本发明涉及一种番石榴炭疽病菌环介导等温扩增检测引物及其检测方法和应用，专用于番石榴炭疽病菌的快速分子检测，同时可实现田间番石榴炭疽病菌的早期诊断和病菌的监测和鉴定，属于农作物病害检测、鉴定、防治及生物技术领域。
背景技术：
番石榴属于桃金娘科果树，在我国有300多年的栽培历史，是我国重要的热带亚热带水果之一。番石榴炭疽病是由胶孢炭疽菌(colletotrichumgloeosporioidespenz.)侵染引起的一种真菌病害，是为害番石榴的一种重要病害。胶孢炭疽菌是炭疽菌的一个复合种，本发明人研究发现造成番石榴炭疽病的主要病原为果生刺盘孢菌(colletotrichumfructicola)。番石榴炭疽病主要为害番石榴果实、树枝梢、嫩叶，成熟果实及储藏期果实尤其易受其为害，可导致果实腐烂。果实近成熟时发病，果面病斑显著凹陷，潮湿时同心环上会出现桔红色小粒点，病斑逐渐扩大，乃至整个果实。新梢被感染后，新梢和叶尖叶缘枯焦，枝条变褐枯死。番石榴炭疽病初发期是病害防治的最佳时期，而在其病害初发期与番石榴焦腐病症状相似，以症状为基础的病害常规诊断技术，需要采用柯赫氏法则经过病原菌分离培养、病原菌鉴定、接菌、症状分析等步骤，耗时长、效率低、准确性差，难以做到病害发生时及时检测和有效控制病原菌的传播和病害流行，难以满足番石榴炭疽病诊断的实际需要。因此，建立一种快速、灵敏的检测方法用于番石榴炭疽病的早期诊断，为病害的最佳防治时期提供技术支撑，同时防治病害的传播具有重要意义。
近年来，分子生物学技术发展迅速，随着分子生物学技术在植物病理学科不断发展和应用，一些分子标记技术为植物病原菌的诊断检测提供了新的途径，pcr(polymerasechainreaction)技术以特异性强、灵敏度高、方便快捷等特点被用于植物病原菌的诊断，但其需要昂贵的仪器设备，难以在基层部门实现快速、准确的检测。环介导等温扩增(loop-mediatedisothermalamplification,lamp)技术是由日本科学家notomi等开发的一种简便、快速、准确、高效的核酸恒温扩增方法。该技术在等温条件下短时间内实现大量扩增，30min-60min内实现109-1010倍的扩增，具有很高的灵敏性和特异性，且操作简便，检测结果可肉眼判断。相比pcr技术，环介导等温扩增技术全程恒温反应，无需pcr仪，且扩增量大、灵敏度高。
技术实现要素：
针对现有技术中对番石榴炭疽病菌的检测和鉴定程序繁琐、耗时长、对鉴定经验要求高、准确度低，pcr检测需要依靠扩增仪等设备的问题，本发明提供了一种番石榴炭疽病菌环介导等温扩增检测引物及简便、快捷、灵敏、特异的可视化检测方法。
本发明的目的通过如下技术方案实现：
一种番石榴炭疽病菌环介导等温扩增检测引物，所述番石榴炭疽病菌环介导等温扩增检测引物包括正向外引物f3、反向外引物b3、正向内引物fip和反向内引物bip，各引物的核苷酸序列为：
f3：5’-tctccttcaagcagaacagc-3’；
b3：5’-ccgcgaacaagagcactg-3’；
fip:5’-acccaggtcggcatgacgat-gggctgctgcttaggaac-3’；
bip:5’-ttcgtaaatgtgggcggtgaca-tgtgtaccaggagggtatcg-3’。
一种番石榴炭疽病菌环介导等温扩增检测方法，利用正向外引物f3：5’-tctccttcaagcagaacagc-3’、反向外引物b3：5’-ccgcgaacaagagcactg-3’、正向内引物fip：5’-acccaggtcggcatgacgat-gggctgctgcttaggaac-3’以及反向内引物bip：5’-ttcgtaaatgtgggcggtgaca-tgtgtaccaggagggtatcg-3’进行环介导等温扩增反应。
较之现有技术而言，本发明的优点在于：
1.特异性强、准确性高：本发明是在番石榴炭疽病菌几丁质合酶(chitinsynthase,chs)基因中选取了6个特定区域设计了对番石榴炭疽病菌具有特异扩增作用的4条环介导等温扩增引物。已经对不同地理来源的番石榴炭疽病菌(colletotrichumfructicola)、番石榴焦腐病菌(botryosphaeriarhodina)、番石榴茎点霉果腐病菌(phomapsidii)、番石榴褐斑病菌(phomopsispsidii)、大豆炭疽病菌(colletotrichumtruncatum)、百香果炭疽病菌(colletotrichumbrevisporum)、携带番石榴炭疽病菌的植物组织和健康的番石榴组织进行了检测验证，只有番石榴炭疽病菌和携带该病菌的组织呈现阳性，说明本发明所设计的引物及检测方法用于检测番石榴炭疽病菌准确可靠，能有效区分发生在番石榴上症状特征相似的病害；
