专利名称：一种双固定化多酶体系生产l-2-氨基丁酸的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种以L-苏氨酸为原料，以共固定化的L-苏氨酸脱氨酶和亮氨酸脱氢酶为生物转化催化剂，以共固定化醇氧化酶、甲醛脱氢酶和甲酸脱氢酶为辅酶再生催化剂，生产L-2-氨基丁酸及回收固定化酶的方法。
背景技术：
L-2-氨基丁酸是一种人体神经信息传递的天然氨基酸，也是一种重要的化工原料和医药中间体，广泛应用于药物合成，例如抗癫痫药物左乙拉西坦、抗结核药物盐酸乙胺丁醇等。目前，L-2-氨基丁酸主要应用于合成左乙拉西坦药物，左乙拉西坦是一种新型抗癫痫药物，2000年FDA认证，在欧美地区上市销售，是目前美国癫痫治疗中应用最多的新型抗癫痫药物，2007年左乙拉西坦在中国正式上市销售。而L-2-氨基丁酸是左乙拉西坦的主要手性前体化合物。目前，L-2-氨基丁酸的制备方法主要分为化学法和酶催化方法。化学法主要包括脱硫反应法、氨化水解反应法、丁酮酸还原法、卤代酸氨解法等等(尹先清等.α -氨基丁酸化学合成研究进展.精细化工中间体，2010，40(1): 12-14)。化学法合成L-2-氨基丁酸，虽然操作简便，但由于L-2-氨基丁酸是手性氨基酸，化学合成过程中，反应条件苛刻，副产物多，易形成消旋产物，造成生产成本高、立体选择性差、化学污染大、反应产物成分复杂、分离纯化困难等缺点。酶催化方法则避免了化学合成方法中存在的缺点，具有立体选择性高、反应条件温和、生产成本低、污染少等优点。目前，酶催化方法制备L-2-氨基丁酸，主要采用两种方法一是转氨酶法，祝俊等人以L-苏氨酸为底物，采用苏氨酸脱氨酶和亮氨酸脱氢酶生物转化制备L-2-氨基丁酸，引入甲酸脱氢酶解决辅酶再生问题 (CN 101818178)。杨晟等人也以L-苏氨酸为底物，采用苏氨酸脱氨酶转氨后制备丁酮酸，再采用多种L-氨基酸脱氢酶转化制备L-2-氨基丁酸，NADH再生除了采用甲酸脱氢酶再生系统外，还采用葡萄糖脱氢酶和亚磷酸脱氢酶辅酶再生系统(CN 102212567)。^in 等人以2-丁酮酸为底物，以源于河流弧菌的ω-转氨酶生物转化制备L-2-氨基丁酸 (Jong-Shik Shin and Byung-Gee Kim. Transaminase-catalyzed asymmetric synthesis of L-2-aminobutyric acid from achiral reactants. Biotechnology Letters, 2009， 31: 1595-1599. );二是酶拆分法，以化学合成的消旋DL型氨基酸为底物，采用L-氨基酸酰化酶生物转化制备L-2-氨基丁酸，L-氨基酸的理论最高只有50% (Enzyme and Microbial Technology, 1999，24(7): 381-387)。奚强等人以猪肾氨基酰化酶为生物催化剂水解 N-乙酰氨基丁酸，制备L-2-氨基丁酸，收率可达71. 8%(武汉工程大学学报，2009，31(3): 26-29)ο酶催化法制备L-2-氨基丁酸虽然具备化学合成法无可比拟的优势，但目前这些酶催化法无一例外地采用苏氨酸脱氨酶、亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶三种游离酶生物转化制备L-2-氨基丁酸。这类方法存在着三种游离酶一次使用、无法回收再利用，酶活力稳定性差、易失活，辅酶再生效率低，游离酶与产物混合在一起、增加分离纯化负担等缺点。 与游离酶相比，固定化酶的优势在于既保持高效、专一、温和的酶催化反应特性的同时，又具有高稳定性、分离回收容易、多次重复使用、操作的连续可控性以及工艺简便等优点。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种双固定化多酶体系生产L-2-氨基丁酸的方法。该方法利用一种可逆溶解PH敏感高分子载体固定化苏氨酸脱氨酶与亮氨酸脱氢酶的共固定化多酶体系和一种可逆溶解PH敏感高分子载体固定化醇氧化酶、甲醛脱氢酶和甲酸脱氢酶的共固定化辅酶再生体系，以提高固定化酶稳定性、辅酶再生效率、与反应底物之间的可及性以及提高固定化酶的回收再利用率。为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下
