本发明属于免疫检测技术领域,尤其涉及应用于组织样本中核小体位点MNase酶切优化方法。
背景技术:
在真核细胞中,核小体是由147bp的DNA片段紧密缠绕在组蛋白八聚体上所形成的一个复合体结构,2个相邻的核小体由DNA片段连接,多个核小体的顺次连接形成染色质。核小体与DNA的相互作用是一个动态的作用过程,核小体的位置并不是恒定不变的。在多数情况下,没有核小体结合的DNA区域易于各种调节蛋白的接近与结合。因此人们怀疑核小体的定位与基因的转录之间存在某种内在联系。为了更为深入的证明核小体定位与基因转录之间的关系,越来越多的研究致力于研究如何精确描绘出细胞中的核小体定位信息。
微球菌核酸酶(MNase)属于核酶的一种,是一种非特异性的核酸切割酶。目前MNase-Seq技术只在国外应用,并未在国内推广,没有很好的应用于临床,也没有对临床样本的MNase酶切优化方法。
技术实现要素:
有鉴于此,本发明提供一种解决或部分解决上述问题的应用于组织样本中核小体位点MNase酶切优化方法。
为达到上述技术方案的效果,本发明的技术方案为:应用于组织样本中核小体位点MNase酶切优化方法,该方法包括以下处理步骤:
步骤一:制备染色质:
首先,将收集的组织样本用0℃的生理盐水洗涤后加入到红细胞裂解液中得到混合物A,将混合物A用无菌蒸馏水洗涤后得到白细胞,红细胞裂解液包括:30mM KHCO3、250mM NH4Cl、10mM EDTA-Na2;
其次,将白细胞加入到TEDP溶液中后再置于37℃水浴中高速离心,得到沉淀物A;TEDP溶液包括:50mM Tris-HCl、2mM EDTA、2mM DDT、10wt%甘油、50μg/mL PMSF;
而后,将沉淀物A加入到TEDP溶液后平铺于300mM的蔗糖溶液上,在匀浆70000g中离心1h得到纯净染色质;
最后,将纯净染色质用无菌蒸馏水洗涤后加入到染色质贮存液中得到混合液Y,染色质贮存液包括:10mM Tris-HCl、5mM PMSF;
步骤二:制备DNA:
首先,将混合液Y加入到裂解缓冲液中得到混合液A,裂解缓冲液包括:10mM Tris-HCl、5mM EDTA、500mM NaCl、1wt%SDS;
其次,在混合液A中加入RNase后,再在37℃水浴中静置0.5h得到混合液B;在混合液A中加入RNase时,使RNase的终浓度为100μg/mL;
而后,在混合液B中加入蛋白酶K后,再在55℃水浴中静置2h得到混合液C;在混合液B中加入蛋白酶K时,使蛋白酶K的终浓度为100μg/mL;
随后,在混合液C中加入和混合液C等体积的氯仿醇溶液,温和混匀后静置10min,取上层清液得到混合液D;氯仿醇溶液包括:Tris饱和酚、氯仿、异戊醇,体积比为25:24:1;
最后,在混合液D中加入无水乙醇后静置沉淀,得到DNA样品;混合液D和无水乙醇的体积比为1:2;
步骤三:MNase酶切:
首先,在DNA样品中加入微球菌核酸酶和酶切缓冲液,在37℃水浴中酶切10min后,加入酶切终止液得到混合液E;酶切缓冲液包括:15mM Tris-HCl、15mM NaCl、50mM KCl、2mM EDTA、1mM EGTA;酶切终止液包括:20mM NaCl、20mM EDTA、1wt%SDS、1wt%甘油;
然后,在混合液E中加入蛋白酶K,再在55℃的条件下孵育1h后,加入和混合液E等体积的氯仿醇溶液,温和混匀后静置10min,取上层清液得到混合液F;
最后,在混合液F中加入无水乙醇,在-20℃的条件下沉淀10h后,再在4℃下匀浆70000g中离心15min后得到混合物W,将混合物W在室温下晾干后加入到TE缓冲液中得到混合液G;TE缓冲液包括:10mM Tris-HCl、2mM EDTA;混合液F和无水乙醇的体积比为1:2;
步骤四:回收DNA片段:
