本发明涉及rt-pcr检测技术领域，具体是一种h9亚型禽流感病毒、鸭坦布苏病毒和鸭圆环病毒三重rt-pcr检测试剂盒。
背景技术：
禽流感是由正黏病毒科a型流感病毒属中不同亚型病毒引起的禽类感染和疾病的总称。h9亚型禽流感病毒（h9aiv）普遍呈低至中等毒力，但它分布广泛、能造成鸭的免疫抑制进而引发与其它鸭病的混合感染，产蛋鸭感染后也可引起产蛋率的明显下降，极大影响了蛋鸭的经济效益，因此它对养鸭业的危害不可忽视。
鸭坦布苏病毒（dtmuv）首先发现于2010年中国福建、浙江、江苏等东部沿海地区，并逐渐蔓延至全国大部分地区。鸭坦布苏病毒感染鸭后可导致蛋鸭产蛋量严重下降，产蛋率可从90%降至10%以内，甚至绝产；感染雏鸭后可导致雏鸭出现站立不稳、倒地不起等神经症状，进而导致雏鸭淘汰率升高，严重地高达80%，给养鸭业带来了极大的经济损失。
鸭圆环病毒（ducv）常见于鸭，鸭圆环病毒可造成鸭生长迟缓、羽毛凌乱、体重减轻等症状，可感染禽类的免疫系统，引起免疫抑制。
混合感染使得鸭疾病的诊断难度较大，不能仅通过临床表现做出诊断，须要借助于分子诊断技术。病毒的分离、琼脂扩散试验和酶联免疫吸附试验等方法均比较耗时，不利于鸭病的防治。
动物传染病确诊的传统方法主要通过病原的分离、电镜观察、血清学鉴定等方法，但该方法不利于动物疾病的早期诊断和快速控制。
分子生物学的兴起，rt-pcr技术因具有操作简便、敏感性高、特异性强和重复性好等优点已广泛应用于动物病原微生物的检测，尤其在临床若干病原混合感染的鉴别诊断上具有独特的优势和很高的实用价值。
在同一rt-pcr体系中由于存在若干模板和引物，因此，必须防止引物和模板之间的非特异性结合，以免非特性条带的出现。同时，目的片段的大小有合适的梯度和各引物退火条件尽可能相同，以确保各自扩增产物量相对平衡，条件摸索十分重要。
技术实现要素：
本发明目的在于解决上述背景技术中提出的问题，提供一种高效率、低成本、敏感性好、特异性高、快速方便的h9亚型禽流感病毒、鸭坦布苏病毒和鸭圆环病毒三重rt-pcr检测试剂盒，以及鉴定或辅助鉴定这三种病毒的引物对组。
本发明为达到上述目的，采用以下技术方案：h9亚型禽流感病毒、鸭坦布苏病毒和鸭圆环病毒三重rt-pcr引物组，包括三对特异性引物，分别是引物1和引物2、引物3和引物4、引物5和引物6，它们分别具有序列表seq.id.no.1至seq.id.no.6的碱基序列。
进一步，所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的摩尔比为（2-1）:（2-1）:（2-1）:（2-1）:（1-0.5）:（1-0.5）。
更进一步，所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的摩尔比为2:2:1:1:1:1。
上述h9亚型禽流感病毒、鸭坦布苏病毒和鸭圆环病毒三重rt-pcr引物组在pcr扩增方面的应用，所述pcr扩增的退火温度为50.2-60℃。
进一步，所述pcr扩增的退火温度为53.4℃。
h9亚型禽流感病毒、鸭坦布苏病毒和鸭圆环病毒三重rt-pcr检测试剂盒，包括检测h9亚型禽流感病毒、鸭坦布苏病毒和鸭圆环病毒的pcr试剂、one-steprt-pcr试剂盒、阳性对照液和阴性对照液。
进一步，所述pcr试剂包括由h9aiv上下游引物、dtmuv上下游引物和ducv上下游引物组成的pcr引物组；
所述h9aiv上下游引物分别是所述引物1和所述引物2；
所述pcr引物组中的引物1在所述pcr试剂中的终浓度具体为2μmol/l；
所述pcr引物组中的引物2在所述pcr试剂中的终浓度具体为2μmol/l；
所述dtmuv上下游引物分别是所述引物3和所述引物4；
