固定化双酶在反胶束体系中催化油酸酯化反应的应用的制作方法
【专利摘要】一种固定化双酶在反胶束体系中催化油酸酯化反应的应用，包括以下步骤：纤维素酶和脂肪酶经共固定化得到固定化双酶；将固定化双酶与反胶束体系混合，加入油酸和有机醇进行水浴振荡得到酯化产物。本发明采用将纤维素酶和脂肪酶进行共固定化应用于油酸酯化反应，可显著提高油酸酯化反应的速率、提升酯化产物的收率，具有反应条件温和，酶活力回收较高，固定化酶半衰期长，操作简便、成本低廉，清洁安全等优势。
【专利说明】固定化双酶在反胶束体系中催化油酸酯化反应的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及环境保护【技术领域】，尤其涉及一种固定化双酶在反胶束体系中催化油 酸酯化反应中的应用。
【背景技术】
[0002] 目前，大量废弃的油酸类生物质资源严重影响了生态环境，将油酸进行有效酯化 生成油酸乙酯可实现废弃资源的回收利用，具有较高的应用前景。油酸乙酯是一种高级脂 肪酸醇酯，广泛应用于化工、纺织、医药等领域。自然界中的油酸乙酯含量少、收集困难，难 以满足人类生产和生活的需要。传统的油酸乙酯的制备方法主要采用酸碱催化合成，需要 在高温、高压及强酸、强碱的环境下进行，存在副反应多、生产成本高、而且油酸碳链较长、 反应难度大，酯化速率低等问题。
[0003] 国内外提出了一种采用酶催化油酸酯化反应的方法，将酶置于反胶束体系中，由 于反胶束体系是油水两相物质借助表面活性剂而形成的油包水体系，酶和其他亲水物质可 通过螯合作用进入水相中，较好的避免了酶和有机物接触造成酶活性的损失，为酶创造性 了适宜的微环境。这种催化方法操作简便，生产成本低，较大程度的提高了油酸酯化反应的 速率。由于酶在水相中处于游离状态，而油酸乙酯的合成反应中的原料乙醇为油水双亲物 质，可透过表面活性剂膜进入水相，与酶接触并使酶蛋白质变性，导致酶的性质不够稳定， 不能保证油酸的酯化进程。同时游离酶对环境敏感、容易失活，且存在无法回收，反应成本 _，- 次污染等问题。
[0004] 固定化酶的研究和应用是实现酶的重复使用和稳定性改善的有效手段，与只能使 用一次的游离酶相比较，固定化酶具有游离酶的催化特性，又具有稳定性好、可反复利用等 优点。1970年Mosbach建立了固定化多酶体系，实现了固定化酶体系的共固定和共反应。 近年来，随着酶工程技术的发展，在单酶固定化技术的基础上又建立了多酶共固定化技术， 多酶共固定化体系拥有固定化酶的高稳定性和连续操作能力，又具有多酶的协同作用，该 技术展现了十分广阔的应用前景。反胶束体系中酶活性的有效保持和高效酶催化反应的实 现为酶的酯化提供了又一个平台。但现有的酶固定化材料主要是硅胶、壳聚糖等，这些固定 化材料在实际使用中还不同程度存在缺陷，如以硅胶等无机材料作为固定化载体，存在与 水体分离、表面与所固定化的酶键合不紧密等缺陷；而壳聚糖等存在加工复杂、性质不稳定 等缺陷。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种反应条件温和，酶活 力回收较高，催化速率快，固定化酶半衰期长，操作简便、成本低廉，清洁安全的催化油酸酯 化的方法，具体提供了一种固定化双酶在反胶束体系中催化油酸酯化反应的应用。
[0006] 为解决上述技术问题，提供了一种固定化双酶在反胶束体系中对油酸酯化中的应 用，包括以下步骤：
[0007] S1、纤维素酶和脂肪酶经共固定化得到固定化双酶；
[0008] S2、将前述固定化双酶与反胶束体系混合，加入油酸和有机醇进行水浴振荡得到 酯化产物。
[0009] 进一步的，S1步骤具体还包括以下步骤：
[0010] S1. 1、将前述纤维素酶固定到生物碳中得到固定化纤维素酶；
[0011] S1. 2、将前述脂肪酶固定在前述固定化纤维素酶中得到固定化双酶。
[0012] 进一步的，S1. 1步骤具体为：将纤维素酶加入缓冲液中得到含纤维素酶的缓冲 液，将生物碳置于前述含有纤维素酶的缓冲液中进行水浴振荡步骤得到固定化纤维素酶。 优选的，将纤维素酶加入磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中得到含纤维素酶的缓冲液。前述磷 酸氢二钠-柠檬酸缓冲液pH为2?8。进一步优选的，磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液pH为 3 〇
