本发明属于食品生物技术领域，也属于微生物鉴定和检测技术领域，涉及调味品领域，尤其是一种快速鉴定胀袋酱油中产气微生物的方法。
背景技术：
酱油是我们中华人民共和国的传统调味品，在我国的烹饪领域中有着广泛应用。近年来，酱油作为一种风味独特，营养丰富的调味品，在西方国家也颇受欢迎。随着酱油在全球范围内的认可度不断提高，产品销量也逐年上升，酱油安全问题变得更加地紧迫和重要。
酱油的酿造过程本质上是一个发酵过程，是微生物和酶分解利用原料中的蛋白质、碳水化合物等营养物质的过程。整个酱油的酿造过程并不是全封闭的，而是相对开放的环境，除了控制酱油中添加的微生物和环境中的微生物以外，其他环境方面的把控也相当重要，因此，在保障酱油安全方面就有了更多的要求和更严峻的考验。
目前，酱油产气胀袋问题作为一个普遍的行业问题，在调味品行业备受关注，很多企业就这一问题展开过研究。但是，由于不同地域，不同品牌，不同工艺的酱油存在的问题有较大差异，现有的研究基本上都是针对某一特定样品展开，针对性较强。为了解决了酱油产气和胀袋的问题，加速我国传统调味品的发展，为酱油的酿造提供更好的技术支持，迫切地需要一种全面系统的、具有普遍适用性的酱油中产气微生物的鉴定方法。
通过检索，发现如下一篇与本发明专利申请相关的专利公开文献：
酱油等调味品中产气菌检测方法(CN101348826)，该检测方法将待测的调味品样品稀释，然后接种于含有培养基的发酵管中，在36℃士1℃条件下培养48±2h后，根据发酵管的产气管数和产气特征来检测产气菌。该发明还公开了一种用于产气菌检测的培养基。该产气菌检测方法可以方便地检测酱油调味品中产气菌的存在与否，并且具有良好的特异性。
通过对比，本发明专利申请与上述专利公开文献存在如下本质的不同：
(1)本发明不仅对酱油中的产气菌进行了检测，还提供了产气菌的快速鉴定方法；
(2)本发明的产气验证培养基与原有专利不同，制备更加简便，成分更加接近酱油；
(3)本发明采用鸟式发酵管观察产气现象，不仅结果更为直观，而且产气体积可以量化；
(4)本发明在产气菌的验证阶段，将细菌、酵母和霉菌在不同温度下培养，防止了假阳性实验结果的出现。
(5)本发明在厌氧培养箱中操作，环境条件更接近酱油中的真实条件，结果更为可靠。
因此，本发明专利申请与上述专利公开文献存在本质的不同。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种胀袋酱油中产气微生物的快速鉴定方法，该方法为解决酱油企业中普遍存在的酱油胀袋问题提供了一种快速的、具有普遍适用性、且易于推广的方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种快速鉴定胀袋酱油中产气微生物的方法，所述方法在厌氧条件下，利用不同培养基对酱油中的微生物进行分离，将分离菌株在鸟式发酵管中进行产气验证试验，之后利用分子生物学方法，对分离菌株进行鉴定。
而且，具体步骤如下：
⑴将厌氧培养箱中充满氮气和混合气，其中，所述氮气为体积分数为99.999％的高纯氮气，所述混合气由二氧化碳、氢气和氮气组成，二氧化碳，氢气，氮气的体积分数分别为5％，5％，90％；
将酱油样品原液和10-1、10-2、10-3稀释后的酱油样品，分别取200μL均匀涂布到五种培养基上，之后分别在室温、30℃和37℃下在厌氧培养箱中培养24～48h，每个试验做三次平行，将得到的不同菌株分别在对应的培养基上传代培养，得到单菌落后，在相应液体培养基中纯化，用甘油冻藏于-80℃冰箱，待用；
⑵将分离得到的菌株在相应的液体培养基中培养24h制备菌悬液；在无菌条件下，分别将单一和多菌株混合后的菌悬液加到灭菌后的含产气验证培养基的鸟式发酵管中，使菌浓度为1×106～1×107cfu/mL，细菌于37℃、霉菌和酵母菌于30℃，恒温培养，观察是否有气体产生；为确保结果的准确性，以无菌水替代菌悬液作为对照组，；实验组和对照组均需进行三次平行试验；