2.灵敏度高：环介导等温扩增对番石榴炭疽病菌的检测灵敏度在dna水平上可达100fg，具有很高的灵敏度；
3.适用性广、实用性好：本发明的番石榴炭疽病菌的检测方法，不仅能对病菌菌丝体进行检测，也能对感病的番石榴组织进行检测，可实现番石榴炭疽病菌的早期检测，即在病害显症前进行检测，防止病害的爆发流行。
4.操作简便快速：环介导等温扩增是在等温条件下进行，只需一个恒温水浴锅即可，结果可视化，一般整个检测过程可在1.5小时内完成，操作简便快捷。
附图说明
图1为本发明环介导等温扩增检测方法对番石榴炭疽病菌的特异性检测结果：上图为琼脂糖凝胶电泳检测结果，下图为可视化显色结果。上图中泳道m为5000bpdnamarker，泳道1-泳道3为番石榴炭疽病菌，泳道4为阳性对照，泳道5-10分别为：番石榴焦腐病菌(botryosphaeriarhodina)、番石榴茎点霉果腐病菌(phomapsidii)、番石榴褐斑病菌(phomopsispsidii)、大豆炭疽病菌(colletotrichumtruncatum)、百香果炭疽病菌(colletotrichumbrevisporum)、阴性对照；下图可视化显色结果中1-4显示绿色荧光，其他不显示绿色荧光。
图2为本发明环介导等温扩增检测方法对番石榴炭疽病菌的灵敏性检测结果：上图为琼脂糖凝胶电泳检测结果，下图为可视化显色结果。上图中泳道m为5000bpdnamarker，泳道1为阳性对照，泳道2-泳道9的模板dna浓度分别为：10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg、1fg、泳道10-泳道11为阴性对照；下图可视化显色结果中1-7显示绿色荧光，其他不显示绿色荧光。
图3为本发明环介导等温扩增检测方法对番石榴发病组织实用性检测结果，上图为琼脂糖凝胶电泳检测结果，下图为可视化显色结果。上图中泳道m为2000bpdnamarker，泳道1-泳道6分别为番石榴炭疽病菌、自然发生炭疽病的番石榴组织、人工接种番石榴炭疽病菌发病的番石榴组织、健康番石榴组织、阳性对照、阴性对照；下图可视化显色结果中1-3、5显示绿色荧光，其他不显示绿色荧光。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明。
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的试验材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1番石榴炭疽病菌环介导等温扩增引物设计
根据番石榴炭疽病菌几丁质合酶(chitinsynthase,chs)基因设计对番石榴炭疽病菌具有特异扩增作用的环介导等温扩增检测引物，包括2条外引物(f3和b3)和2条内引物(fip和bip)，其核苷酸序列分别为：
f3：5’-tctccttcaagcagaacagc-3’；
b3：5’-ccgcgaacaagagcactg-3’；
fip:5’-acccaggtcggcatgacgat-gggctgctgcttaggaac-3’；
bip:5’-ttcgtaaatgtgggcggtgaca-tgtgtaccaggagggtatcg-3’。
实施例2番石榴炭疽病菌环介导等温扩增检测方法的建立
1.待测样品dna的提取：
①用于检测病原菌纯培养物时，采用ctab法提取供试菌株基因组dna，具体步骤如下：
(1)取0.1g菌丝粉于1.5ml离心管中，加入900μl2wt.％ctab提取液，使用振荡器振荡混匀，60℃水浴60min，室温条件下，12000r/min离心15min；
(2)取上清液700μl，加等体积酚、氯仿、异戊醇混合液(各体积比为25:24:1)，温和摇动，室温条件下，8000r/min离心10min；
(3)取上清液500μl，加入等体积氯仿再抽提一次，室温条件下，8000r/min离心10min；
(4)取上清液350μl，加入1/10体积3mol/lnaac和2倍体积无水乙醇，-20℃沉淀60min，4℃条件下，8000r/min离心5min；
(5)弃去上清液，加入700μl体积浓度为70％冰乙醇，轻摇10sec，4℃条件下，8000r/min离心10sec，晾干，加入50μlte缓冲液，-20℃保存备用。
②用于检测番石榴植株组织是否存在番石榴炭疽病菌时，采用naoh快速裂解法提取番石榴植株组织基因组dna，具体步骤如下：