一种双固定化多酶体系生产L-2-氨基丁酸的方法，该方法包括如下步骤
(1)苏氨酸脱氨酶和亮氨酸脱氢酶的共固定化多酶体系的制备
(Ia)可逆溶解性pH敏感高分子载体溶液与含有苏氨酸脱氨酶和亮氨酸脱氢酶的酶液充分混合，在25°C、pH 8. 0的条件下，温育0. 2飞小时，优选0. 5^3小时；
(Ib)温育结束后，用0. lmol/L的磷酸溶液调节溶液pH低于6. 0，静置2、小时，得悬浮液，离心后得到固体微球，用0. 05mol/L、pH6. 0的磷酸盐缓冲液洗涤微球，洗涤悬浮液离心后得到固体微球，重复洗涤离心过程2 3次，得到共固定化多酶体系，置于4°C保存备用；
(2)醇氧化酶、甲醛脱氢酶和甲酸脱氢酶的共固定化辅酶再生体系的制备
(2a)可逆溶解性pH敏感高分子载体溶液与含有醇氧化酶、甲醛脱氢酶和甲酸脱氢酶的酶液充分混合，在25°C、pH 8.0的条件下，温育0. 2飞小时，优选0. 5 3小时；
(2b)温育结束后，用0. lmol/L的磷酸溶液调节溶液pH低于6. 0，静置2、小时，得悬浮液，离心后得到固体微球，用0. 05mol/L、pH6. 0的磷酸盐缓冲液洗涤微球，洗涤悬浮液离心后得到固体微球，重复洗涤离心过程2 3次，得到共固定化辅酶再生体系，置于4°C保存
(3)利用共固定化多酶体系和共固定化辅酶再生体系生产L-2-氨基丁酸 (3a)将L-苏氨酸和甲醇溶解于0. 05mol/L磷酸盐缓冲液中，用氨水调节pH值到 7. 0 8. 0之间，L-苏氨酸的加入量为3(T200g/L，优选5(Tl50g/L，甲醇的加入量为7 50g/ L，优选 15 40g/L;
(3b)向步骤(3a)得到的体系中加入步骤(Ib)得到的共固定化多酶体系和步骤Ob) 得到的共固定化辅酶再生体系，再加入氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)，氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的加入量为0. 02 0. 2g/L，优选0. θΓθ. lg/L，在2(T40°C下反应 6 48小时，优选在^ 33°C下反应12 36小时；
(3c)步骤(3b)反应结束后，用0. lmol/L的磷酸溶液调节体系的pH低于6.0，静置2、 小时，得悬浮液，离心后得到固体微球和上清液；
(3d)步骤(3c)得到的固体微球，用0. 05mol/L、pH6. 0的磷酸盐缓冲液洗涤微球，洗涤悬浮液离心后得到固体微球，重复洗涤离心过程2 3次，最后加入0. 05mol/L、pH8. 0的磷酸盐缓冲液溶解固体微球，以备下次使用；
(3e)步骤(3c)得到的上清液，经浓缩结晶，烘干得到L-2-氨基丁酸。步骤(Ia)和Qa)中，所述的可逆溶解性pH敏感高分子载体为Eudragit S-IOO0步骤(Ia)中，所述的可逆溶解性pH敏感高分子载体溶液中，可逆溶解性pH敏感高分子载体浓度为20g/L，溶剂为0. 05mol/L、pH 8. 0磷酸盐缓冲液；所述的含有苏氨酸脱氨酶和亮氨酸脱氢酶的酶液中，苏氨酸脱氨酶的浓度为20 200IU/L，优选5(Tl00IU/mL， 亮氨酸脱氢酶的浓度为50 150IU/L，优选7(Tl00IU/mL，以0. 