一种MTHFR基因的多重PCR扩增试剂盒及扩增方法与流程

本发明涉及一种mthfr基因的多重pcr扩增试剂盒及扩增方法，属于生物领域，尤其是生物检测领域。

背景技术：

亚甲基四氢叶酸还原酶(mthfr)，主要作用是在叶酸代谢通路中将5,10-亚甲基四氢叶酸转化为具有生物学功能的5-甲基四氢叶酸。5-甲基四氢叶酸可以进一步进入甲基传递通路，通过同型半胱氨酸的重新甲基化过程间接为dna甲基化和蛋白质甲基化提供甲基并且使血液中的同型半胱氨酸水平保持在一个较低的水平。此外叶酸的中间代谢产物在核苷酸合成过程中也有重要的作用，通过一碳单位代谢为嘌呤环的形成提供碳原子。mthfr基因的缺陷将导致机体多个基础生化过程的紊乱，包括细胞周期调控、dna复制、dna以及蛋白质甲基化修饰等，并进而引发神经管缺陷、癌症、心脑血管疾病等多种病症。mthfr基因的缺陷对孕妇人群会引起神经管缺陷、先天性心脏病、唇腭裂、妊娠期高血压疾病，自发性流产。mthfr是常规的孕妇检查项目，由于mthfr基因多态性具有2个snp位点，因此mthfr的snp位点就成为了最重要的检测指标，而现有的mthfr检测一般采用常用的测序法，测序过程耗时较长且效率较低，一次只能检测一个位点，2个位点需要进行2次检测，检测成本较高，因此，针对mthfr的snp位点设计一种高针对性的多重pcr扩增方法和扩增检测试剂盒成为了目前市场上的一个空缺。

技术实现要素：

针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是获得一种mthfr基因的多重pcr扩增试剂盒及扩增方法。

为实现上述发明目的之一，本发明采用的mthfr基因的多重pcr扩增试剂盒的技术方案如下：

所述试剂盒包括mthfr基因snp位点的扩增引物、taq酶、dntps和缓冲液，其中mthfr基因的snp位点选自：c667t、a1298c、mtrr和/或a66g。

本发明的试剂盒针对mthfr的核心致病位点进行快速高效的多重pcr扩增，多个位点同时扩增，使得检测时间大大降低，且根据位点设计的引物特异性高针对性强，错配率低，扩增产物易检测易分离，便于进一步的测序或检测工作的顺利进行。

优选的，试剂盒的其中一种常用的方案是mthfr的c667t和a1298c的同时扩增，其中c667t的序列如序列表seqidno：1所示，a1298c的序列如序列表seqidno：2所示。

优选的，用于扩增c667t和a1298c的引物序列如序列表seqidno：3～seqidno：6所示，用于扩增seqidno：1所示片段的上下游引物序列如序列表seqidno：3和seqidno：4所示，用于扩增seqidno：2所示片段的上下游引物序列如序列表seqidno：5和seqidno：6所示。

在多重pcr扩增时，每组扩增模板和引物的添加量与常规pcr相同，每组之间添加量相同，这样可以使扩增时所有的引物和模板之间的相互影响降低到最小。

本发明中的扩增试剂盒一般采用处理过的dna样品作为扩增模板，样品一般来源于人全血或组织，处理样品可以减少血液中的免疫球蛋白g、血红蛋白和乳铁蛋白对pcr反应体系的干扰。

优选的，本试剂盒中还设有全血样品pcr缓冲液，所述缓冲液含有100mmol/ltris-hcl，50mmol/lkcl，ph9.3～9.5。全血样品pcr缓冲液是本发明的一种优选的实施方案，其他类型的全血pcr试剂均可以采用，不限于本发明中的缓冲液和缓冲液配方。

本发明的第二个目的在于提供一种采用上述扩增试剂盒的扩增方法，所述方法采用25μl的多重pcr体系，具体为：

10×pcrbuffer2μl；

mg²⁺(25mmol/l)1μl；

dntps(25mmol/l)0.6μl；

taq酶(5u/μl)0.3μl；

c667t和a1298c模板各2μl；

c667t和a1298c上下游引物(10μmol/l)各1μl；

无菌双蒸水补齐至25μl。

本试剂盒推荐的多重pcr反应条件为：94℃预变性5.5min；然后94℃变性30s，58℃退火45s，72℃延伸50s，36个循环后，再次72℃延伸5min。

本试剂盒中一般采用提纯处理后的dna样本进行扩增检测。但本试剂盒中还包括全血扩增缓冲液，便于将采集到的人全血样品直接进行扩增，扩增时以全血样品缓冲液替换现有的pcr体系中的pcrbuffer。

与现有技术相比，本发明采用多重pcr的扩增方法，同时扩增mthfr的多个重要snp位点，且可以根据实际需要灵活选择扩增的位点组合，可以起到一盒多用的作用，试剂盒中的引物特异性高，错配率低，引物长度和tm值设计合理，扩增产物便于检测分离。一次扩增多条目的产物，不仅大大提高了扩增效率，降低了扩增成本。这种检测试剂盒可以扩展延伸到其他的snp位点检测中，具有良好的推广价值。