[0013] 进一步的，S1. 2步骤具体为：将脂肪酶加入缓冲液中得到含脂肪酶的缓冲液；将 前述固定化纤维素酶置于前述含有脂肪酶的缓冲液中进行水浴振荡步骤得到前述固定化 双酶。优选的，将纤维素酶加入磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中得到含纤维素酶的缓冲液。前 述的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液pH为2?8。进一步优选的，磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液 pH 为 7。
[0014] 进一步的，纤维素酶与缓冲液的重量体积比优选为0. 1?0. 4mg/ml ;脂肪酶与缓 冲液的重量体积比优选为〇. 1?〇. 4mg/ml ;生物碳与含纤维素酶的缓冲液的重量体积比 优选为0. 25 : 5?100g/ml ;固定化纤维素酶与含脂肪酶的缓冲液的重量体积比优选为 0. 25 ?5 : 5 ?100g/ml。
[0015] 进一步的，前述生物碳的制备方法为：以玉米芯在真空环境下热解得到。前述制备 方法制备得到的生物碳在用于纤维素酶固定化之前还包括活化步骤，前述活化步骤具体包 括：将生物碳依次用95%乙醇、5% HCL和5% NaOH溶液浸泡，然后抽滤，蒸馏水冲洗至中 性，冷藏干燥得到活化生物碳，将活化生物碳用于前述固定化双酶的制备。
[0016] 进一步的，前述反胶束体系包括鼠李糖脂、异辛烷和正己醇。
[0017] 进一步的，前述反胶束体系的临界胶束浓度为20?100CMC。
[0018] 进一步的，前述有机醇优选为具有C1?C10碳链长度的一元有机醇；进一步优选 为乙醇、正丙醇或丁醇。
[0019] 进一步的，油酸和有机醇的摩尔浓度比优选为2?7 : 1。
[0020] 进一步的，油酸与反胶束体系的体积配比优选为0. 001?0. 002 : 1。
[0021] 进一步的，水浴振荡的温度优选为25?65 °C，进一步的优选为55 °C。
[0022] 与现有技术相比，本发明的优点在于：
[0023] (1)本发明采用纤维素酶和脂肪酶进行共固定化制得固定化双酶，并在反胶束体 系中对油酸进行酯化反应。由于将酶进行固定化，相比于游离酶，其稳定性更好，不像游离 酶对反应条件要求那样苛刻；另一方面，固定化酶可从反胶束体系中分离，进行回收利用， 可回收次数达到十次以上，大大降低了生产成本。同时采用纤维素酶和脂肪酶联合作用对 油酸进行催化反应，利用酶分子间的作用力，先将纤维素酶固定在生物碳中得到固定化纤 维素酶，然后在固定化纤维素酶的基础上再进行脂肪酶的固定，脂肪酶对油酸起催化作用， 而纤维素酶可以提高脂肪酶的固定化程度，将脂肪酶的活性更大化利用，较大程度的提高 了催化效率，酯化速率最高可达〇.43mmol/L · min · mg，产物收率可达60%;具有反应效 率高，生产条件温和，成本低，生产设备简单等优点。
[0024] (2)以玉米芯为原料构成的生物碳作为纤维素酶与脂肪酶的固定化载体，具有良 好的生物相容性。同时，生物碳在自然界中可完全降解为二氧化碳和水，并不会对环境造成 二次污染。
[0025] (3)本发明采用的反胶束采用由鼠李糖脂、异辛烷和正己醇构成的反胶束体系，是 选用生物表面活性剂（Biosurfactant，简称BS)制备得到，能够在低浓度下达到临界胶束 浓度，对物质的包容性更大，无环境污染问题。
【专利附图】
【附图说明】
[0026] 为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例 中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。
[0027] 图1为本发明实施例1中酯化方法的流程图。
[0028] 图2为本发明实施例1、对比例1至5中纤维素酶和脂肪酶的酶活力检测结果图。