05mol/L、pH 8. 0的磷酸盐缓冲液为溶剂配制酶液；可逆溶解性PH敏感高分子载体溶液与含有苏氨酸脱氨酶和亮氨酸脱氢酶的酶液体积比为1:广10，优选1:2、。步骤Qa)中，所述的可逆溶解性pH敏感高分子载体溶液中，可逆溶解性pH敏感高分子载体浓度为20g/L，溶剂为0. 05mol/L、pH 8. 0磷酸盐缓冲液；所述的含有醇氧化酶、 甲醛脱氢酶和甲酸脱氢酶的酶液中，醇氧化酶的浓度为5(T150IU/L，优选7(Tl00IU/mL，甲醛脱氢酶的浓度为5(T150IU/L，优选7(Tl00IU/mL，甲酸脱氢酶的浓度为5(Tl50IU/L，优选 7(Tl00IU/mL，以0. 05mol/L、pH 8. 0的磷酸盐缓冲液为溶剂配制酶液；可逆溶解性pH敏感高分子载体溶液与含有醇氧化酶、甲醛脱氢酶和甲酸脱氢酶的酶液体积比为1 广10。 步骤(3b)中，共固定化多酶体系加入量控制苏氨酸脱氨酶浓度为5000 15000IU/L，优选800(Tl2000IU/L，亮氨酸脱氢酶浓度为8000 15000IU/L，优选1000(Tl4000IU/L ；共固定化辅酶再生体系加入量控制醇氧化酶浓度为4000 15000IU/L，优选800(Tl3000IU/L， 甲醛脱氢酶浓度为4000 15000IU/L，优选800(Tl3000IU/L，甲酸脱氢酶浓度为4000 15000IU/L，优选 800(Tl3000IU/L。酶活力单位IU定义在25°C下，每分钟内催化1微摩尔底物转化为产物所需的酶量定义为一个酶活力单位IU。本发明的思路为将苏氨酸脱氨酶和亮氨酸脱氢酶固定于可逆溶解性PH敏感高分子载体Eudragit S-100上，制备共固定的固定化多酶体系；同时将醇氧化酶、甲醛脱氢酶和甲酸脱氢酶固定于可逆溶解性PH敏感高分子载体Eudragit S-100上，制备共固定的辅酶再生体系。利用载体的可逆溶解特性，通过调节溶液PH值，控制固定化酶的溶解性，反应时，使酶溶解于反应体系中，提高固定化酶与反应物的有效接触，避免常规水不溶性载体固定化酶与反应物之间的扩散问题，同时提高辅酶的再生效率；反应结束时，使固定化酶从反应体系中析出，回收固定化酶，调高酶的回收再利用率，减少后续的分离步骤，降低生产成本。有益效果本发明将苏氨酸脱氨酶和亮氨酸脱氢酶固定于可逆溶解性pH敏感高分子载体上，形成共固定多酶体系；将醇氧化酶、甲醛脱氢酶和甲酸脱氢酶三种酶固定于可逆溶解性PH敏感高分子载体上，形成共固定辅酶再生体系。利用双固定化多酶体系生产 L-2-氨基丁酸，利用共固定化酶的可逆溶解特征，实现固定化酶与产物的有效分离。本发明所提供的双共固定化酶及其生产L-2-氨基丁酸的方法，具有提高固定化酶与反应物之间的可及性，提高苏氨酸脱氨酶、亮氨酸脱氢酶和醇氧化酶、甲醛脱氢酶、甲酸脱氢酶的回收利用率，提高辅酶再生效率，减少后续分离纯化步骤，简化工艺过程和降低生产成本等优点ο
图1为固定化酶重复使用的回收率。
具体实施例方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。实施例1 苏氨酸脱氨酶和亮氨酸脱氢酶的共固定化多酶体系的制备。将用0. 05mol/L、pH8. 0 磷酸盐缓冲液溶解 Eudragit S-100, Eudragit S-100 浓度为20g/L，按体积比1 1的比例，与含有20IU/mL的苏氨酸脱氨酶和50IU/mL的亮氨酸脱氢酶的酶液充分混合，在25°C、pH8. 0的条件下，温育0. 2小时。温育后，用0. lmol/L的磷酸溶液调节溶液PH低于6. 0，静置2小时，得悬浮液，8000r/min离心30分钟，过滤得到固体微球。按照质量体积比为lg:5mL，加入0. 05mol/L、pH6. 0的磷酸盐缓冲液洗涤微球，悬浮液再SOOOr/min离心30分钟，洗涤过程重复三次，得到共固定化多酶体系，置于4°C保存备用。实施例2 苏氨酸脱氨酶和亮氨酸脱氢酶的共固定化多酶体系的制备