a.称取待检测的植物组织0.1g，加入0.5mol/lnaoh30μl，将组织充分磨碎成糊；
b.将糊状组织转入1.5ml离心管中，12000r/min离心6min，取上清液5μl；
c.上清液中加入495μl0.1mol/ltris-hcl(ph＝8.0)，混合均匀，取1.0μl作为pcr模板进行扩增；
2.以提取待测样品dna为模板进行环介导等温扩增：环介导等温扩增反应体系25μl，反应体系包括0.2mmol/lf3，0.2mmol/lb3，1.6mmol/lfip，1.6mmol/lbip，bstdna聚合酶为8u，dna模板50～100ng，12.5μl的环介导等温扩增反应混合液(40mmtris-hcl，20mm(nh4)2so4，20mmkcl，16mmmgso4，1.6mol/l甜菜碱，2.0mmdntps，0.2％trionx-100)，用无菌的超纯水补足25μl。环介导等温扩增反应条件为63-65℃温育45-60min，85℃灭活5-10min。
3.环介导等温扩增反应结果测定：采用荧光染料目测观察法或琼脂糖凝胶电泳法。所述的荧光染料目测观察法：待环介导等温扩增反应结束后，在环介导等温扩增反应的扩增产物中加入荧光染料显色剂sybrgreeni1.0μl，显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性，存在番石榴炭疽病菌；橙色或橘黄色判断为阴性，不存在番石榴炭疽病菌。所述的琼脂糖凝胶电泳法：取2.0μl环介导等温扩增产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测，如出现梯形条带判断为阳性，存在番石榴炭疽病菌；没有出现条带则判断为阴性，不存在番石榴炭疽病菌。
实施例3番石榴炭疽病菌环介导等温扩增检测特异性测定
1.采用ctab法提取3株不同来源的番石榴炭疽病菌、番石榴焦腐病菌(botryosphaeriarhodina)、番石榴茎点霉果腐病菌(phomapsidii)、番石榴褐斑病菌(phomopsispsidii)、大豆炭疽病菌(colletotrichumtruncatum)、百香果炭疽病菌(colletotrichumbrevisporum)的基因组dna。
2.以提取供试菌的dna为模板进行环介导等温扩增：环介导等温扩增反应体系25μl，反应体系包括0.2mmol/lf3，0.2mmol/lb3，1.6mmol/lfip，1.6mmol/lbip，bstdna聚合酶为8u，dna模板50～100ng，12.5μl的环介导等温扩增反应混合液(40mmtris-hcl，20mm(nh4)2so4，20mmkcl，16mmmgso4，1.6mol/l甜菜碱，2.0mmdntps，0.2％trionx-100)，用无菌的超纯水补足25μl。环介导等温扩增反应条件为63-65℃温育45-60min，85℃灭活5-10min。
3.环介导等温扩增反应结果测定：采用荧光染料目测观察法或琼脂糖凝胶电泳法。所述的荧光染料目测观察法：待扩增反应结束后，在环介导等温扩增反应的扩增产物中加入荧光染料显色剂sybrgreeni1.0μl，显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性，存在番石榴炭疽病菌；橙色或橘黄色判断为阴性，不存在番石榴炭疽病菌。所述的琼脂糖凝胶电泳法：取2.0μl环介导等温扩增产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测，如出现梯形条带判断为阳性，存在番石榴炭疽病菌；没有出现条带则判断为阴性，不存在番石榴炭疽病菌。
4.特异性验证结果
如图1所示，3株番石榴炭疽病菌显色结果可观察到绿色荧光，琼脂糖凝胶电泳出现环介导等温扩增特征性梯形条带，而供试其它作物病原菌和阴性对照显色结果为橙色，琼脂糖凝胶电泳未出现环介导等温扩增特征性梯形条带，表明本发明的环介导等温扩增引物可以将番石榴炭疽病菌与其他病原菌区分开来，具有很强的特异性，本发明的检测方法可用于番石榴炭疽病菌的特异性检测和鉴定。
实施例4番石榴炭疽病菌环介导等温扩增检测灵敏性测定
1.采用ctab法提取番石榴炭疽病菌的基因组dna；
2.将提取的番石榴炭疽病菌的基因组dna，经分光光度计测定浓度后，用无菌超纯水稀释，配制成系列浓度，备用；