所述pcr引物组中的引物3在所述pcr试剂中的终浓度具体为1μmol/l；
所述pcr引物组中的引物4在所述pcr试剂中的终浓度具体为1μmol/l；
所述ducv上下游引物分别是所述引物5和所述引物6；
所述pcr引物组中的引物5在所述pcr试剂中的终浓度具体为1μmol/l；
所述pcr引物组中的引物6在所述pcr试剂中的终浓度具体为1μmol/l；
所述one-steprt-pcr试剂盒包括2×one-stepreactionmix、transscriptone-stepemzymemix和ddh2o；
所述阳性对照液是h9亚型禽流感病毒cdna、鸭坦布苏病毒cdna和鸭圆环病毒dna；
所述阴性对照液是ddh2o。
上述的h9亚型禽流感病毒、鸭坦布苏病毒和鸭圆环病毒三重rt-pcr检测试剂盒在pcr扩增方面的应用，所述pcr扩增的退火温度为50.2-60℃。
进一步，所述pcr扩增的退火温度为53.4℃。
与现有技术相比，本发明的优点和产生积极效果是：
本发明针对目前缺乏对h9亚型禽流感病毒、鸭坦布苏病毒和鸭圆环病毒同时进行检测和诊断的有效可靠的技术，发明人研究设计了三对特异性引物，据此建立了h9亚型禽流感病毒、鸭坦布苏病毒和鸭圆环病毒的三重rt-pcr检测方法，并制备了相应的检测试剂盒；本发明具有高效率、低成本、敏感性好、特异性高、快速方便等优点，本发明在引物设计上利用扩增片段长度的不同直接判定扩增结果，使得该方法在结果判定时更简便、直观和实用；应用本发明可同时检测和鉴别h9亚型禽流感病毒鸭坦布苏病毒和鸭圆环病毒的病原体，用于h9亚型禽流感病毒感染造成的免疫力减低导致的鸭坦布苏病毒和的鸭圆环病毒混合感染；本发明最低能同时检出1pgh9亚型禽流感病毒rna、50pg鸭坦布苏病毒rna和10ng鸭圆环病毒dna，为三种病毒的发病早期提供了准确的检测方法，对及时切断其传播具有重要意义，对鸭养殖业可持续发展有着重要的现实意义，具有广阔的应用前景，在临床应用中，可同时减少时间的成本和污染，具有十分重要的实用价值和实践意义。
附图说明
图1为三重rt-pcr反应条件优化成功的试验图，图中：m为分子量标准100bpdnaladder，1为h9aiv、dtmuv和ducv；2为h9aiv；3为dtmuv；4为ducv。
图2为三重rt-pcr敏感性试验结果电泳图，图中：m为分子量标准100bpdnaladder，1为50ngh9aiv、50ngdtmuv和50ngducv；2为10ngh9aiv、10ngdtmuv和10ngducv；3为100pgh9aiv、100pgdtmuv和100pgducv；4为50pgh9aiv、50pgdtmuv和50pgducv；5为10pgh9aiv、10pgdtmuv和10pgducv；6为1pgh9aiv、1pgdtmuv和1pgducv；7为阴性对照（ddh2o）。
图3为三重rt-pcr特异性试验结果电泳图，图中：m为分子量标准100bpdnaladder，1为h9aivrna，2为dtmuvrna，3为ducvdna，4为h9aivrna和dtmuvrna的混合样品（浓度比2:1），5为dtmuvrna和ducvrna的混合样品（浓度比1:1），6为h9aivrna和ducvrna的混合样品（浓度比2:1），7为h9aivrna、dtmuvrna和ducvrna的混合样品（浓度比2:1:1），8为h5亚型禽流感病毒rna；9为h7亚型禽流感病毒rna，10为番鸭细小病毒rna，11为鸭瘟病毒dna，12为鸭副黏病毒rna，13为鸭肝炎病毒rna，14为减蛋综合征病毒dna，15为阴性对照（ddh2o）。
