本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种分子标记,特别是涉及一种与谷子抗咪唑乙烟酸除草剂基因紧密连锁的分子标记。本发明还涉及扩增该分子标记的引物、该分子标记和引物在谷子抗咪唑乙烟酸除草剂基因定位或谷子遗传育种中的用途。
背景技术：
在我国谷子是特色抗旱作物，种子萌发只需要占其重量26％的水分，而高粱、小麦和玉米的种子萌发分别需要其重量的40％、45％和48％的水分，同时谷子对低土壤肥力的忍耐力较高，但目前谷子种植面积不断缩减。谷子抗除草剂品种在生产上应用较少，谷子种植需要人工除草，这一直是阻碍谷子产业化发展的主要因素之一。
培育抗除草剂的谷子新品种是实现谷子规模化和机械化种植的重要基础。谷子的抗除草剂基因来源于狗尾草突变，主要有两类，一类是抗拿捕净；一类是抗咪唑乙烟酸。然而，目前生产上缺乏抗除草剂的品种，特别是抗广谱除草剂咪唑乙烟酸的品种。
华大基因早在2009年已共同启动对谷子基因组学研究项目，并于2011年完成了阶段性研究，其成果于2012年5月在国际著名杂志《自然-生物技术》(naturebiotechnology)上在线发表。谷子基因组序列的组装完成为分子标记开发提供了基础，遗传图谱的绘制以及重要性状的qtl定位是谷子分子标记辅助育种的前提。因此，迫切需要发现与谷子抗除草剂基因紧密连锁的分子标记。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种与谷子抗咪唑乙烟酸除草剂基因紧密连锁的分子标记。
本发明的另一目的是提供一种可用于pcr扩增与谷子抗咪唑乙烟酸除草剂基因紧密连锁的分子标记的引物对，以及由该引物对扩增获得的分子标记。
本发明的再一目的是提供上述分子标记在谷子抗咪唑乙烟酸除草剂基因定位、检测以及谷子辅助育种中的用途以及上述分子标记的检测方法。
本发明的目的还包括提供一种包括上述分子标记的重组载体，以及含有该重组载体的重组细胞；提供一种包括使用上述分子标记的谷子抗咪唑乙烟酸除草剂基因的定位方法，和使用所述分子标记的谷子辅助育种方法。
本发明人根据谷子全基因组序列以及谷子资源的重测序数据，经过大量的数据分析和实验，提供了一种与谷子抗除草剂基因紧密连锁的分子标记sisv0163，并由此提供了下述发明：
本发明提供的一种与谷子抗除草剂基因紧密连锁的分子标记sisv0163，其核苷酸序列如seqidno.1。其中加下划线部分为引物设计区段：
caagccatgcatccatgatccagagtgtgtccaggttggcgttgttggagctcccatatagcactgtacacaaatatctgagcccaagcagagtcagcaatgacgtgtgatcgagtttcactgctgtaccttgcttgcccaacgcgagacttccacgctagacgctactaaggccatgtttagttactcccaactcccaactttgacactatgcaaaaagaagattccccatcacatcaaacttgcggtacatgcatggagtactaaatgtagatgaaattaaaaactaattgcacagttttgttgtactttgcgagacgaatcttttgagcctaattagtcaatatttggacaataattcacaaatacaaacgaaacgctacagtgtgctacagtgctgtaacagtaatttagcacccccaaattcgccaaactaaacacggcctaacaacggagagttctggttccagcatccatggtgcggcttccttagcacgggtacggttgagtcggagtcgcacgccgtagaagtttctacgtcatgtgacttcgtagatgggcgtacgaacgagtgaacgacaatttgggcagtcatgttatggttggtcg(seqidno.1)