[0029] 图3为本发明实施例1中固定化双酶的最适水浴震荡温度分析图。
[0030] 图4为本发明实施例1中固定化双酶的最适临界胶束浓度分析图。
[0031] 图5为本发明实施例1中固定化双酶分别在反胶束与有机溶剂中对比分析图。
[0032] 图6为本发明实施例1中固定化双酶操作稳定性分析图。
【具体实施方式】
[0033] 以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而 限制本发明的保护范围。
[0034] 以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。
[0035] 实施例1
[0036] 参见图1，一种固定化双酶在反胶束体系中催化油酸酯化反应的应用，包括以下步 骤：
[0037] (1)生物碳的制备：取玉米芯100g，放入干燥炉中以105°C干燥18h。取出干燥 好的玉米芯切成体积为2X3X3cm 3的玉米芯块，将玉米芯块放入真空气氛管式电炉中，以 10°C /min的速率升温到450°C，然后在450°C维持45min，再冷却至室温得到生物碳。将生 物碳研磨，过100目筛得到生物碳粉。
[0038] (2)生物碳活化：称取10g步骤（1)中制备得到的生物碳粉于锥形瓶中，用体积分 数为95%的乙醇浸泡24h，真空抽滤取滤渣，用1L蒸馏水冲洗。将冲洗后的滤渣用25ml体 积分数为5 %的HCL浸泡4h。将HCL浸泡后的生物碳粉经真空抽滤、蒸馏水冲洗后再用25ml 体积分数为5%的NaOH溶液浸泡4h，再进行真空抽滤，将滤渣用蒸馏水冲洗至中性，于4°C 下干燥4h得到活化生物碳。
[0039] (3)纤维素酶固定化：取10mg纤维素酶加入到100ml pH为3的磷酸氢二钠-柠 檬酸缓冲液中制得含纤维素酶的缓冲液；取5ml含纤维素酶的缓冲液（纤维素酶浓度是 0. lmg/ml)加入0.25g步骤（2)中得到的活化生物碳，在30°C的恒温水浴振荡器（振荡频 率为150r/min)中振荡吸附两小时，然后进行真空抽滤，取滤渔用100ml pH为3的磷酸氢 二钠-柠檬酸缓冲液冲洗得到固定化纤维素酶。
[0040] (4)脂肪酶固定化：取l〇mg脂肪酶加入到100ml pH为7的磷酸氢二钠 -柠檬酸 缓冲液中制得含脂肪酶的缓冲液；取5ml含有脂肪酶的缓冲液（脂肪酶浓度是0. lmg/ml) 加入0.25g步骤（3)制备得到的固定化纤维素酶中，在30°C的恒温水浴振荡器（振荡频率 为150r/min)中振荡吸附两小时，然后进行真空抽滤，取滤渔用100ml pH为7的磷酸氢二 钠-柠檬酸缓冲液冲洗得到固定化双酶。
[0041] 取1.5mg前述的固定化双酶溶于体积为10ml、CMC为60的由鼠李糖脂-异辛 烷-正己醇组成的反胶束体系中；其中，水/鼠李糖脂的摩尔比（wj为40。然后向反胶束 酶体系中加入20μ 1浓度为20mmol/L的油酸和体积为10μ 1浓度为10mm〇l/L的乙醇，混 匀后放入水浴振荡箱，以55°C，150rpm的条件下进行酯化反应一小时。
[0042] 酯化反应完成后将反应产物进行真空抽滤，用蒸馏水冲洗固定化双酶，直至中性。 冲洗完毕的固定化双酶干燥保存还可继续用于下一批酯化反应。
[0043] 实施例2
[0044] 一种固定化双酶在反胶束体系中催化油酸酯化反应的应用，包括以下步骤：
[0045] (1)生物碳的制备：取玉米芯100g，放入干燥炉中以105°C干燥18h。取出干燥 好的玉米芯切成体积为2X3X3cm 3的玉米芯块，将玉米芯块放入真空气氛管式电炉中，以 10°C /min的速率升温到450°C，然后在450°C维持45min，再冷却至室温得到生物碳。将生 物碳研磨，过100目筛得到生物碳粉。
[0046] (2)生物碳活化：称取10g步骤（1)中制备得到的生物碳粉于锥形瓶中，用体积分 数为95%的乙醇浸泡24h，真空抽滤取滤渣，用1L蒸馏水冲洗。将冲洗后的滤渣用25ml体 积分数为5 %的HCL浸泡4h。将HCL浸泡后的生物碳粉经真空抽滤、蒸馏水冲洗后再用25ml 体积分数为5%的NaOH溶液浸泡4h，再进行真空抽滤，将滤渣用蒸馏水冲洗至中性，于4°C 下干燥4h得到活化生物碳。