图4为三重rt-pcr部分临床样品检测结果电泳图，图中：m为分子量标准100bpdnaladder，1为阳性对照（h9亚型禽流感病毒cdna、鸭坦布苏病毒cdna和鸭圆环病毒dna），2-15分别为部分有目的条带的临床样品检测结果。
具体实施方式
以下实施例中所使用的实验方法如没有特殊说明，均采用常规方法；所用的材料、试剂等，如没有特殊说明，均可从商业途径得到。具体的所用材料和试剂如下：
h9亚型禽流感病毒（h9aiv）、鸭坦布苏病毒（dtmuv）和鸭圆环病毒（ducv）、h7亚型禽流感病毒（h7aiv）、番鸭细小病毒（mpv）、鸭瘟病毒（dpv）、鸭副黏病毒（ndv）、鸭肝炎病毒（dhv）和减蛋综合征病毒（eds）均由福建省农业科学院畜牧兽医研究所禽病研究室提供。
病毒rna/dna快速纯化试剂盒和one-steprt-pcr试剂盒均购自北京全式金生物科技有限公司，pmd-18t购自大连宝生物工程有限公司，胶回收试剂盒购自广州东盛生物科技有限公司；美国bio-rad公司生产的c1000pcr仪器、德国hermle公司生产的低温高速离心机等。
实施例1、引物的设计与合成
根据现有公开的h9亚型禽流感病毒（h9aiv）、鸭坦布苏病毒（dtmuv）和鸭圆环病毒（ducv）的基因保守序列，通过blast验证，设计并合成了三对特异性引物（表1）。
表1鉴定h9aiv、dtmuv和ducv的引物序列
实施例2、三重rt-pcr鉴定h9亚型禽流感病毒（h9aiv）、鸭坦布苏病毒（dtmuv）和鸭圆环病毒（ducv）
步骤一、三重rt-pcr体系的建立
（1）待测样品的制备
根据病毒rna/dna快速纯化试剂盒说明书，提取h9亚型禽流感病毒rna、鸭坦布苏病毒rna和鸭圆环病毒dna。参照sambrook方法测定核酸的浓度和纯度，保存于-70℃备用。
（2）三重rt-pcr反应条件的优化
使用onesteprt-pcr试剂盒采用一步法进行rt-pcr。对rt-pcr各循环参数和各引物浓度等进行优化，以确定最佳的rt-pcr模式。
通过对rt-pcr的引物浓度、各反应温度、时间及循环次数等进行优化，最后确定rt-pcr中h9aiv-f和h9aiv-r引物的最佳工作终浓度均为2μmol/l，dtmuv-f和dtmuv-r引物的最佳工作终浓度均为1μmol/l，ducv-f和ducv-r引物的最佳工作终浓度均为1μmol/l。
反应体系（50μl）：primescript1stepenzymemix2μl，2×1stepbuffer25μl，终浓度均为2μmol/l的h9aiv-f和h9aiv-r引物，终浓度均为1μmol/l的dtmuv-f和dtmuv-r引物，以及终浓度均为1μmol/l的ducv-f和ducv-r引物，h9aiv、dtmuv和ducv共4μl（体积为2:1:1）作为混合模板，以无rnase的dh2o补足50μl。
rt-pcr的最佳反应模式为50℃反转录30min，95℃变性3min，然后进入94℃变性50s，53.4℃退火50s，70℃延伸50s的循环，共进行30次循环，最后再经70℃延伸10min后，于4℃结束反应。
步骤二、三重rt-pcr的敏感性试验
将步骤一（1）中制备得到的样品作为h9亚型禽流感病毒、鸭坦布苏病毒和鸭圆环病毒模板的rna，加适量到同试管中并用ddh2o调整使其终浓度一致，然后进行10倍比梯度稀释，按照步骤一（2）中优化后的pcr反应条件进行扩增，检测其敏感性；同时设置以ddh2o代替等量模板的阴性对照。