对混合液G进行电泳,切胶回收融化凝胶中的DNA;电泳的条件为80V,1h,1.3wt%的琼脂糖胶;
步骤五:高通量测序:
首先将步骤四回收的DNA进行高通量测序得到MNase数据;然后将MNase数据进行接头过滤后再进行读段定位,将得到的读段回填到参考基因组上得到读段回填结果;
步骤六:效率检验:
首先,将MNase数据中基因组序列从第一个碱基开始依次划分为多个长度为100bp的非重叠的连续的检验序列,并按照划分的次序对检验序列编号,检验序列的编号是由1开始的连续的正整数序列;然后,统计每个检验序列内的读段数量;最后,用公式一计算回收效率:
公式一:
其中,ε是回收效率,为0~1之间的实数;i是检验序列的编号,为正整数;n是检验序列的个数,为正整数;x是检验序列内的读段数量,xi是编号为i的检验序列内的读段数量,x和xi为正整数。
本发明的有益成果为:本发明提供了应用于组织样本中核小体位点MNase酶切优化方法,包括制备染色质、制备DNA,MNase酶切,回收DNA片段,高通量测序,效率检验。本发明对组织细胞核的前期收集方法进行改进,并优化酶切反应条件,提高了酶切效率和回收率。不仅能够有效的获取正确的染色质片段,而且能够在精准定位转录调控元件在全基因组上的结合位点,提高了临床样本的研究进程。
具体实施方式
为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白,以下结合实施例,对本发明进行详细的说明。应当说明的是,此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明,并不用于限定本发明,能实现同样功能的产品属于等同替换和改进,均包含在本发明的保护范围之内。具体方法如下:
实施例1:本实施例具体介绍了核小体定位的方法,如下:
核小体定位被认为是核小体起始于基因组内的特异碱基对的概率,与已知的调节机制在基因和染色质调控中起着同等重要的作用,也就表明核小体在基因组DNA内不是随机分布的,但是可能为了某种意图趋向于定位在特定的区域或离开基因组的特定区域。核小体定位绝非不依赖于其他的类似于组蛋白修饰和染色质重塑等转录机制,而是与它们紧密缠绕在一起。然而,核小体在DNA上的定位非常复杂,可以通过四种简单的描述符来描述核小体定位特征:
(1)核小体重复长度(Nucleosome repeat length,NRL):
核小体重复长度是与一个核小体相关的DNA的平均长度,包括核心DNA和连接DNA,核心DNA的长度是固定的(~147bp),而连接DNA指示了NRL中的变化程度。
(2)核小体模糊性(Nucleosome fuzziness):
核小体模糊性描述了从全部的测量中获得的核小体定位的区域的可能性的波动,强定位的核小体显示出在核小体定位图谱中尖峰而模糊定位的区域则由于核小体的去局域化显得模糊不清。
(3)核小体占位(Nucleosome occupancy):
核小体占位针对核小体在基因组中特异DNA序列中的存在或缺乏,例如在转录因子结合位点。因此,核小体占位主要指示的是核小体在某个位点停留时间的长短,而这是核小体模糊性并不会关注的方面。
(3)核小体相位(Nucleosome phasing)
核小体相位是指沿着DNA特异的基因或染色质区域的重复的核小体定位的阵列排布,核小体相位趋向于影响NRL,但相反地,NRL与特定的DNA序列结合在一起。
实施例2:本实施例具体说明了应用于组织样本中核小体位点MNase酶切优化方法的处理步骤,如下:
步骤一:制备染色质:
首先,将收集的组织样本用0℃的生理盐水洗涤后加入到红细胞裂解液中得到混合物A,将混合物A用无菌蒸馏水洗涤后得到白细胞,红细胞裂解液包括:30mM KHCO3、250mM NH4Cl、10mM EDTA-Na2;