[0047] (3)纤维素酶固定化：取20mg纤维素酶加入到100ml pH为3的磷酸氢二钠-柠 檬酸缓冲液中制得含纤维素酶的缓冲液；取50ml含纤维素酶的缓冲液（纤维素酶浓度是 0.2mg/ml)加入0.25g步骤（2)中得到的活化生物碳，在30°C的恒温水浴振荡器（振荡频 率为150r/min)中振荡吸附两小时，然后进行真空抽滤，取滤渔用100ml pH为3的磷酸氢 二钠-柠檬酸缓冲液冲洗得到固定化纤维素酶。
[0048] (4)脂肪酶固定化：取20mg脂肪酶加入到100ml pH为7的磷酸氢二钠-柠檬酸缓 冲液中制得含脂肪酶的缓冲液；取l〇〇ml含有脂肪酶的缓冲液（脂肪酶浓度是0. 2mg/ml) 加入0.25g步骤（3)制备得到的固定化纤维素酶中，在30°C的恒温水浴振荡器（振荡频率 为150r/min)中振荡吸附两小时，然后进行真空抽滤，取滤渔用100ml pH为7的磷酸氢二 钠-柠檬酸缓冲液冲洗得到固定化双酶。
[0049] 取1.5mg前述的固定化双酶溶于体积为10ml、CMC为20的由鼠李糖脂-异辛 烷-正己醇组成的反胶束体系中；其中，水/鼠李糖脂的摩尔比（wj为40。然后向反胶束 酶体系中加入1〇μ 1浓度为70mmol/L的油酸和体积为10μ 1浓度为10mm〇l/L的乙醇，混 匀后放入水浴振荡箱，以55°C，150rpm的条件下进行酯化反应一小时。
[0050] 实施例3
[0051] 一种固定化双酶在反胶束体系中催化油酸酯化反应的应用，包括以下步骤：
[0052] (1)生物碳的制备：取玉米芯100g，放入干燥炉中以105°C干燥18h。取出干燥 好的玉米芯切成体积为2X3X3cm 3的玉米芯块，将玉米芯块放入真空气氛管式电炉中，以 10°C /min的速率升温到450°C，然后在450°C维持45min，再冷却至室温得到生物碳。将生 物碳研磨，过100目的筛得到生物碳粉。
[0053] (2)生物碳活化：称取10g步骤（1)中制备得到的生物碳粉于锥形瓶中，用体积分 数为95%的乙醇浸泡24h，真空抽滤取滤渣，用1L蒸馏水冲洗。将冲洗后的滤渣用25ml体 积分数为5 %的HCL浸泡4h。将HCL浸泡后的生物碳粉经真空抽滤、蒸馏水冲洗后再用25ml 体积分数为5%的NaOH溶液浸泡4h，再进行真空抽滤，将滤渣用蒸馏水冲洗至中性，于4°C 下干燥4h得到活化生物碳。
[0054] (3)纤维素酶固定化：取40mg纤维素酶加入到100ml pH为2的磷酸氢二钠-柠 檬酸缓冲液中制得含纤维素酶的缓冲液；取l〇〇ml含纤维素酶的缓冲液（纤维素酶浓度是 0.4mg/ml)加入0.25g步骤（2)中得到的活化生物碳，在30°C的恒温水浴振荡器（振荡频 率为150r/min)中振荡吸附两小时，然后进行真空抽滤，取滤渔用100ml pH为2的磷酸氢 二钠-柠檬酸缓冲液冲洗得到固定化纤维素酶。
[0055] (4)脂肪酶固定化：取40mg脂肪酶加入到100ml pH为8的磷酸氢二钠 -柠檬酸 缓冲液中制得含脂肪酶的缓冲液；取5ml含有脂肪酶的缓冲液（脂肪酶浓度是0. 4mg/ml) 加入5g步骤（3)制备得到的固定化纤维素酶中，在30°C的恒温水浴振荡器（振荡频率 为150r/min)中振荡吸附两小时，然后进行真空抽滤，取滤渔用100ml pH为7的磷酸氢二 钠-柠檬酸缓冲液冲洗得到固定化双酶。
[0056] 取1.5mg前述的固定化双酶溶于体积为10ml、CMC为100的由鼠李糖脂-异辛 烷-正己醇组成的反胶束体系中；其中，水/鼠李糖脂的摩尔比（wj为40。然后向反胶束 酶体系中加入20μ 1浓度为40mmol/L的油酸和体积为10μ 1浓度为10mm〇l/L的乙醇，混 匀后放入水浴振荡箱，以45°C，150rpm的条件下进行酯化反应一小时。
[0057] 酯化反应完成后将反应产物进行真空抽滤，用蒸馏水冲洗固定化双酶，直至中性。 冲洗完毕的固定化双酶干燥保存还可继续进行下一批酯化反应。
[0058] 对比例1
[0059] -种固定化双酶在反胶束体系中催化油酸酯化反应的应用，包括以下步骤：
