本发明属于动物生殖干细胞的体外分离、培养、建系技术领域，尤其涉及一种鸡性腺原始生殖细胞快速分离与建系的方法。
背景技术：
生殖干细胞是具有产生配子能力的一群具有自我更新以及分化能力的多能干细胞。生殖干细胞在早期胚胎中开始出现，迁移到生殖脊形成性腺，并最终构成动物生殖器官的重要组成部分。在动物繁殖育种过程中，生殖干细胞扮演着重要的角色，不仅在动物早期胚胎发育中起到重要作用，在机体发育成熟后产生配子的过程中，其自我更新能力与分化能力的维持也对精子发生、卵子起着决定性的作用。生殖干细胞的相关研究，有利于生殖类疾病发生机理的发现与治疗，在动物繁殖育种工作中，对优质种质资源的保存及推广、珍稀动物种质资源的保护以及转基因动物的研制等方面都有着极高的价值。
原始生殖细胞是在动物胚胎时期出现的一种具有多能性的生殖干细胞，也是动物出生后体内的精原干细胞或者卵原干细胞的前体细胞。鸡原始生殖细胞的分离及体外培养的几种方法已经获得成功。robertj等从14-17期的鸡胚中取少量血液，以brl细胞作为饲养层，以一种ko-dmem为底液的培养基培养，成功分离并长期培养具有生殖系传递能力的原始生殖细胞(vandelavoir，m.c.，diamond，j.h.，leighton，p.a.，mather-love，c.，heyer，b.s.，bradshaw，r.，...etches，r.j.(2006).germlinetransmissionofgeneticallymodifiedprimordialgermcells.nature，441(7094)，766-769.doi：10.1038/nature04831)。而han等以相似的方法，用ko-dmem为底液的另一种培养基也成功分离并体外培养鸡的原始生殖细胞，且维持原始生殖细胞的细胞特性并具有性腺迁移能力(park&han，j.y.(2012).piggybactranspositionintoprimordialgermcellsisanefficienttoolfortransgenesisinchickens.procnatlacadsciusa，109(24)，9337-9341.doi：10.1073/pnas.1203823109)。然而，这些方法获得原始生殖细胞的建系成功率低(约5％-30％)、建系时间长(30-60d)，且培养体系都具有不稳定性和低效性。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是提供一种成功率高、时间短、稳定高效的鸡性腺原始生殖细胞快速分离与建系的方法。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
鸡性腺原始生殖细胞快速分离与建系的方法，从7日龄鸡胚的性腺中分离、纯化原始生殖细胞，利用cultureinsert配合饲养层的方法，将原始生殖细胞置于优化的培养液进行培养，实现快速扩增建系；优化的培养液组成为ko-dmem，0.2％鸡血清，1％胎牛血清，1.2mm丙酮酸钠，100ug/ml肝素钠，1xantibiotic-antimycotic，1xglutamax，1xgsnucleosidesupplement，0.1mmb-巯基乙醇，4ng/mlhfgfb，1xneaa，1xb-27vitamina，25ng/mlhumanactivina。
培养液在原代培养时2-3d进行半量换液。
上述鸡性腺原始生殖细胞快速分离与建系的方法，包括以下步骤：
<1>鸡胚的准备；
<2>原始生殖细胞的分离；
<3>原始生殖细胞的纯化；
<4>原始生殖细胞细胞的原代培养；
<5>原始生殖细胞传代培养和建系。
步骤<1>按以下操作进行：将受精种蛋在孵化箱内进行孵化，到第七天时取用。
步骤<2>按以下操作进行：取出7天胚龄鸡胚，将性腺分离，转移到事先准备的预热30μl的pbs液滴中洗涤，重复洗涤两次后，以1对性腺为一组，移入装有20μl0.05％的胰酶的500μl的离心管中，37℃水浴消化8分钟，用200μl普通成纤维细胞培养液终止消化，并轻轻吹打至性腺组织块成为细胞悬液。
步骤<3>按以下操作进行：转移细胞悬液到24孔板中，37℃，5％co2培养4h，收集未贴壁细胞到15ml的离心管中，每5对性腺为一组，用原始生殖细胞培养液重悬细胞，转移到30mm的细胞培养皿中，培养皿上已铺好饲养层，并提前30min置入cultureinsert中。
步骤<4>按以下操作进行：用原始生殖细胞培养液培养，每2d进行半量换液，每4-5d更换mef饲养层。
mef饲养层提前用15g/ml的丝裂霉素c处理2h。
步骤<5>按以下操作进行：将以上培养的原始生殖细胞在培养至第8d时，更换cultureinsert，以1∶2到1∶3的比例传代到含有新饲养层的培养基中，每1-2d进行半量换液。
鸡为白羽鸡、广西三黄鸡、东兰乌鸡。
针对现有鸡原始生殖细胞分离及建系存在的问题，发明人建立了一种鸡性腺原始生殖细胞快速分离与建系的方法，从7日龄鸡胚的性腺中分离、纯化原始生殖细胞，利用cultureinsert配合饲养层的方法，将原始生殖细胞置于优化的培养液进行培养，实现快速扩增建系。试验表明，本发明成功率高、时间短、稳定高效，建系的细胞表达生殖干细胞特异性标记，并保持良好的性腺迁移能力，为家禽种质资源保存和转基因鸡制备研究奠定了基础。具体而言，本发明的突出优势在于：