⑶通过分子生物学方法鉴定产气菌，即，首先对产气菌株进行DNA提取，之后将所得DNA进行PCR扩增，最终将扩增产物纯化，进行序列测定；将得到的16S rDNA序列在NCBI中进行Blast分析，根据相似度来确定微生物种类，即可快速鉴定胀袋酱油中产气微生物。
而且，所述五种培养基如下：
①厌氧培养基：氯化钠5.0g/L，胰酪胨12.0g/L，磷酸氢二钠1.0g/L，蛋白胨10.0g/L，刃天青1.0mg/L，葡萄糖2.0g/L，硫乙醇酸盐0.5g/L，L-半胱氨酸0.45g/L，溶剂为水，pH 7.3±0.1；
②庖肉培养基：蛋白胨30.0g/L，酵母浸粉5.0g/L，牛肉浸出粉5.0g/L，磷酸二氢钠5.0g/L，葡萄糖3.0g/L，可溶性淀粉2.0g/L，溶剂为水；
③GAM肉汤培养基：牛肉浸粉2.2g/L，蛋白胨10.0g/L，可溶性淀粉5.0g/L，酵母浸粉5.0g/L，氯化钠3.0g/L，大豆胨3.0g/L，葡萄糖3.0g/L,蛋白胨10.0g/L，血清消化粉13.5g/L，牛肝浸粉1.2g/L，L-半胱氨酸0.3g/L，巯基乙酸钠0.3g/L，溶剂为水；
④酵母浸出粉胨葡萄糖培养基，即YPD：蛋白胨2％，酵母提取物1％，葡萄糖5％，余量为水，上述百分数均为质量百分数；
⑤孟加拉红培养基：蛋白胨5.0g/L，琼脂粉18.5g/L，葡萄糖10.0g/L，磷酸二氢钾1.0g/L，硫酸镁0.5g/L，孟加拉红0.033g/L，氯霉素0.1g/L，溶剂为水。
而且，所述培养基①②③用来分离细菌，④用来分离酵母，⑤用来分离霉菌。
而且，所述产气验证培养基如下：
蛋白胨1％，葡萄糖3％，酵母粉0.3％，微量元素液1％，酱油20％，pH 5.0～5.5，余量为水；其中，所述百分数为质量百分数；
所述微量元素液为：食盐10g/L，硫酸镁0.5g/L，硼酸0.06g/L，氯化钾0.18g/L，氯化钙0.356g/L，溴化钾0.01g/L，溶剂为水。
而且，所述培养基的产气情况在鸟式发酵管中进行观察，其中，菌浓度为1×106～1×107cfu/mL，分别在培养24h、48h和72h之后观察鸟式发酵管顶部有无气体产生以及气体体积的变化，从而直观判断产气量。
本发明取得的优点及积极效果是：
1、本方法在厌氧条件下操作，最大程度模拟和还原酱油成品中微生物所处的环境条件，在该条件下测试所得胀袋酱油中微生物的鉴定方法，可靠度高。
2、本方法与目前其他酱油中微生物鉴定方法相比，简便快速，且具有普遍适用性，可以应用于各酱油企业；在菌种分离阶段，采用了分离细菌、酵母、霉菌的不同培养基，对可能造成产气的微生物种类全部进行分离；在产气菌验证阶段，选用不同培养温度进行产气验证试验，防止了假阳性试验的出现，准确性高。
3、本方法使用鸟式发酵管对酱油中产气菌进行产气情况观察，既能直观观察产气情况和产气量的变化，又可以将产气结果量化，这不仅对于酱油中产气菌的鉴定有重要意义，而且对酱油中产气菌的控制很有参考价值，对于酱油酿造工艺的改进也能提供技术支持。
4、本方法在菌种分离和产气菌鉴定时，采用室温、30℃和37℃三种温度条件，既考虑到酱油所处的温度条件，又考虑到不同菌种适宜生长的温度条件，全面考虑了酱油中可能污染的不同微生物，对系统全面地鉴定酱油中产气微生物提供了保障。
5、本方法所用产气验证培养基，添加了一定量的酱油，与其他产气菌检测所用培养基相比，该培养基更加接近酱油中的营养物质，所得结果更加可靠。
6、本方法简单易学，周期较短，实用性强，易于推广，既可以检测酱油中是否存在产气微生物，又可以分离鉴定导致酱油产气的微生物，系统地解决了酱油胀袋这一行业难题，同时为改进酱油酿造工艺提供了技术支持；此外，本发明方法公开了一种验证酱油中产气微生物专用培养基的方法，成本低，特异性强，实用性强。