反应结束后，取50μlrt-pcr产物与5μl溴酚兰混合，在10g/l琼脂糖凝胶中电泳，经溴化乙锭染色后，在紫外光下观察拍照，与dna标准分子量作比较，分析并记录结果。在紫外灯下用刀片切割所需的片段，然后用dna片断胶回收试剂盒纯化回收。取适量纯化回收的pcr产物，与pmd-18t（来自pme-18t试剂盒）于16℃连接4小时，转化dh5α大肠埃希氏菌。挑取在含氨苄青霉素的选择培养基上长出的白色菌落37℃培养，用pcr方法进行快速鉴定，阳性克隆菌送大连宝生生物技术有限公司进行测序，测序结果进行blast比对分析。
琼脂糖凝胶电泳结果如图2所示，该三重rt-pcr最低能检出1pgh9亚型禽流感病毒rna、50pg鸭坦布苏病毒rna和10ng鸭圆环病毒rna。最低检测线以上各浓度的模板中h9亚型禽流感病毒均扩增得到大小约为732bp的条带，鸭坦布苏病毒均扩增得到大小约为419bp的条带，鸭圆环病毒均扩增得到大小约为245bp的条带，且测序结果进一步证实了h9亚型禽流感病毒、鸭坦布苏病毒和鸭圆环病毒rt-pcr扩增产物，大小分别为732bp、419bp和245bp，与实验设计大小相符，并且pcr产物的核酸序列与引物设计模板的基因对应片段的同源性一致。以上结果表明，利用该三重rt-pcr同时检测h9亚型禽流感病毒、鸭坦布苏病毒和鸭圆环病毒具有较高的灵敏度。
步骤三、三重rt-pcr的特异性试验
（1）待测样品的制备
根据病毒rna/dna快速纯化试剂盒说明书，提取h9aivrna，dtmuvrna、ducvrna、h5aivrna、h7aivrna、mpvrna、dpvdna、ndvrna、dhvrna、edsdna。参照sambrook方法测定核酸的浓度和纯度，保存于-70℃备用。
（2）三重rt-pcr扩增
按照步骤一（2）中优化后的pcr反应条件进行扩增，不同的是模板分别如下：h9aivrna，dtmuvrna，ducvdna，h9aivrna和dtmuvrna的混合样品（浓度比2:1），dtmuvrna和ducvrna的混合样品（浓度比1:1），h9aivrna和ducvrna的混合样品（浓度比2:1），h9aivrna、dtmuvrna和ducvrna的混合样品（浓度比2:1:1），h5aivrna；h7aivrna，mpvrna，dpvdna，ndvrna，dhvrna，edsdna，阴性对照（ddh2o）。
反应结束后，取50μlrt-pcr产物与5μl溴酚兰混合，在10g/l琼脂糖凝胶中电泳，经溴化乙锭染色后，在紫外光下观察拍照，与dna标准分子量作比较，分析并记录结果。在紫外灯下用刀片切割所需的片段，然后用dna片断胶回收试剂盒纯化回收。取适量纯化回收的pcr产物，与pmd-18t（来自pme-18t试剂盒）于16℃连接4小时，转化dh5α大肠埃希氏菌。挑取在含氨苄青霉素的选择培养基上长出的白色菌落37℃培养，用pcr方法进行快速鉴定，阳性克隆菌送大连宝生生物技术有限公司进行测序，测序结果进行blast比对分析。
琼脂糖凝胶电泳结果如图3所示，所有含有h9aiv、dtmuv和ducv核酸模板的样品均能扩增出与试验设计大小相符的扩增条带，即h9aiv扩增得到大小约为732bp的目的条带，dtmuv扩增得到大小约为419bp的目的条带，ducv扩增得到大小约为245bp的目的条带；而其它对照病原体在相同位置却无任何扩增条带。测序结果进一步证实了h9aiv、dtmuv和ducvrt-pcr扩增产物，大小分别为732bp、419bp和245bp，与实验设计大小相符，且pcr产物的核酸序列与引物设计模板的基因对应片段的同源性一致。这一结果表明利用该三重rt-pcr检测h9aiv、dtmuv和ducv具有较强的特异性。
实施例3、检测试剂盒的组装
根据实施例1和2的研究结果，组装检测试剂盒以方便使用。
h9亚型禽流感病毒、鸭坦布苏病毒和鸭圆环病毒三重rt-pcr检测试剂盒，包括检测h9亚型禽流感病毒、鸭坦布苏病毒和鸭圆环病毒的pcr试剂、one-steprt-pcr试剂盒、阳性对照液和阴性对照液。