在本发明中，术语“与谷子抗咪唑乙烟酸除草剂基因紧密连锁的分子标记”是指这样的分子标记，在遗传连锁图谱中，该分子标记与谷子抗咪唑乙烟酸除草剂基因的遗传连锁距离小于2cm或者小于3cm；或者在谷子的大于300个样本中，抗咪唑乙烟酸型或者部分抗咪唑乙烟酸型的样本中含有该分子标记。抗咪唑乙烟酸型或者部分抗咪唑乙烟酸型的确定参见后文中的描述。
在本发明中，具体的所述除草剂为咪唑乙烟酸。咪唑乙烟酸是咪唑啉酮类除草剂的典型代表，是目前世界上最重要的除草剂品种之一，也是目前使用量最大的除草剂之一，广泛用于大豆和小麦等农作物的杂草控制。抑制乙酸乳酸合成酶(acetolactate-synthase，als)活性，以阻止支链氨基酸的生物合成，导致蛋白质的合成受到阻碍，从而使植物体生长停止，最终杀死生物个体。咪唑乙烟酸是广谱除草剂，能有效防除双色高粱、西风古、小觅、曼陀罗、稗草、黍、金狗尾、绿狗尾、筒麻、反枝苋和藜等杂草。
本发明的还一方面涉及本发明的分子标记sisv0163引物对，其核苷酸序列如seqidno.2和seqidno.3所示：
sisv0163f：5’-caagccatgcatccatgatc-3’(seqidno.2)
sisv0163r：5’-cgaccaaccataacatgact-3’(seqidno.3)
本发明的分子标记也可以为含有seqidno.1所示核苷酸序列的dna片段，该dna片段的长度为适当长度，但并不特别限定，例如，小于10000bp、小于5000bpbp、小于2000bp、小于1500bp、小于1200bp、小于1000、或者小于800bp。
在本发明的一个实施方案中，所述分子标记(含有seqidno.1所示核苷酸序列的dna片段)所包含的seqidno.1的5’端和/或3’端可操作地连接有人工序列和/或控制序列，例如启动子、增强子、终止子、酶切位点、引物序列等等。其中，术语“可操作地”在本发明中定义为一种如下构象，在该构象中，控制序列例如启动子被适当地置于seqidno.1的一个位置上，以致该控制序列指导seqidno.1编码的多肽的产生。
本发明还公开了一种重组载体，其含有本发明的分子标记。所述重组载体可以是插入有本发明的分子标记的表达载体或者克隆载体。获得上述重组载体后，本领域技术人员可以理解，根据不同的需要，将重组载体转化到合适的细胞中，得到含有该重组载体的重组细胞。因此，本发明还公开了一种含有所述重组载体的重组细胞。
本发明的还一方面涉及本发明的分子标记的制备方法，包括下述步骤：使用抗咪唑乙烟酸的谷子基因组dna为模板，以上述引物进行pcr扩增，得到的扩增产物即含有所述分子标记。在本发明的一个实施方案中，所述抗咪唑乙烟酸型的谷子为6492常规谷子材料。
对本领域技术人员而言，可以理解，也可以dna化学合成的方法得到本发明的分子标记。
本发明的还一方面涉及所述分子标记的检测方法，包括下述步骤：
(1)根据本发明的分子标记的核苷酸序列设计引物；
(2)以被检测谷子的基因组dna作为模板进行扩增；
(3)判断扩增产物中是否存在该分子标记。
例如，以被检测谷子的基因组dna为模板，以上述引物(seqidno.2)和(seqidno.3)进行pcr扩增，得到扩增产物，可以将得到的扩增产物进行测序或者凝胶电泳。
本发明的还一方面涉及本发明的分子标记在谷子抗除草剂基因定位或检测中的用途。
本发明的还一方面涉及一种谷子抗除草剂基因的定位的方法，包括使用本发明的分子标记的步骤。
本发明的还一方面涉及本发明的分子标记在谷子分子辅助育种中的用途。
本发明的还一方面涉及一种谷子辅助育种方法，包括检测本发明的分子标记的步骤。
本发明的分子标记可用于今后的分子标记辅助育种中，本领域技术人员可以理解，比如通过检测是否存在本发明的分子标记来筛选抗除草剂的谷子。检测出具有本发明的分子标记的为抗咪唑乙烟酸型或者部分抗咪唑乙烟酸型，不具有该分子标记的为不抗咪唑乙烟酸型。所述检测可以是pcr检测方法，具体地可以使用上述的本发明的分子标记引物。所述检测还可以通过测序的方法进行。该谷子辅助育种方法具有快速、简便、高通量的优点。
