp-choline浓度为23.1g/l，共计173.3g。处理工艺如下：

1）7.5l胞二磷胆碱发酵液经70℃加热50min，加入0.3%聚乙烯亚胺（pei）絮凝，产生絮状沉淀经管式离心得到清液，清液经超滤收集透过液，透过液经纳滤收集截留液，得到最终的预处理液。其中:超滤膜、纳滤膜均为聚醚砜材质；超滤膜截留分子量为20000道尔顿，超滤工作压力为0.7-0.9mpa，工作温度为40-45℃；纳滤膜截留分子量为500道尔顿，纳滤工作压力为1.2-1.5mpa，工作温度为40-45℃。预处理液共计5.5l，其中cdp-choline浓度为29.5g/l，预处理收率为93.7%。

2）将预处理液调节ph10，以3bv/h的流速上强碱性阴离子交换树脂201*4，流出液再以2bv/h的流速上201*4层析柱吸附。当吸附流出液中cdp-choline浓度为上柱液中浓度的5%时，树脂已饱和，停止继续上柱，然后用2bv去离子水水洗柱，用0.5mol/l氯化钠溶液洗脱，洗脱流速为0.5bv/h,收集hplc纯度95%以上高纯度组分，合并后调节ph6.0，得9.3l，其中cdp-choline浓度15.6g/l，纯化收率为89.4%。经60℃真空减压浓缩至570ml，其中cdp-choline浓度为249.1g/l，缓慢滴加2.3l（4倍料液体积）的无水乙醇，在25℃，120rpm搅拌结晶12h，晶体过滤后用80%乙醇按体积比1:1淋洗，得到hplc纯度为99.9%、含量为98.2%的胞二磷胆碱钠粗品130.0g。粗制总收率为78.7%。

3）将130.0g胞二磷胆碱钠粗品溶解定容为1.1l，加入1.2g（1%）试剂级活性炭723，常温搅拌30min后过滤，滤清液过0.22μm滤膜，60℃真空减压浓缩至600ml，其中cdp-choline浓度为206.6g/l，缓慢滴加3.6l（6倍料液体积）的无水乙醇，在20℃，120rpm搅拌结晶12h，晶体过滤后用80%乙醇按体积比1:1淋洗，45℃真空干燥得到胞二磷胆碱钠成品118.1g。hplc纯度为99.9%、含量为99.3%。精制收率为91.9%。

总收率为67.7%。

实施例6

按照上述方法制备cdp-choline发酵液7.8l，其中cdp-choline浓度为22.7g/l，共计177.1g。处理工艺如下：

1）7.8l胞二磷胆碱发酵液经80℃加热60min，经陶瓷膜微滤得到清液，清液经超滤收集透过液，透过液经纳滤收集截留液，得到最终的预处理液。其中:微滤膜为陶瓷材质，截留分子量为500000道尔顿，工作压力为0.3-0.5mpa，工作温度为60℃；超滤膜、纳滤膜均为聚醚砜材质；超滤膜截留分子量为20000道尔顿，超滤工作压力为0.9-1.1mpa，工作温度为35-40℃；纳滤膜截留分子量为500道尔顿，纳滤工作压力为1.2-1.5mpa，工作温度为35-40℃。预处理液共计5.7l，其中cdp-choline浓度为29.2g/l，预处理收率为94.0%。

2）将预处理液调节ph11，以2.5bv/h的流速上强碱性阴离子交换树脂202，流出液再以2.5bv/h的流速上202层析柱吸附。当吸附流出液中cdp-choline浓度为上柱液中浓度的5%时，树脂已饱和，停止继续上柱，然后用2bv去离子水水洗柱，用0.05mol/l氯化钠溶液洗脱，洗脱流速为1.0bv/h,收集hplc纯度95%以上高纯度组分，合并后调节ph6.0，得10.2l，其中cdp-choline浓度14.5g/l，纯化收率为88.9%。经60℃真空减压浓缩至510ml，其中cdp-choline浓度为290.0g/l，缓慢滴加2l（4倍料液体积）的无水乙醇，在25℃，120rpm搅拌结晶14h，晶体过滤后用80%乙醇按体积比1:1淋洗，得到hplc纯度为99.9%、含量为98.5%的胞二磷胆碱钠粗品135.3g。粗制总收率为80.1%。

3）将135.3g胞二磷胆碱钠粗品溶解定容为1.0l，加入1.3g（1%）试剂级活性炭767，常温搅拌30min后过滤，滤清液过0.22μm滤膜，60℃真空减压浓缩至600ml，其中cdp-choline浓度为222.1g/l，缓慢滴加3.0l（5倍料液体积）的无水乙醇，在20℃，120rpm搅拌结晶12h，晶体过滤后用80%乙醇按体积比1:1淋洗，45℃真空干燥得到胞二磷胆碱钠成品122.1g。hplc纯度为99.9%、含量为99.1%。精制收率为90.8%。

总收率为68.4%。

实施例7

高效液相色谱（hplc）检测，hplc的参数如下：采用agilentsbc184.6*150mm5um，流动相为甲醇和10mmpbs(ph4.0)，流动相比例0.01-4.00分钟甲醇比例为2%，4.00-5.00分钟甲醇比例由2%上升到10%，5.00-5.01分钟甲醇比例由10%降至2%，5.10-10.0分钟甲醇比例为2%，利用紫外检测器检，测波长272nm；流动相的流速为0.8ml/min，发酵液的上样量5μl，柱温30℃。cdpc出峰时间为2.745分钟，图谱如图2所示。

以上所述仅是发明的几个实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。