[0060] (1)取l〇mg脂肪酶加入到100ml pH为7的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中制得含 脂肪酶的缓冲液；取5ml含有脂肪酶的缓冲液（脂肪酶浓度是0. lmg/ml)加入0. 25g实施 例1制备的活化生物碳，在30°C的恒温水浴振荡器（振荡频率为150r/min)中振荡吸附两 小时，然后进行真空抽滤，取滤渣用l〇〇ml pH为7的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液冲洗得到 固定化脂肪酶。
[0061] (2)取10mg纤维素酶加入到100ml pH为3的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中制得 含纤维素酶的缓冲液；取5ml含纤维素酶的缓冲液（纤维素酶浓度是0. lmg/ml)加入0. 25g 步骤（1)的固定化脂肪酶，在30°C的恒温水浴振荡器（振荡频率为150r/min)中振荡吸附 两小时，然后进行真空抽滤，取滤渣用l〇〇ml pH为3的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液冲洗得 到固定化双酶。
[0062] (3)取1. 5mg前述的固定化双酶溶于体积为10ml、CMC为60的由鼠李糖脂-异辛 烷-正己醇组成的反胶束体系中；其中，水/鼠李糖脂的摩尔比（wj为40。然后向反胶束 酶体系中加入20μ 1浓度为20mmol/L的油酸和体积为ΙΟμ 1浓度为10mm〇l/L的乙醇，混 匀后放入水浴振荡箱，以55°C，150rpm的条件下进行酯化反应一小时。
[0063] 对比例2
[0064] 一种固定化双酶在反胶束体系中催化油酸酯化反应的应用，包括以下步骤：
[0065] (1)取10mg脂肪酶加入到100ml pH为7的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中制得含 脂肪酶的缓冲液；取5ml含有脂肪酶的缓冲液（脂肪酶浓度是0. lmg/ml)加入0. 25g实施 例1制备的活化生物碳，在30°C的恒温水浴振荡器（振荡频率为150r/min)中振荡吸附两 小时，然后进行真空抽滤，取滤渣用l〇〇ml pH为7的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液冲洗得到 固定化脂肪酶。
[0066] (2)取10mg纤维素酶加入到100ml pH为7的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中制得 含纤维素酶的缓冲液；取5ml含纤维素酶的缓冲液（纤维素酶浓度是0. lmg/ml)加入0. 25g 步骤（1)的固定化脂肪酶，在30°C的恒温水浴振荡器（振荡频率为150r/min)中振荡吸附 两小时，然后进行真空抽滤，取滤渣用l〇〇ml pH为7的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液冲洗得 到固定化双酶。
[0067] (3)取1. 5mg前述的固定化双酶溶于体积为10ml、CMC为60的由鼠李糖脂-异辛 烷-正己醇组成的反胶束体系中；其中，水/鼠李糖脂的摩尔比（wj为40。然后向反胶束 酶体系中加入20μ 1浓度为20mmol/L的油酸和体积为10μ 1浓度为10mm〇l/L的乙醇，混 匀后放入水浴振荡箱，以55°C，150rpm的条件下进行酯化反应一小时。
[0068] 对比例3
[0069] 一种固定化双酶在反胶束体系中催化油酸酯化反应的应用，包括以下步骤：
[0070] (1)取l〇mg纤维素酶加入到100ml pH为3的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中制得 含纤维素酶的缓冲液；取5ml含纤维素酶的缓冲液（纤维素酶浓度是0. lmg/ml)加入0. 25g 实施例1制备的活化生物碳，在30°C的恒温水浴振荡器（振荡频率为150r/min)中振荡吸 附两小时，然后进行真空抽滤，取滤渣用l〇〇ml pH为3的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液冲洗 得到固定化纤维素酶。