在本发明中，具体地，所述谷子可以为6492常规谷子材料、豫谷18、以6492和豫谷18为亲本的f1代杂交种、或杂交种自交产生的f2代。其中，6492、或f1代自交产生的部分f2代(芽苗叶片正常)为抗咪唑乙烟酸型；f1代、或者f1代自交产生的部分f2代(芽苗叶片褪色)为部分抗咪唑乙烟酸型；豫谷18、f1代自交产生的部分f2代(芽苗叶片枯死)为不抗咪唑乙烟酸型。
上述抗咪唑乙烟酸型、部分抗咪唑乙烟酸型、不抗咪唑乙烟酸型是通过下述方法确定的：
配置4l15g/l的琼脂粉培养基水溶液，灭菌融化。待其温度冷却到55度左右加入5ml的咪唑乙烟酸(购自山东先达农化股份有限公司，有效成分含量5％的水剂型)，倒平皿。培养基冷却后晾干，将f2代种子置于培养基中，光照培养3天，统计芽苗叶片情况是正常，褪色，还是枯死。其中，芽苗叶片正常的为抗咪唑乙烟酸型，褪色的为部分抗咪唑乙烟酸型，枯死的为不抗咪唑乙烟酸型。
由于采用以上技术方案，使本发明具备的有益效果在于：
本发明提供了与谷子抗咪唑乙烟酸除草剂基因紧密连锁的分子标记，有利于谷子分子标记辅助育种体系的建立；所述的分子标记与抗除草剂基因的遗传紧密连锁距离为1.8cm，可以简便、快速、高通量地应用于谷子分子辅助育种。
附图说明
图1分子标记引物seqidno.2和seqidno.3对f2代300个单株扩增的部分结果。其中：泳道13代表1株不抗咪唑乙烟酸除草剂型的单株pcr扩增产物，泳道1～12、14～24代表23株抗咪唑乙烟酸型和部分抗咪唑乙烟酸型的单株pcr扩增产物。泳道m为d2000marker：其分子量包括2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp。结果显示：抗咪唑乙烟酸型和部分抗咪唑乙烟酸型的植株中条带大小为609bp，不抗咪唑乙烟酸型的植株中条带大小为375bp。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
1、谷子遗传群体的构建
选择由华大收集的抗咪唑乙烟酸除草剂的6492常规谷子材料与来自安阳农科院培育的豫谷18谷子品种作为亲本材料，杂交后鉴定获得f1(部分抗咪唑乙烟酸型)，f1自交共得到300个f2单株。对300个f2单株按照前述确定抗咪唑乙烟酸型的方法进行抗咪唑乙烟酸性状分析，发现抗咪唑乙烟酸型和部分抗咪唑乙烟酸型共224株(其中抗咪唑乙烟酸型75株，部分抗咪唑乙烟酸型149株)，不抗咪唑乙烟酸型76株。
2、父母本以及f1代、f2代个体基因组dna的提取
用ctab法分别提取父母本、f1代和上一步中获得的300个谷子f2单株的基因组dna，具体方法如下：
(1)称取1.0g新鲜叶片，剪碎放入研钵，用液氮研磨后加入3ml1.5×ctab，研磨成匀浆转入15ml的离心管中，然后往研钵中加入1ml1.5×ctab冲洗，再转入离心管中，混匀后于65℃水浴30min，期间不时缓慢摇匀。
其中1.5×ctab配方如下(1l)：15g的ctab、75ml的1mol/ltris.hcl(ph为8.0)、30ml的0.5mol/ledta、61.4g的nacl，加去离子水定容至1l，使用前加入2ml的巯基乙醇，使巯基乙醇的终浓度为0.2ml/100ml。
(2)待冷却至室温，加入等体积氯仿/异戊醇(24:1)，轻轻混匀，至下层液变为深绿色。
(3)4200rpm离心10min，将上层水相移到新的15ml离心管，加2倍体积预冷的无水乙醇，混合静止5min。于-20℃放置30min沉淀dna。
(4)4200rpm离心10min，弃掉上清，加入1ml75％乙醇洗涤沉淀1次，倒置离心管干燥dna，加入200μlte溶解dna。
(5)用0.8％的琼脂糖凝胶检测基因组dna。
(6)将得到的父母本、f1代和300个谷子f2单株的基因组dna存于-20℃备用。
3、分子标记的制备
以上述提取的亲本、f1代、或f2代中的抗咪唑乙烟酸型或部分抗咪唑乙烟酸型的基因组dna为模板，以分子标记引物(seqidno.2)和(seqidno.3)进行pcr扩增。
a.pcr反应体系：25μl体系，各组分物质的含量分别为:1μl模板dna、0.5μl引物f、0.5μl引物r、0.15μldntps、0.15μltaqdna聚合酶(活力单位0.5u)、2.5μl10×pcrbuffer、ddh2o补齐25μl，混匀，离心；