附图说明

图1是本发明提供的pcr扩增产物电泳图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的mthfr基因的多重pcr扩增试剂盒及扩增方法作进一步详细、完整地说明。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为市场购买得到。

本实施例中的多重pcr扩增试剂盒主要针对mthfr的两个核心snp位点进行检测，这两个位点分别是mthfrc677t(rs1801133)和mthfra1298c(rs1801131)，试剂盒包括针对两个位点设计的两对扩增引物、taqdna聚合酶、dntps和缓冲液，其中taqdna聚合酶为takara公司的extaqdna聚合酶。

本实施例试剂盒中采用的dna模板为处理后的提取的dna模板，对于采集的人全血或组织来说，需要预先进行处理。如待扩增样品为未经处理的全血样品，需采用用于全血样品pcr的缓冲液，其中含有100mmol/ltris-hcl，50mmol/lkcl，ph9.3～9.5。

一、扩增引物设计

本实施例中采用多重pcr复合扩增mthfrc677t和mthfra1298c，对上述位点进行快速扩增，具体的待扩增序列如下：

mthfrc677t型基因序列在ncbi中记载的标号为rs1801133，序列如序列表seqidno:1所示，其中“y”代表snp位点，表示该位点的变化为c或t，具体如下：

ttcagtgttacattaaaaacaatgtttaatccggtgcctagagaaaagtcaagcttactaccccagatgctgcccagccagtgctaactgtagcattttctcttttctatggccaccaagtgcaggcctgatttgcttggctgctcaaggcaggacagtgtgggagtttggagcaatccacccccactcttggaactgggctctgagccacctcccctgagagtcatctctggggtcagaagcatatcagtcatgagcccagccactcactgttttagttcaggctgtgctgtgctgttggaaggtgcaagatcagagcccccaaagcagaggactctctctgcccagtccctgtggtctcttcatccctcgccttgaacaggtggaggccagcctctcctgactgtcatccctattggcaggttaccccaaaggccaccccgaagcagggagctttgaggctgacctgaagcacttgaaggagaaggtgtctgcgggagycgatttcatcatcacgcagcttttctttgaggctgacacattcttccgctttgtgaaggcatgcaccgacatgggcatcacttgccccatcgtccccgggatctttcccatccaggtgaggggcccaggagagcccataagctccctccaccccactctcaccgcaccgtcctcgcacaggctgggggctctgggtggagtgctgagttcgctgagttcttcccagatctcctctcaggtccagaacttgcacagcgttgcttggccaccccattttggttacctctaattttccccccaaaacccagcaacagtgtctgttgaggggtttgttgtactttggccaacaagcatcaccaaaagggattctaattctcattacaaatcctgcttaaatcagtgtttcccaaaggtggctgtcatcagaaccacttgataagctttttcaaaaagtggatctccaggtcccacccctggaggttctcactcagtaaatctga

mthfra1298c型基因型序列在ncbi中记载的标号为rs1801131，序列如序列表seqidno:2所示，其中“m”代表snp位点，表示该位点的变化为a或c，具体如下：

tccggctccctctagccaatcccttgtctcaattctctgtccccatcctcacccaggcgtcccctaccctgggctctcagcgcccaccccaagcgccgagaggaagatgtacgtcccatcttctgggcctccagaccaaagagttacatctaccgtacccaggagtgggacgagttccctaacggccgctggtgagggcctgcagaccttccttgcaaatacatctttgttcttgggagcgggagggcagaagaagtttgcatgcttgtggttgacctgggaggagtcaggggcagaatttacaggaatggcctcctgggcatgtggtggcactgccctctgtcaggagtgtgccctgacctctgggcacccctctgccaggggcaattcctcttcccctgcctttggggagctgaaggactactacctcttctacctgaagagcaagtcccccaaggaggagctgctgaagatgtggggggaggagctgaccagtgaagmaagtgtctttgaagtcttcgttctttacctctcgggagaaccaaaccggaatggtcacaaagtgagtgatgctggagtggggaccctggttcatcccctgcccctggcctgaccccagctgcaggccaggctgcggggctgtgacttccccatcctgtgccctcccctccatgctgtggacatggcaaagggagaagggtaagttgggagacctccacctggaagggcttagggaggcaaagacaggctgggtctttgttgggggccgtgagagggactcagggtgccaaacctgatggtcgccccagccagctcaccgtctctcccaggtgacttgcctgccctggaacgatgagcccctggcggctgagaccagcctgctgaaggaggagctgctgcgggtgaaccgccagggcatcctcaccatcaactcacagcccaacatcaacgggaagccgtcctccgaccccatcgtgggctggggccccagcgggggctat