将用 0. 05mol/L、ρΗ8· 0 磷酸盐缓冲液溶解 Eudragit S-100，Eudragit S-100 浓度为20g/L，按体积比1:5的比例，与含有80IU/mL的苏氨酸脱氨酶和90IU/mL的亮氨酸脱氢酶的酶液充分混合，在25°C、pH8. 0的条件下，温育2小时。温育后，用0. lmol/L的磷酸溶液调节溶液PH低于6. 0，静置2小时，得悬浮液，8000r/min离心30分钟，过滤得到固体微球。按照质量体积比为lg:5mL，加入0. 05mol/L、pH 6. 0的磷酸盐缓冲液洗涤微球，悬浮液再SOOOr/min离心30分钟，洗涤过程重复三次，得到共固定化多酶体系，置于4°C保存备用。实施例3 苏氨酸脱氨酶和亮氨酸脱氢酶的共固定化多酶体系的制备
将用 0. 05mol/L、pH8. 0 磷酸盐缓冲液溶解 Eudragit S-100, Eudragit S-100 浓度为20g/L，按体积比1 10的比例，与含有200IU/mL的苏氨酸脱氨酶和150IU/mL的亮氨酸脱氢酶的酶液充分混合，在25°C、pH8. 0的条件下，温育6小时。温育后，用0. lmol/L的磷酸溶液调节溶液PH低于6. 0，静置2小时，得悬浮液，8000r/min离心30分钟，过滤得到固体微球。按照质量体积比为lg:5mL，加入0. 05mol/L、pH6. 0的磷酸盐缓冲液洗涤微球，悬浮液再SOOOr/min离心30分钟，洗涤过程重复三次，得到共固定化多酶体系，置于4°C保存备用。实施例4 醇氧化酶、甲醛脱氢酶和甲酸脱氢酶的共固定化辅酶再生体系的制备将用 0. 05mol/L、ρΗ8· 0 磷酸盐缓冲液溶解 Eudragit S-100，Eudragit S-100 浓度为
20g/L，按体积比1:1的比例，与含有50IU/mL的醇氧化酶、50IU/mL的甲醛脱氢酶和50IU/ mL的甲酸脱氢酶的酶液充分混合，在25°C、pH8. 0的条件下，温育0. 2小时。温育后，用 0. lmol/L的磷酸溶液调节溶液pH低于6. 0，静置2小时，得悬浮液，8000r/min离心30分钟，过滤得到固体微球。按照质量体积比为lg:5mL，加入0. 05mol/L、pH6. 0的磷酸盐缓冲液洗涤微球，悬浮液再SOOOr/min离心30分钟，洗涤过程重复三次，得到共固定化辅酶再生体系，置于4°C保存备用。实施例5 醇氧化酶、甲醛脱氢酶和甲酸脱氢酶的共固定化辅酶再生体系的制备将用 0. 05mol/L、ρΗ8· 0 磷酸盐缓冲液溶解 Eudragit S-100，Eudragit S-100 浓度
为20g/L，按体积比1:6的比例，与含有110IU/mL的醇氧化酶、120IU/mL的甲醛脱氢酶和 120IU/mL的甲酸脱氢酶的酶液充分混合，在25°C、pH8. 0的条件下，温育3小时。温育后， 用0. lmol/L的磷酸溶液调节溶液pH低于6. 0，静置2小时，得悬浮液，8000r/min离心30分钟，过滤得到固体微球。按照质量体积比为lg:5mL，加入0. 05mol/L、pH6. 0的磷酸盐缓冲液洗涤微球，悬浮液再SOOOr/min离心30分钟，洗涤过程重复三次，得到共固定化辅酶再生体系，置于4°C保存备用。实施例6 醇氧化酶、甲醛脱氢酶和甲酸脱氢酶的共固定化辅酶再生体系的制备将用 0. 05mol/L、ρΗ8· O 磷酸盐缓冲液溶解 Eudragit S-100，Eudragit S-100 浓度