(1)本发明适用于鸡等家禽的原始生殖细胞的分离、纯化及培养。所分离的原始生殖细胞为典型的单个圆形细胞，细胞体积较一般细胞偏大，光滑透亮，ssea1、dazl染色为阳性，仍保持原始生殖细胞的特性。
(2)本发明具有简单、高效的特点，可在15d内扩增获得106以上细胞。
(3)本发明具有稳定性和高效性，在针对不同品种的鸡pgcs的分离建系实验中，建系成功率高达80％-90％。
附图说明
图1是本发明分离纯化后的原始生殖细胞图，图中：左为分离纯化后的鸡原始生殖细胞(100倍)，右为分离后的鸡原始生殖细胞(200倍)。
图2是本发明纯化原始生殖细胞后放入cultureinsert中的细胞形态图。
图3是本发明在扩增细胞时处于快速增殖状态中的细胞。
图4是本发明成功建系后的细胞进行ssea1染色鉴定图，图中：4-a，ssea-1染色细胞的明场图；4-b，ssea1免疫荧光阳性细胞；4-c，dapi对细胞核的免疫荧光染色；4-d，dapi与ssea-1染色的merge图；下方四图则为单染dapi的二抗对照组图片，依次为：4-e，二抗对照染色细胞的明场图；4-f，二抗免疫荧光染色对照；4-gdapi对细胞核的免疫荧光染色；4-h，dapi与二抗对照染色的merge图；。
图5是本发明对原始生殖细胞进行绿色荧光蛋白转染后初步纯化的细胞系图，图中：左为egfp慢病毒转导pgc的明场图；中为egfp慢病毒转导pgc的绿色荧光图；右为egfp慢病毒转导pgc的merge图。
图6是本发明成功建系后的细胞进行性腺迁移能力的鉴定图，图中：左为8日龄受体鸡胚性腺的明场图，右为8日龄受体鸡胚性腺绿色荧光pgc的迁移图。
具体实施方式
一、材料
实验所用种蛋来源于白羽鸡、广西三黄鸡、东兰乌鸡。
二、方法
<1>鸡胚的准备
将受精种蛋在孵化箱内，以37.5℃，70％湿度条件进行孵化，到第七天时取用。
<2>原始生殖细胞的分离
将孵化7天的受精种蛋取出到无菌操作室，用酒精喷擦种蛋表面，用无菌弯镊在蛋的大端开口，取出7d胚龄鸡胚，置于100mm的细胞培养皿中，于体视显微镜下观察。在体视显微镜下解剖鸡胚，用超精细尖镊的一端轻轻将性腺刮离，转移到事先准备的预热30μl的pbs液滴中洗涤，重复洗涤两次后，以1对性腺为一组，移入装有20μl0.05％的胰酶(含有0.53mmedta)的500μl的离心管中，37℃水浴消化8分钟，用200μl含10％fbs的dmem/f12终止消化，并轻轻吹打至性腺组织块成为细胞悬液。细胞悬液内含有一定量的原始生殖细胞。
<3>原始生殖细胞的纯化
转移细胞悬液到24孔板中，37℃，5％co2培养4h，此时大部分体细胞已经贴壁，收集未贴壁细胞到15ml的培养皿中，每5对性腺为一组。用原始生殖细胞培养液重悬细胞，转移到30mm的细胞培养皿中，培养皿上已铺好饲养层，已提前30min放到饲养层上的cultureinsert中。
<4>原始生殖细胞细胞的原代培养
用优化的原始生殖细胞培养液培养，每2d进行半量换液，每4-5d更换mef饲养层。原始生殖细胞培养至第4-6天时，增殖速率开始加快，应注意观察。mef饲养层提前用15g/ml的丝裂霉素c处理2h，处理完成后24h才可使用。
其中，优化的培养液组成为ko-dmem(gibico，10829-018)，0.2％鸡血清(gibico，c5404)，1％胎牛血清(hyclone，sh30070.03)，1.2mm丙酮酸钠(thermfisher，11360070)，100ug/ml肝素钠(sigma，h3149-100ku)，1xantibiotic-antimycotic(thermfisher，152470-062)，1xglutamax(thermfisher，35050)，1xgsnucleosidesupplement(milipore，gss-10166-c)，0.1mmb-巯基乙醇(sigma)，4ng/mlhfgfb(r&d，233-fb)，1xneaa(gibigo，11140-050)，1xb-27vitamina(thermofisher，17504044)，25ng/mlhumanactivina(peprotech，120-14e)。
<5>原始生殖细胞细胞系的建立
将以上培养的原始生殖细胞在培养至第8d时，更换cultureinsert(milipore)，以1∶2到1∶3的比例传代到新的含有mef饲养层的培养基中，每1-2d进行半量换液。
当培养时间到达12-14d时，所有品种鸡细胞扩增总数目均达到106数量级，并可进行持续传代培养超过30d。
<6>原始生殖细胞的免疫荧光染色鉴定
取约1x104细胞进行抹涂固定在破片上，用4％多聚甲醛进行固定，之后用免疫细胞化学染色方法对原始生殖细胞进行sseal的染色分析，观察结果。可见分离得到的原始生殖细胞的细胞膜中表达ssea1原始生殖细胞特异性标记，细胞核为dapi染色。
<7>原始生殖细胞的性腺迁移能力鉴定
以绿色荧光蛋白标记病毒转染原代原始生殖细胞，经嘌呤筛选后得到纯化的细胞系，进行鸡胚注射。鸡胚注射按照如下步骤进行：取1x104原始生殖细胞重悬于50μl的培养液中，用直径为30μl的玻璃针吸取细胞并注射到孵化53h鸡胚的心脏中。注射后第六天解剖鸡胚，观察性腺中荧光细胞的数目。从我们提供的图片可以看出，经过建系培养并转染绿色荧光标记的原始生殖细胞具有成功迁移到性腺中的能力。
图5显示了鸡原始生殖细胞进行egfp慢病毒转导后的pgc细胞系，图6显示了鸡原始生殖细胞性腺迁移能力的鉴定结果。