[0071] ⑵取l〇mg脂肪酶加入到100ml pH为3的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中制得含 脂肪酶的缓冲液；取5ml含有脂肪酶的缓冲液（脂肪酶浓度是0. lmg/ml)加入0. 25g步骤 (1)的固定化纤维素酶，置于中，在30°C的恒温水浴振荡器（振荡频率为150r/min)中振荡 吸附两小时，然后进行真空抽滤，取滤渣用l〇〇ml pH为3的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液冲 洗得到固定化双酶。
[0072] (3)取1. 5mg前述的固定化双酶溶于体积为10ml、CMC为60的由鼠李糖脂-异辛 烷-正己醇组成的反胶束体系中；其中，水/鼠李糖脂的摩尔比（wj为40。然后向反胶束 酶体系中加入20μ 1浓度为20mmol/L的油酸和体积为10μ 1浓度为10mm〇l/L的乙醇，混 匀后放入水浴振荡箱，以55°C，150rpm的条件下进行酯化反应一小时。
[0073] 对比例4
[0074] -种固定化双酶在反胶束体系中催化油酸酯化反应的应用，包括以下步骤：
[0075] (1)取10mg脂肪酶加入到100ml pH为7的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中制得含 脂肪酶的缓冲液；取5ml含有脂肪酶的缓冲液（脂肪酶浓度是0. lmg/ml)加入0. 25g实施 例1的活化生物碳，在30°C的恒温水浴振荡器（振荡频率为150r/min)中振荡吸附两小时， 然后进行真空抽滤，取滤渣用l〇〇ml pH为7的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液冲洗得到固定化 脂肪酶。
[0076] (2)取1. 5mg前述的固定化脂肪酶溶于体积为10ml、CMC为60的由鼠李糖脂-异 辛烷-正己醇组成的反胶束体系中；其中，水/鼠李糖脂的摩尔比（wj为40。然后向反胶 束酶体系中加入20μ 1浓度为20mmol/L的油酸和体积为10μ 1浓度为10mm〇l/L的乙醇， 混匀后放入水浴振荡箱，以35°C，150rpm的条件下进行酯化反应一小时。
[0077] 对比例5
[0078] -种固定化双酶在反胶束体系中催化油酸酯化反应的应用，包括以下步骤：
[0079] (1)取lOOcmc的鼠李糖脂60ml，加入20ml的异辛烷与20ml的正己醇，得临界胶 束浓度（CMC)为60的由鼠李糖脂（RL)-异辛烷-正己醇溶液构成的反胶束体系。
[0080] ⑵取l〇mg纤维素酶加入到100ml pH为3的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中制得 含纤维素酶的缓冲液；取5ml含纤维素酶的缓冲液（纤维素酶浓度是0. lmg/ml)加入0. 25g 实施例1的活化生物碳直于中，在30 C的恒温水浴振汤器（振汤频率为150r/min)中振汤 吸附两小时，然后进行真空抽滤，取滤渣用l〇〇ml pH为3的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液冲 洗得到固定化纤维素酶。
[0081] (3)取1. 5mg前述的固定化纤维素酶溶于体积为10ml、CMC为60的由鼠李糖脂-异 辛烷-正己醇组成的反胶束体系中；其中，水/鼠李糖脂的摩尔比（WJ为40。然后向反胶 束酶体系中加入20μ 1浓度为20mmol/L的油酸和体积为10μ 1浓度为10mm〇l/L的乙醇， 混匀后放入水浴振荡箱，以45°C，150rpm的条件下进行酯化反应一小时。
[0082] 油酸酯化反应后的固定化双酶、固定化纤维素酶、固定化脂肪酶经过滤、洗涤、干 燥处理，可继续用于油酸酯化反应。前述的反胶束体系的临界胶束浓度还可以为20? 100CMC，油酸和C1?C10有机醇的摩尔浓度比为2?7 : 1 ;油酸与反胶束体系的体积配 比为0.001?0.002 : 1。前述加入的乙醇可替换成任一具有C1?C10碳链长度的一元有 机醇，为了提高酯化反应速率，乙醇可以替换成正丙醇或丁醇。