3.以配制的成系列浓度dna为模板进行常规环介导等温扩增：环介导等温扩增反应体系25μl，反应体系包括0.2mmol/lf3，0.2mmol/lb3，1.6mmol/lfip，1.6mmol/lbip，bstdna聚合酶为8u，dna模板1fg～10ng，12.5μl的环介导等温扩增反应混合液(40mmtris-hcl，20mm(nh4)2so4，20mmkcl，16mmmgso4，1.6mol/l甜菜碱，2.0mmdntps，0.2％trionx-100)，用无菌的超纯水补足25μl。环介导等温扩增反应条件为63-65℃温育45-60min，85℃灭活5-10min。
4.环介导等温扩增反应结果测定：采用荧光染料目测观察法或琼脂糖凝胶电泳法。所述的荧光染料目测观察法：待扩增反应结束后，在环介导等温扩增反应的扩增产物中加入荧光染料显色剂sybrgreeni1.0μl，显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性，存在番石榴炭疽病菌；橙色或橘黄色判断为阴性，未检测到番石榴炭疽病菌。所述的琼脂糖凝胶电泳法：取2.0μl环介导等温扩增产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测，如出现梯形条带判断为阳性，存在番石榴炭疽病菌；没有出现条带则判断为阴性，未检测到番石榴炭疽病菌。
5.检测结果
如图2所示，显色结果可观察到绿色荧光，琼脂糖凝胶电泳出现环介导等温扩增特征性的梯形带，检测灵敏度可达100fg。
实施例5发病番石榴植株中番石榴炭疽病菌的环介导等温扩增检测
1.采用ctab法提取番石榴炭疽病菌基因组dna；采用naoh快速裂解法提取番石榴植株组织基因组dna。
2.以提取供试样品的dna为模板进行环介导等温扩增：环介导等温扩增反应体系25μl，反应体系包括0.2mmol/lf3，0.2mmol/lb3，1.6mmol/lfip，1.6mmol/lbip，bstdna聚合酶为8u，dna模板50～100ng，12.5μl的环介导等温扩增反应混合液(40mmtris-hcl，20mm(nh4)2so4，20mmkcl，16mmmgso4，1.6mol/l甜菜碱，2.0mmdntps，0.2％trionx-100)，用无菌的超纯水补足25μl。环介导等温扩增反应条件为63-65℃温育45-60min，85℃灭活5-10min。
3.环介导等温扩增反应结果测定：采用荧光染料目测观察法或琼脂糖凝胶电泳法。所述的荧光染料目测观察法：待扩增反应结束后，在环介导等温扩增反应的扩增产物中加入荧光染料显色剂sybrgreeni1.0μl，显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性，存在番石榴炭疽病菌；橙色或橘黄色判断为阴性，不存在番石榴炭疽病菌。所述的琼脂糖凝胶电泳法：取2.0μl环介导等温扩增产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测，如出现梯形条带判断为阳性，存在番石榴炭疽病菌；没有出现条带则判断为阴性，不存在番石榴炭疽病菌。
4.检测结果
如图3所示，番石榴炭疽病菌、番石榴炭疽病自然发病的番石榴组织、人工接种番石榴炭疽病菌发病的番石榴组织、阳性对照显色结果可观察到绿色荧光，琼脂糖凝胶电泳出现环介导等温扩增特征性的梯形带，而健康番石榴组织、阴性对照显色结果为橙色，琼脂糖凝胶电泳未出现环介导等温扩增特征性的梯形带，表明本发明环介导等温扩增引物和检测方法还可用于田间番石榴炭疽病发病植株的检测。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
序列表
<110>福建省农业科学院植物保护研究所
<120>番石榴炭疽病菌环介导等温扩增检测引物及其检测方法和应用
<160>4
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
tctccttcaagcagaacagc20
<210>2
<211>18
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
ccgcgaacaagagcactg18
<210>3
<211>38
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
acccaggtcggcatgacgatgggctgctgcttaggaac38
<210>4
<211>42
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>4
ttcgtaaatgtgggcggtgacatgtgtaccaggagggtatcg42