b.扩增程序：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸40秒，运行35个循环；最后72℃延伸3分钟，4℃保存；
将扩增产物纯化，得到分子标记。纯化后进行测序，结果如seqidno.1所示。
对本领域技术人员而言，可以理解，也可以通过dna化学合成的方法得到该分子标记。
4、分子标记引物的初步筛选
对父母本进行重测序(10×)，根据父母本测序数据，利用soap软件比较父母本之间的序列差异，然后基于差异的序列，在父本5’端和3’端外侧50bp位置随机选取20bp左右长度的序列，用primerpremier软件随机设计引物，一共1100对引物，下面的表1中列出了其中的部分引物的序列(seqidno.2-41)
表1:1100对随机引物中的部分引物
分别以上述提取的父母本及f1代的基因组dna为模板，以设计的1100对引物进行pcr扩增，pcr反应体系其它条件和程序与上述类似。
将pcr产物进行琼脂糖电泳检测，以检测引物的有效性和多态性。在此有效性是指是否具有扩增产物；多态性是指父母本间扩增产物的片段大小有差异。
按照如下的筛选标准进行引物的筛选：父母本及f1均有扩增产物，并且父母本扩增产物均只有一条明晰的带型且大小有差异，f1表现有父母本带型的杂合带型，即有父本和母本带型的两条带。
筛选结果：从随机设计的1100对引物中筛选出600对引物。
5、谷子f2代遗传连锁图谱的构建
利用筛选出的600对分子标记引物对f2群体的300个个体分别进行pcr检测，所用模板为上述制得的f2群体的300个个体的基因组dna，pcr体系的其它成分及pcr程序与上述相同。
对pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳，其中分子标记引物(seqidno.2)和(seqidno.3)对300个个体扩增的部分结果如图1所示。
将全部电泳结果进行数据统计分析，具体方法如下：将f2群体单株扩增条带为父本型的记为a，扩增条带为母本型的记为b，扩增条带同时含有父本型和母本型的记为h，都没有的记为-，最终得到f2群体300个个体的600对引物扩增的基因型数据。
根据300个个体的抗除草剂表型，与父本型性状相似的记为a(抗咪唑乙烟酸)，与母本型性状相似的记为b(不抗咪唑乙烟酸)，性状居于父本和母本之间的记为h(部分抗咪唑乙烟酸)，得到300个个体的表型数据，将表型数据和基因型数据进行比较，相似高则代表标记与抗除草剂(抗咪唑乙烟酸或部分抗咪唑乙烟酸)性状紧密连锁。
根据上述结果将抗除草剂(咪唑乙烟酸)基因定位在遗传连锁图谱上。
6、与谷子抗咪唑乙烟酸除草剂紧密连锁的分子标记的验证
1.在制得的遗传连锁图谱的基础上，根据与谷子抗咪唑乙烟酸除草剂基因的遗传连锁距离，在与谷子抗咪唑乙烟酸除草剂基因的遗传紧密连锁距离为1.8cm的位置确定了分子标记引物(seqidno.2和seqidno.3)，并找到对应的父本序列位置，上下游引物之间的序列即为分子标记，其核苷酸序列如seqidno.1所示。
2.在对f2代的300个个体的pcr扩增产物电泳中，分子标记引物(seqidno.2和seqidno.3)的扩增结果是：224个抗咪唑乙烟酸型和部分抗咪唑乙烟酸型的扩增产物均有609bp大小的条带，而76个不抗咪唑乙烟酸型的pcr扩增产物均有375bp的条带，并且经测序证明该609bp的核苷酸序列与seqidno.1相同。
可见，本发明的分子标记(seqidno.1)为与谷子抗咪唑乙烟酸除草剂基因紧密连锁的分子标记。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
序列表
<110>深圳华大小米产业股份有限公司
中原华大农业科技有限公司
<120>一种与谷子抗咪唑乙烟酸除草剂基因紧密连锁的分子标记sisv0163
<130>p2017-1-0170.cn
<160>41
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