[0083] 油酸酯化速率和油酸乙酯的生成量的测定：
[0084] 在前述酯化反应过程中，酯化反应开始后，每隔10分钟，取1ml酯化反应产物于锥 形瓶中，加入lml的醋酸铜（醋酸铜通过吡啶调节pH为6. 1)和5ml的苯，混匀后以3000r/ min转速离心5分钟，离心后静置分层，取上层有机相在紫外分光光度计（548nm波长）中测 量油酸的酯化速率。
[0085] 酯化反应进行1小时后，向锥形瓶中加入5ml的乙醇和丙酮混合液（乙醇与丙酮 的体积比按1 : 1)终止反应，再加入〇.〇375g的邻苯二甲酸二乙酯，均匀振荡，静置分层。 用5ml的注射器取锥形瓶中的油相，通过0. 22 μ 1的有机相过滤膜进行过滤得到待测溶液。 将待测溶液盛于lml进样瓶进行气相色谱分析。根据气相色谱分析得到的峰面积确定油酸 乙酯的生成量。测量结果列于表1中。
[0086] 表1 :酯化速率和产物收率结果表
[0087]
【权利要求】
1. 一种固定化双酶在反胶束体系中催化油酸酯化反应的应用，其特征在于，包括以下 步骤： 51 :纤维素酶和脂肪酶经共固定化得到固定化双酶； 52 :将所述固定化双酶与反胶束体系混合，加入油酸和有机醇进行水浴振荡得到酯化 产物。
2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述S1步骤具体还包括以下步骤： S1-1 :将所述纤维素酶固定到生物碳中得到固定化纤维素酶； S1-2 :将所述脂肪酶固定在所述固定化纤维素酶中得到所述固定化双酶。
3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述S1-1步骤具体为：将所述纤维素酶 加入缓冲液中得到含纤维素酶的缓冲液，将生物碳置于所述含有纤维素酶的缓冲液中进行 水浴振荡步骤得到所述固定化纤维素酶。
4. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述S1-2步骤具体为：将所述脂肪酶加 入缓冲液中得到含脂肪酶的缓冲液；将所述固定化纤维素酶置于所述含有脂肪酶的缓冲液 中进行水浴振荡步骤得到所述固定化双酶。
5. 根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述缓冲液为pH2?8磷酸氢二 钠-柠檬酸缓冲液；所述纤维素酶与所述缓冲液的重量体积比为〇. 1?〇. 4mg/ml ;所述脂 肪酶与缓冲液的重量体积比为〇. 1?〇. 4mg/ml ;所述生物碳与含纤维素酶的缓冲液的重量 体积比为0. 25 : 5?100g/ml ;所述固定化纤维素酶与含脂肪酶的缓冲液的重量体积比为 0. 25 ?5 : 5 ?100g/ml。
6. 根据权利要求2至4中任一项所述的应用，其特征在于，所述生物碳的制备方法为： 将玉米芯在真空环境下热解得到所述生物碳。
7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述生物碳的制备方法还包括活化步骤： 将所述生物碳依次用95%乙醇、5% HCL和5% NaOH溶液浸泡，然后抽滤、蒸馏水冲洗至中 性、冷藏干燥得到活化生物碳。
8. 根据权利要求1至4中任一项所述的应用，其特征在于，所述反胶束体系包括鼠李糖 月旨、异辛烷和正己醇，所述有机醇为具有C1?C10碳链长度的一元有机醇。
9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述反胶束体系的临界胶束浓度为20? 100CMC，所述有机醇为乙醇、正丙醇、丁醇中的一种。
10. 根据权利要求1至4中任一项所述的应用，其特征在于，所述油酸和有机醇的摩尔 浓度比为2?7 : 1;油酸与反胶束体系的体积配比为0.001?0.002 : 1;所述水浴振荡 的温度为25?65°C。
【文档编号】C12N11/14GK104120156SQ201410352463
【公开日】2014年10月29日 申请日期:2014年7月23日 优先权日:2014年7月23日
【发明者】袁兴中, 包姗, 彭馨, 刘欢, 马玉洁, 吴秀莲, 吴志斌, 曾光明 申请人:湖南大学