附图说明
图1为本发明方法中鸟式发酵管产气验证试验结果图；其中，a为培养24h后鸟式发酵管中气体变化情况图，b为培养48h后鸟式发酵管中气体变化情况图，c为培养72h后鸟式发酵管中气体变化情况图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
本发明中所使用的试剂，如无特殊规定，均为本领域内的常用试剂；本发明中所使用的方法，如无特殊规定，均为本领域内的常规方法。
一种快速鉴定胀袋酱油中产气微生物的方法，所述方法在厌氧条件下，利用不同培养基对酱油中的微生物进行分离，将分离菌株在鸟式发酵管中进行产气验证试验，之后利用分子生物学方法，对分离菌株进行鉴定。
实施例1
一种快速鉴定低盐固态胀袋酱油中产气微生物的方法，所述方法在厌氧条件下，利用不同培养基对某低盐固态发酵酱油中的微生物进行分离，将分离菌株在鸟式发酵管中进行产气验证试验，之后利用分子生物学方法，对分离菌株进行鉴定。
较优地，具体步骤如下：
⑴将厌氧培养箱中充满氮气和混合气，其中，所述氮气为体积分数为99.999％的高纯氮气，所述混合气由二氧化碳、氢气和氮气组成，二氧化碳，氢气，氮气的体积分数分别为5％，5％，90％；
将酱油样品原液和10-1、10-2、10-3稀释后的酱油样品，分别取200μL均匀涂布到五种培养基上，之后在分别在室温、30℃和37℃下培养36h。每个试验做三次平行，将得到的不同菌株分别在对应的培养基上传代培养，得到单菌落后，在相应液体培养基中纯化，用甘油冻藏于-80℃冰箱，待用；
⑵将分离得到的菌株在相应的液体培养基中培养24h制备菌悬液；在无菌条件下，分别将单一和多菌株混合后的菌悬液加到灭菌后的含产气验证培养基的鸟式发酵管中，细菌于37℃，霉菌和酵母菌于30℃，恒温培养，观察是否有气体产生；为确保结果的准确性，以无菌水替代菌悬液作为对照组。实验组和对照组均需进行三次平行试验；
⑶通过分子生物学方法鉴定产气菌，即首先对产气菌株进行DNA提取，之后将所得DNA进行PCR扩增，最终将扩增产物纯化，进行序列测定。将得到的16S rDNA序列在NCBI中进行Blast分析，根据相似度来确定微生物种类，最终确定产气微生物为枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌。
其中，所述五种培养基如下：
①厌氧培养基：氯化钠5.0g/L，胰酪胨12.0g/L，磷酸氢二钠1.0g/L，蛋白胨10.0g/L，刃天青1.0mg/L，葡萄糖2.0g/L，硫乙醇酸盐0.5g/L，L-半胱氨酸0.45g/L，溶剂为水，pH 7.3±0.1；
②庖肉培养基：蛋白胨30.0g/L，酵母浸粉5.0g/L，牛肉浸出粉5.0g/L，磷酸二氢钠5.0g/L，葡萄糖3.0g/L，可溶性淀粉2.0g/L，溶剂为水；
③GAM肉汤培养基：牛肉浸粉2.2g/L，蛋白胨10.0g/L，可溶性淀粉5.0g/L，酵母浸粉5.0g/L，氯化钠3.0g/L，大豆胨3.0g/L，葡萄糖3.0g/L,蛋白胨10.0g/L，血清消化粉13.5g/L，牛肝浸粉1.2g/L，L-半胱氨酸0.3g/L，巯基乙酸钠0.3g/L，溶剂为水；
④酵母浸出粉胨葡萄糖培养基，即YPD：蛋白胨2％，酵母提取物1％，葡萄糖5％，余量为水，上述百分数均为质量百分数；
⑤孟加拉红培养基：蛋白胨5.0g/L，琼脂粉18.5g/L，葡萄糖10.0g/L，磷酸二氢钾1.0g/L，硫酸镁0.5g/L，孟加拉红0.033g/L，氯霉素0.1g/L，溶剂为水。
所述培养基①②③用来分离细菌，④用来分离酵母，⑤用来分离霉菌。
所述产气验证培养基如下：
蛋白胨1％，葡萄糖3％，酵母粉0.3％，微量元素液1％，酱油20％，pH 5.0～5.5，余量为水；其中，所述百分数为质量百分数；