其次,将白细胞加入到TEDP溶液中后再置于37℃水浴中高速离心,得到沉淀物A;TEDP溶液包括:50mM Tris-HCl、2mM EDTA、2mM DDT、10wt%甘油、50μg/mL PMSF;
而后,将沉淀物A加入到TEDP溶液后平铺于300mM的蔗糖溶液上,在匀浆70000g中离心1h得到纯净染色质;
最后,将纯净染色质用无菌蒸馏水洗涤后加入到染色质贮存液中得到混合液Y,染色质贮存液包括:10mM Tris-HCl、5mM PMSF;
步骤二:制备DNA:
首先,将混合液Y加入到裂解缓冲液中得到混合液A,裂解缓冲液包括:10mM Tris-HCl、5mM EDTA、500mM NaCl、1wt%SDS;
其次,在混合液A中加入RNase后,再在37℃水浴中静置0.5h得到混合液B;在混合液A中加入RNase时,使RNase的终浓度为100μg/mL;
而后,在混合液B中加入蛋白酶K后,再在55℃水浴中静置2h得到混合液C;在混合液B中加入蛋白酶K时,使蛋白酶K的终浓度为100μg/mL;
随后,在混合液C中加入和混合液C等体积的氯仿醇溶液,温和混匀后静置10min,取上层清液得到混合液D;氯仿醇溶液包括:Tris饱和酚、氯仿、异戊醇,体积比为25:24:1;
最后,在混合液D中加入无水乙醇后静置沉淀,得到DNA样品;混合液D和无水乙醇的体积比为1:2;
步骤三:MNase酶切:
首先,在DNA样品中加入微球菌核酸酶和酶切缓冲液,在37℃水浴中酶切10min后,加入酶切终止液得到混合液E;酶切缓冲液包括:15mM Tris-HCl、15mM NaCl、50mM KCl、2mM EDTA、1mM EGTA;酶切终止液包括:20mM NaCl、20mM EDTA、1wt%SDS、1wt%甘油;
然后,在混合液E中加入蛋白酶K,再在55℃的条件下孵育1h后,加入和混合液E等体积的氯仿醇溶液,温和混匀后静置10min,取上层清液得到混合液F;
最后,在混合液F中加入无水乙醇,在-20℃的条件下沉淀10h后,再在4℃下匀浆70000g中离心15min后得到混合物W,将混合物W在室温下晾干后加入到TE缓冲液中得到混合液G;TE缓冲液包括:10mM Tris-HCl、2mM EDTA;混合液F和无水乙醇的体积比为1:2;
步骤四:回收DNA片段:
对混合液G进行电泳,切胶回收融化凝胶中的DNA;电泳的条件为80V,1h,1.3wt%的琼脂糖胶;
步骤五:高通量测序:
首先将步骤四回收的DNA进行高通量测序得到MNase数据;然后将MNase数据进行接头过滤后再进行读段定位,将得到的读段回填到参考基因组上得到读段回填结果;
步骤六:效率检验:
首先,将MNase数据中基因组序列从第一个碱基开始依次划分为多个长度为100bp的非重叠的连续的检验序列,并按照划分的次序对检验序列编号,检验序列的编号是由1开始的连续的正整数序列;然后,统计每个检验序列内的读段数量;最后,用公式一计算回收效率:
公式一:
其中,ε是回收效率,为0~1之间的实数;i是检验序列的编号,为正整数;n是检验序列的个数,为正整数;x是检验序列内的读段数量,xi是编号为i的检验序列内的读段数量,x和xi为正整数。
本发明的有益成果为:本发明提供了应用于组织样本中核小体位点MNase酶切优化方法,包括制备染色质、制备DNA,MNase酶切,回收DNA片段,高通量测序,效率检验。本发明对组织细胞核的前期收集方法进行改进,并优化酶切反应条件,提高了酶切效率和回收率。不仅能够有效的获取正确的染色质片段,而且能够在精准定位转录调控元件在全基因组上的结合位点,提高了临床样本的研究进程。
以上所述仅为本发明之较佳实施例,并非用以限定本发明的权利要求保护范围。同时以上说明,对于相关技术领域的技术人员应可以理解及实施,因此其他基于本发明所揭示内容所完成的等同改变,均应包含在本权利要求书的涵盖范围内。