所述pcr试剂包括由h9aiv上下游引物、dtmuv上下游引物和ducv上下游引物组成的pcr引物组；
所述h9aiv上下游引物分别是所述引物1和所述引物2；
所述dtmuv上下游引物分别是所述引物3和所述引物4；
所述ducv上下游引物分别是所述引物5和所述引物6；
所述one-steprt-pcr试剂盒包括2×one-stepreactionmix（含6种dntp、rt反应缓冲液组成和pcr反应缓冲液组成）、transscriptone-stepemzymemix（含反转录酶和pcrtaq酶）和ddh2o；
所述阳性对照液是h9亚型禽流感病毒cdna、鸭坦布苏病毒cdna和鸭圆环病毒dna；所述阴性对照液是ddh2o。
实施例4、三重rt-pcr检测临床样本
利用建立的三重rt-pcr方法，对2016～2017江西、福建、河南、安徽地区鸭群收集的250份临床样品进行检测，检出h9aiv病毒感染13份（感染率为6.28%），鸭坦布苏病毒感染7份（感染率为2.80%），鸭圆环病毒感染12份（感染率为5.04%），其中h9aiv病毒和鸭圆环病毒混合感染2例，部分扩增结果如图4所示。
利用常规pcr方法，对2016～2017江西、福建、河南、安徽地区鸭群收集的250份临床样品进行检测，结果与三重rt-pcr检测结果对比，两者的符合率100%。
因此，本发明的引物组、试剂盒及由此建立的检测方法可用于鉴定待测样本是否感染h9亚型禽流感病毒、鸭坦布苏病毒和鸭圆环病毒：若得到732bp的片段，则待测样本中含有h9亚型禽流感病毒，反之则没有；若得到419bp的片段，则待测样本中含有鸭坦布苏病毒，反之则没有；若得到245bp的片段，则待测样本中含有鸭圆环病毒，反之则没有。
上述实施例仅是本发明的较优实施方式，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修饰、修改及替代变化，均属于本发明技术方案的范围内。
序列表
<110>江西省农业科学院畜牧兽医研究所,福建省农业科学院畜牧兽医研究所
<120>h9亚型禽流感、鸭坦布苏和鸭圆环病毒三重rt-pcr检测试剂盒
<160>6
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>23
<212>dna
<213>人工序列()
<400>1
tcaacaaactccaccgaaactgt23
<210>2
<211>24
<212>dna
<213>人工序列()
<400>2
tcccgtaagaacatgtccatacca24
<210>3
<211>18
<212>dna
<213>人工序列()
<400>3
agcaatcaggaaagcaga18
<210>4
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<212>dna
<213>人工序列()
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cccacagcagtcaaagc17
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<213>人工序列()
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atttcccgccaaaaca16
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<212>dna
<213>人工序列()
<400>6
gacaaatcaaactcacttctatacc25