为20g/L，按体积比1:10的比例，与含有150IU/mL的醇氧化酶、150IU/mL的甲醛脱氢酶和 150IU/mL的甲酸脱氢酶的酶液充分混合，在25°C、pH8. O的条件下，温育6小时。温育后， 用0. lmol/L的磷酸溶液调节溶液pH低于6. 0，静置2小时，得悬浮液，8000r/min离心30 分钟，过滤得到固体微球。按照质量体积比为lg:5mL，加入0. 05mol/L、pH6. 0的磷酸盐缓冲液洗涤微球，悬浮液再SOOOr/min离心30分钟，洗涤过程重复三次，得到共固定化辅酶再生体系，置于4°C保存备用。实施例7 双固定化多酶体系生产L-2-氨基丁酸
在0. 05mol/L磷酸盐缓冲液中，加入L-苏氨酸，使体系中L-苏氨酸的浓度为30g/L，加入甲醇，使体系中甲醇的质量体积浓度为7g/L，用氨水调节pH值到7.(Γ8.0之间。加入实施例1中制备的共固定化多酶体系，共固定化多酶体系的加入量为苏氨酸脱氨酶5000IU/ L，亮氨酸脱氢酶8000IU/L，加入实施例6中制备的共固定化辅酶再生体系，共固定化辅酶再生体系的加入量为醇氧化酶4000IU/L，甲醛脱氢酶4000IU/L，甲酸脱氢酶4000IU/L，加入氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)，NAD+的加入质量体积浓度为0. 02g/L，反应温度控制在20°C，反应时间6小时。反应后，加入0. lmol/L的磷酸溶液，调节体系的pH低于6.0， 静置2小时，得悬浮液，8000r/min离心30分钟，过滤得到固体微球和上清液，固体微球按照质量体积比为lg:5mL，加入0. 05mol/L、pH6. 0的磷酸盐缓冲液洗涤微球，悬浮液再8000r/ min离心30分钟，洗涤过程重复三次后，加入0. 05mol/L, pH8. 0磷酸盐缓冲液溶解固体微球，溶解的双共固定化多酶体系，置于4°C保存。上清液，经浓缩结晶，烘干得到L-2-氨基丁酸，L-2-氨基丁酸的光学纯度ee值为98. 5%，反应物转化率大于96%，固定化酶回收率为 99%。实施例8 双固定化多酶体系生产L-2-氨基丁酸
在0. 05mol/L磷酸盐缓冲液中，加入L-苏氨酸，使体系中L-苏氨酸的质量体积浓度为 100g/L，加入甲醇，使体系中甲醇的质量体积浓度为25g/L，用氨水调节pH值到7. (Γ8. 0之间。加入实施例2中制备的共固定化多酶体系，共固定化多酶体系的加入量为苏氨酸脱氨酶10000IU/L，亮氨酸脱氢酶13000IU/L，加入实施例5中制备的共固定化辅酶再生体系，共固定化辅酶再生体系的加入量为醇氧化酶11000IU/L，甲醛脱氢酶12000IU/L，甲酸脱氢酶 12000IU/L，加入氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)，NAD+的加入质量体积浓度为0. 06g/ L，反应温度控制在30°C，反应时间30小时。反应后，加入0. lmol/L的磷酸溶液，调节体系的PH低于6. 0，静置2小时，得悬浮液，8000r/min离心30分钟，过滤得到固体微球和上清液，固体微球按照质量体积比为lg:5mL，加入0. 05mol/L、pH6. 0的磷酸盐缓冲液洗涤微球， 悬浮液再8000r/min离心30分钟，洗涤过程重复三次后，加入0. 05mol/L, pH8. 0磷酸盐缓冲液溶解固体微球，溶解的双共固定化多酶体系，置于4°C保存。上清液，经浓缩结晶，烘干得到L-2-氨基丁酸，L-2-氨基丁酸的光学纯度ee值大于99%，反应物转化率大于99%，固定化酶回收率为99. 7%。
实施例9 双固定化多酶体系生产L-2-氨基丁酸