根据上述序列设计两对扩增引物，引物序列具体如下：

二、多重pcr

选择25μl的pcr体系，其中

10×pcrbuffer2μl；

mg²⁺(25mmol/l)1μl；

dntps(25mmol/l)0.6μl；

taq酶(5u/μl)0.3μl；

cyp2c19*2型、cyp2c19*3型和cyp2c19*17型模板各2μl；

cyp2c19*2型、cyp2c19*3型和cyp2c19*17型上下游引物(10μmol/l)各1μl；

无菌双蒸水补齐至25μl。

pcr反应条件：94℃预变性5.5min；然后94℃变性30s，58℃退火45s，72℃延伸50s，36个循环后，再次72℃延伸5min。

三、pcr产物验证

选择2％琼脂糖凝胶电泳，电泳图如图1所示，条带1为dnamarker，条带2为扩增产物，电泳结果证明扩增结果无误。

将电泳结果胶回收后送测序，测序结果也与目的产物序列一致。

最后有必要在此说明的是：以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细地说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。

序列表

<110>湘潭智联技术转移促进有限责任公司

<120>一种mthfr基因的多重pcr扩增试剂盒及扩增方法

<130>2017

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1001

<212>dna

<213>homosapiens

<220>

<221>gene

<222>(1)..(1001)

<223>mthfrc677t型基因序列

<400>1

ttcagtgttacattaaaaacaatgtttaatccggtgcctagagaaaagtcaagcttacta60

ccccagatgctgcccagccagtgctaactgtagcattttctcttttctatggccaccaag120

tgcaggcctgatttgcttggctgctcaaggcaggacagtgtgggagtttggagcaatcca180

cccccactcttggaactgggctctgagccacctcccctgagagtcatctctggggtcaga240

agcatatcagtcatgagcccagccactcactgttttagttcaggctgtgctgtgctgttg300

gaaggtgcaagatcagagcccccaaagcagaggactctctctgcccagtccctgtggtct360

cttcatccctcgccttgaacaggtggaggccagcctctcctgactgtcatccctattggc420

aggttaccccaaaggccaccccgaagcagggagctttgaggctgacctgaagcacttgaa480

ggagaaggtgtctgcgggagycgatttcatcatcacgcagcttttctttgaggctgacac540

attcttccgctttgtgaaggcatgcaccgacatgggcatcacttgccccatcgtccccgg600

gatctttcccatccaggtgaggggcccaggagagcccataagctccctccaccccactct660

caccgcaccgtcctcgcacaggctgggggctctgggtggagtgctgagttcgctgagttc720

ttcccagatctcctctcaggtccagaacttgcacagcgttgcttggccaccccattttgg780

ttacctctaattttccccccaaaacccagcaacagtgtctgttgaggggtttgttgtact840

ttggccaacaagcatcaccaaaagggattctaattctcattacaaatcctgcttaaatca900

gtgtttcccaaaggtggctgtcatcagaaccacttgataagctttttcaaaaagtggatc960

tccaggtcccacccctggaggttctcactcagtaaatctga1001

<210>2

<211>1001

<212>dna

<213>homosapiens

<220>

<221>gene

<222>(1)..(1001)

<223>mthfra1298c型基因序列

<400>2

tccggctccctctagccaatcccttgtctcaattctctgtccccatcctcacccaggcgt60

cccctaccctgggctctcagcgcccaccccaagcgccgagaggaagatgtacgtcccatc120

ttctgggcctccagaccaaagagttacatctaccgtacccaggagtgggacgagttccct180

aacggccgctggtgagggcctgcagaccttccttgcaaatacatctttgttcttgggagc240

gggagggcagaagaagtttgcatgcttgtggttgacctgggaggagtcaggggcagaatt300

tacaggaatggcctcctgggcatgtggtggcactgccctctgtcaggagtgtgccctgac360

ctctgggcacccctctgccaggggcaattcctcttcccctgcctttggggagctgaagga420

ctactacctcttctacctgaagagcaagtcccccaaggaggagctgctgaagatgtgggg480

ggaggagctgaccagtgaagmaagtgtctttgaagtcttcgttctttacctctcgggaga540

accaaaccggaatggtcacaaagtgagtgatgctggagtggggaccctggttcatcccct600

gcccctggcctgaccccagctgcaggccaggctgcggggctgtgacttccccatcctgtg660

ccctcccctccatgctgtggacatggcaaagggagaagggtaagttgggagacctccacc720

tggaagggcttagggaggcaaagacaggctgggtctttgttgggggccgtgagagggact780

cagggtgccaaacctgatggtcgccccagccagctcaccgtctctcccaggtgacttgcc840

tgccctggaacgatgagcccctggcggctgagaccagcctgctgaaggaggagctgctgc900

gggtgaaccgccagggcatcctcaccatcaactcacagcccaacatcaacgggaagccgt960

cctccgaccccatcgtgggctggggccccagcgggggctat1001

<210>3

<211>22

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(22)

<223>mthfrc677tforward引物序列

<400>3

ccagtccctgtggtctcttcat22

<210>4

<211>22

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(22)

<223>mthfrc677treverse引物序列

<400>4

acaaagcggaagaatgtgtcag22

<210>5

<211>22

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(22)

<223>mthfra1298cforward引物序列

<400>5

tctacctgaagagcaagtcccc22

<210>6

<211>22

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(22)

<223>mthfra1298creverse引物序列

<400>6

cactcactttgtgaccattccg22