所述微量元素液为：食盐10g/L，硫酸镁0.5g/L，硼酸0.06g/L，氯化钾0.18g/L，氯化钙0.356g/L，溴化钾0.01g/L；
所述培养基的产气情况可以在鸟式发酵管中进行观察，其中，菌浓度为1×106cfu/mL。分别在培养24h、48h和72h之后观察鸟式发酵管顶部有无气体产生以及气体体积的变化，从而直观判断产气量。
实施例2
一种快速鉴定高盐稀态胀袋酱油中产气微生物的方法，所述方法在厌氧条件下，利用不同培养基对某高盐稀态发酵酱油中的微生物进行分离，将分离菌株在鸟式发酵管中进行产气验证试验，之后利用分子生物学方法，对分离菌株进行鉴定。
较优地，具体步骤如下：
⑴将厌氧培养箱中充满氮气和混合气，其中，所述氮气为体积分数为99.999％的高纯氮气，所述混合气由二氧化碳、氢气和氮气组成，二氧化碳，氢气，氮气的体积分数分别为5％，5％，90％；
将酱油样品原液和10-1、10-2、10-3稀释后的样品，分别取200μL均匀涂布到五种培养基上，之后在分别在室温、30℃和37℃下培养24h。每个试验做三次平行，将得到的不同菌株分别在对应的培养基上传代培养，得到单菌落后，在相应液体培养基中纯化，用甘油冻藏于-80℃冰箱，待用；
⑵将分离得到的菌株在相应的液体培养基中培养24h制备菌悬液；在无菌条件下，分别将单一和多菌株混合后的菌悬液加到灭菌后的含产气验证培养基的鸟式发酵管中，细菌于37℃，霉菌和酵母菌于30℃，恒温培养，观察是否有气体产生；为确保结果的准确性，以无菌水替代菌悬液作为对照组。实验组和对照组均需进行三次平行试验；
⑶通过分子生物学方法鉴定产气菌，即，首先对产气菌株进行DNA提取，之后将所得DNA进行PCR扩增，最终将扩增产物纯化，进行序列测定。将得到的16S rDNA序列在NCBI中进行Blast分析，根据相似度来确定微生物种类，最终确定产气微生物为丁酸梭菌；
所述五种培养基如下：
①厌氧培养基：氯化钠5.0g/L，胰酪胨12.0g/L，磷酸氢二钠1.0g/L，蛋白胨10.0g/L，刃天青1.0mg/L，葡萄糖2.0g/L，硫乙醇酸盐0.5g/L，L-半胱氨酸0.45g/L，溶剂为水，pH 7.3±0.1；
②庖肉培养基：蛋白胨30.0g/L，酵母浸粉5.0g/L，牛肉浸出粉5.0g/L，磷酸二氢钠5.0g/L，葡萄糖3.0g/L，可溶性淀粉2.0g/L，溶剂为水；
③GAM肉汤培养基：牛肉浸粉2.2g/L，蛋白胨10.0g/L，可溶性淀粉5.0g/L，酵母浸粉5.0g/L，氯化钠3.0g/L，大豆胨3.0g/L，葡萄糖3.0g/L,蛋白胨10.0g/L，血清消化粉13.5g/L，牛肝浸粉1.2g/L，L-半胱氨酸0.3g/L，巯基乙酸钠0.3g/L，溶剂为水；
④酵母浸出粉胨葡萄糖培养基，即YPD：蛋白胨2％，酵母提取物1％，葡萄糖5％，余量为水，上述百分数均为质量百分数；
⑤孟加拉红培养基：蛋白胨5.0g/L，琼脂粉18.5g/L，葡萄糖10.0g/L，磷酸二氢钾1.0g/L，硫酸镁0.5g/L，孟加拉红0.033g/L，氯霉素0.1g/L，溶剂为水。
所述产气验证培养基如下：
蛋白胨1％，葡萄糖3％，酵母粉0.3％，微量元素液1％，酱油20％，余量为水；其中，所述百分数为质量百分数，pH 5.0～5.5；
所述微量元素为：食盐10g/L，硫酸镁0.5g/L，硼酸0.06g/L，氯化钾0.18g/L，氯化钙0.356g/L，溴化钾0.01g/L；
所述培养基的产气情况可以在鸟式发酵管中进行观察，其中，菌浓度为1×107cfu/mL。分别在24h、48h和72h之后观察鸟式发酵管顶部有无气体产生。
实施例3
一种快速鉴定胀袋酱油中产气微生物的方法，所述方法在厌氧条件下，利用不同培养基对酱油中的微生物进行分离，将分离菌株在鸟式发酵管中进行产气验证试验，之后利用分子生物学方法，对分离菌株进行鉴定。