在0. 05mol/L磷酸盐缓冲液中，加入L-苏氨酸，使体系中L-苏氨酸的质量体积浓度为 200g/L，加入甲醇，使体系中甲醇的质量体积浓度为50g/L，用氨水调节pH值到7. (Γ8. 0之间。加入实施例3中制备的共固定化多酶体系，共固定化多酶体系的加入量为苏氨酸脱氨酶15000IU/L，亮氨酸脱氢酶15000IU/L，加入实施例4中制备的共固定化辅酶再生体系，共固定化辅酶再生体系的加入量为醇氧化酶15000IU/L，甲醛脱氢酶15000IU/L，甲酸脱氢酶 15000IU/L，加入氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)，NAD+的加入质量体积浓度为0. 2g/ L,反应温度控制在40°C，反应时间48小时。反应后，加入0. lmol/L的磷酸溶液，调节体系的PH低于6. 0，静置2小时，得悬浮液，8000r/min离心30分钟，过滤得到固体微球和上清液，按照质量体积比为lg:5mL，加入0. 05mol/L、pH6. 0的磷酸盐缓冲液洗涤微球，悬浮液再 8000r/min离心30分钟，洗涤过程重复三次后，加入0. 05mol/L、pH8. 0磷酸盐缓冲液溶解固体微球，溶解的双共固定化多酶体系，置于4°C保存。上清液，经浓缩结晶，烘干得到L-2-氨基丁酸，L-2-氨基丁酸的光学纯度ee值大于98%，反应物转化率大于95%，固定化酶回收率为 98%ο实施例10
实施例8中，溶解的双共固定化多酶体系，加入L-苏氨酸，使体系中L-苏氨酸的质量体积浓度为100g/L，加入甲醇，使体系中甲醇的质量体积浓度为25g/L，用氨水调节pH值到7. (Γ8. 0之间。加入氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)，NAD+的加入质量体积浓度为 0. 06g/L，反应温度控制在30°C，制备L-2-氨基丁酸。结束后，加入0. lmol/L的磷酸溶液， 调节体系的PH低于6. 0，静置2小时，得悬浮液，8000r/min离心30分钟，过滤得到固体微球和上清液，固体微球按照质量体积比为lg:5mL，加入0. 05mol/L、pH6. 0的磷酸盐缓冲液洗涤微球，悬浮液再8000r/min离心30分钟，洗涤过程重复三次后，加入0. 05mol/L、pH8. 0 磷酸盐缓冲液溶解固体微球，溶解的双共固定化多酶体系。以此再重复9次双共固定化多酶体系的回收，每次固定化酶回收率见图1。
权利要求
1. 一种双固定化多酶体系生产L-2-氨基丁酸的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤(1)苏氨酸脱氨酶和亮氨酸脱氢酶的共固定化多酶体系的制备(Ia)可逆溶解性pH敏感高分子载体溶液与含有苏氨酸脱氨酶和亮氨酸脱氢酶的酶液充分混合，在25°C、pH 8. 0的条件下，温育0. 2飞小时；(Ib)温育结束后，用0. lmol/L的磷酸溶液调节溶液pH低于6. 0，静置2、小时，得悬浮液，离心后得到固体微球，用0. 05mol/L、pH6. 0的磷酸盐缓冲液洗涤微球，洗涤悬浮液离心后得到固体微球，重复洗涤离心过程2 3次，得到共固定化多酶体系，置于4°C保存备用；(2)醇氧化酶、甲醛脱氢酶和甲酸脱氢酶的共固定化辅酶再生体系的制备(2a)可逆溶解性pH敏感高分子载体溶液与含有醇氧化酶、甲醛脱氢酶和甲酸脱氢酶的酶液充分混合，在25°C、pH 8. 0的条件下，温育0. 2飞小时；(2b)温育结束后，用0. lmol/L的磷酸溶液调节溶液pH低于6. 0，静置2、小时，得悬浮液，离心后得到固体微球，用0. 05mol/L、pH6. 0的磷酸盐缓冲液洗涤微球，洗涤悬浮液离心后得到固体微球，重复洗涤离心过程2 3次，得到共固定化辅酶再生体系，置于4°C保存(3)利用共固定化多酶体系和共固定化辅酶再生体系生产L-2-氨基丁酸 (3a)将L-苏氨酸和甲醇溶解于0. 05mol/L磷酸盐缓冲液中，用氨水调节pH值到 7. 0 8. 0之间，L-苏氨酸的加入量为3(T200g/L，甲醇的加入量为7 50g/L ；(3b)向步骤(3a)得到的体系中加入步骤(Ib)得到的共固定化多酶体系和步骤Ob) 得到的共固定化辅酶再生体系，再加入氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的加入量为0. 02 0. 2g/L，在2(T40°C下反应6 48小时；(3c)步骤(3b)反应结束后，用0. lmol/L的磷酸溶液调节体系的pH低于6.0，静置2、 小时，得悬浮液，离心后得到固体微球和上清液；(3d)步骤(3c)得到的固体微球，用0. 05mol/L、pH6. 0的磷酸盐缓冲液洗涤微球，洗涤悬浮液离心后得到固体微球，重复洗涤离心过程2 3次，最后加入0. 05mol/L、pH8. 0的磷酸盐缓冲液溶解固体微球，以备下次使用；(3e)步骤(3c)得到的上清液，经浓缩结晶，烘干得到L-2-氨基丁酸。
2.根据权利要求1所述的双固定化多酶体系生产L-2-氨基丁酸的方法，其特征在于， 步骤(Ia)和Oa)中，所述的可逆溶解性pH敏感高分子载体为Eudragit S-IOO0
3.根据权利要求1所述的双固定化多酶体系生产L-2-氨基丁酸的方法，其特征在于， 步骤(Ia)中，所述的可逆溶解性PH敏感高分子载体溶液中，可逆溶解性pH敏感高分子载体浓度为20g/L，溶剂为0. 05mol/L、pH 8. 0磷酸盐缓冲液；所述的含有苏氨酸脱氨酶和亮氨酸脱氢酶的酶液中，苏氨酸脱氨酶的浓度为20 200IU/L，亮氨酸脱氢酶的浓度为50 150IU/L，以0. 05mol/L、pH 8. 0的磷酸盐缓冲液为溶剂配制酶液；可逆溶解性pH敏感高分子载体溶液与含有苏氨酸脱氨酶和亮氨酸脱氢酶的酶液体积比为1:广10。
4.根据权利要求1所述的双固定化多酶体系生产L-2-氨基丁酸的方法，其特征在于，步骤Oa)中，所述的可逆溶解性pH敏感高分子载体溶液中，可逆溶解性pH敏感高分子载体浓度为20g/L，溶剂为0. 05mol/L、pH 8. 0磷酸盐缓冲液；所述的含有醇氧化酶、甲醛脱氢酶和甲酸脱氢酶的酶液中，醇氧化酶的浓度为5(T150IU/L，甲醛脱氢酶的浓度为50 150IU/L，甲酸脱氢酶的浓度为50 150IU/L，以0. 05mol/L、pH 8. 0的磷酸盐缓冲液为溶剂配制酶液；可逆溶解性PH敏感高分子载体溶液与含有醇氧化酶、甲醛脱氢酶和甲酸脱氢酶的酶液体积比为1:广10。
5.根据权利要求1所述的双固定化多酶体系生产L-2-氨基丁酸的方法，其特征在于，步骤(3b)中，共固定化多酶体系加入量控制苏氨酸脱氨酶浓度为5000 15000IU/L， 亮氨酸脱氢酶浓度为8000 15000IU/L ；共固定化辅酶再生体系加入量控制醇氧化酶浓度为4000 15000IU/L，甲醛脱氢酶浓度为4000 15000IU/L，甲酸脱氢酶浓度为4000 15000IU/L。
全文摘要
本发明公开了一种双固定化多酶体系生产L-2-氨基丁酸的方法，将苏氨酸脱氨酶和亮氨酸脱氢酶固定于可逆溶解性pH敏感高分子载体上，形成共固定多酶体系；将醇氧化酶、甲醛脱氢酶和甲酸脱氢酶三种酶固定于可逆溶解性pH敏感高分子载体上，形成共固定辅酶再生体系。利用双固定化多酶体系生产L-2-氨基丁酸，利用共固定化酶的可逆溶解特征，实现固定化酶与产物的有效分离。本发明所提供的双共固定化酶及其生产L-2-氨基丁酸的方法，具有提高固定化酶与反应物之间的可及性，提高苏氨酸脱氨酶、亮氨酸脱氢酶和醇氧化酶、甲醛脱氢酶、甲酸脱氢酶的回收利用率，提高辅酶再生效率，减少后续分离纯化步骤，简化工艺过程和降低生产成本等优点。
文档编号C12N11/18GK102517351SQ201110436859
公开日2012年6月27日 申请日期2011年12月23日 优先权日2011年12月23日
发明者李鑫 申请人:李鑫