较优地，具体步骤如下：
⑴将厌氧培养箱中充满氮气和混合气，其中，所述氮气为体积分数为99.999％的高纯氮气，所述混合气由二氧化碳、氢气和氮气组成，二氧化碳，氢气，氮气的体积分数分别为5％，5％，90％；
取酱油样品原液和10-1、10-2、10-3稀释后的酱油样品，分别取200μL均匀涂布到五种培养基上，之后分别在室温、30℃和37℃下在厌氧培养箱中培养48h，每个试验做三次平行，将得到的不同菌株分别在对应的培养基上传代培养，得到单菌落后，在相应液体培养基中纯化，用甘油冻藏于-80℃冰箱，待用；
⑵将分离得到的菌株在相应的液体培养基中培养24h制备菌悬液；在无菌条件下，分别将单一和多菌株混合后的菌悬液加到灭菌后的含产气验证培养基的鸟式发酵管中，菌浓度为1×106～1×107cfu/mL，细菌于37℃，霉菌和酵母菌于30℃，恒温培养，观察是否有气体产生；为确保结果的准确性，以无菌水替代菌悬液作为对照组；实验组和对照组均需进行三次平行试验；
⑶通过分子生物学方法鉴定产气菌，即，首先对产气菌株进行DNA提取，之后将所得DNA进行PCR扩增，最终将扩增产物纯化，进行序列测定；将得到的16S rDNA序列在NCBI中进行Blast分析，根据相似度来确定微生物种类。最终确定产气微生物为地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌。
较优地，所述五种培养基如下：
①厌氧培养基：氯化钠5.0g/L，胰酪胨12.0g/L，磷酸氢二钠1.0g/L，蛋白胨10.0g/L，刃天青1.0mg/L，葡萄糖2.0g/L，硫乙醇酸盐0.5g/L，L-半胱氨酸0.45g/L，溶剂为水，pH 7.3±0.1；
②庖肉培养基：蛋白胨30.0g/L，酵母浸粉5.0g/L，牛肉浸出粉5.0g/L，磷酸二氢钠5.0g/L，葡萄糖3.0g/L，可溶性淀粉2.0g/L，溶剂为水；
③GAM肉汤培养基：牛肉浸粉2.2g/L，蛋白胨10.0g/L，可溶性淀粉5.0g/L，酵母浸粉5.0g/L，氯化钠3.0g/L，大豆胨3.0g/L，葡萄糖3.0g/L,蛋白胨10.0g/L，血清消化粉13.5g/L，牛肝浸粉1.2g/L，L-半胱氨酸0.3g/L，巯基乙酸钠0.3g/L，溶剂为水；
④酵母浸出粉胨葡萄糖培养基，即YPD：蛋白胨2％，酵母提取物1％，葡萄糖5％，余量为水，上述百分数均为质量百分数；
⑤孟加拉红培养基：蛋白胨5.0g/L，琼脂粉18.5g/L，葡萄糖10.0g/L，磷酸二氢钾1.0g/L，硫酸镁0.5g/L，孟加拉红0.033g/L，氯霉素0.1g/L，溶剂为水。
其中，所述培养基①②③用来分离细菌，④用来分离酵母，⑤用来分离霉菌。
较优地，所述产气验证培养基如下：
蛋白胨1％，葡萄糖3％，酵母粉0.3％，微量元素液1％，酱油20％，pH 5.0～5.5，余量为水；其中，所述百分数为质量百分数；
所述微量元素液为：食盐10g/L，硫酸镁0.5g/L，硼酸0.06g/L，氯化钾0.18g/L，氯化钙0.356g/L，溴化钾0.01g/L。
较优地，所述培养基的产气情况在鸟式发酵管中进行观察，其中，菌浓度为1×106～1×107cfu/mL，分别在培养24h、48h和72h之后观察鸟式发酵管顶部有无气体产生以及气体体积的变化，从而直观判断产气量。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其它形式的限制，任何技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例；但是凡是未脱离本发明的技术方案内容，对上述实施例做任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。