专利名称：纳米凝胶固定化多酶体系的制备及在1,3-丙二醇合成中的应用的制作方法
技术领域：
本发明是一种纳米凝胶固定化多酶体系的制备及其在1，3_丙二醇(1，3_PD)合成 中的应用，通过制备在水溶液中均勻分散的纳米凝胶悬浮液，使用分散-吸附固定化技术， 构建纳米凝胶_多酶组装体系，多酶偶联催化合成1，3-PD。该方法能有效抑制团聚，提高分 散性，形成均勻而稳定的纳米凝胶悬浮液，发挥纳米载体高比表面等优异性能，既为同时偶 联多种生物酶即多酶固定提供场所，又减小载体对底物和产物的扩散影响。使用纳米凝胶 固定化多酶体系催化合成1，3-PD，较微生物发酵法等具有成本低，反应简单，无细胞污染， 不易被微生物降解等优点。属于1，3-PD的纳米凝胶固定化酶催化合成技术领域。
背景技术：
生物基多元醇1，3_丙二醇(简称1，3_PD)是一种重要的平台化合物，以1，3_PD 为单体合成的新型形状记忆纤维材料Sorona ，是目前合成纤维新品种开发的热点。微生物发酵甘油生产1，3_PD主要利用氧化与还原途径偶联进行催化转化。细胞 内的氧化途径和还原途径是通过NADH2/NAD+以及能量ATP/ADP偶联在一起的。在氧化途径 中，通过甘油脱氢酶(⑶H，EC 1. 1. 1. 6)把甘油氧化成二羟基丙酮(DHA)，同时生成还原当 量NADH2。在还原途径中，甘油在以维生素B12为辅酶的甘油脱水酶(⑶Ht，EC 4. 2. 1.30)的 作用下转化成3-羟基丙醛(3-HPA)，而3-HPA在氧化还原酶(PD0R，EC 1. 1. 1. 202)的作用 下被还原成1，3-PD，NADH2作为1，3-PD氧化还原酶的电子供体，还原3-HPA合成1，3-PD。 催化过程伴随着辅酶I的自身偶联再生。将⑶H、⑶Ht、PDOR等关键酶固定化，偶联酶法生产1，3_PD，就是利用两个平行的 氧化还原反应酶系统，还原酶催化甘油转化成1，3-PD，氧化酶则催化辅酶NADH2/NAD+循环 再生。使用固定化多酶体系催化合成1，3-PD，较微生物发酵法等具有反应简单，无细胞 污染，有利于连续操作和后续分离等优点。并且使用固定化多酶催化体系，可以使大型发酵 罐取代为小型的固定化酶反应器，使大型工厂小型化，因此成为生物法制备1，3-PD的研究执占。在固定化酶技术中，除了固定化方法外，寻找新型的载体，以提高固定化酶的各种 性能具有重要的意义。纳米载体材料与相应的块体材料相比，具有高比表面积，高活性，强 吸附力，高催化效率等优异特性，能有效提高酶分子的负载量和稳定性(Wang et al. 2006 ； Liu et al. 2009)。特别是无机氧化物纳米载体材料具有良好热稳定性、化学稳定性和生物 相容性，广泛应用于微型生物器件、生物器件阵列以及电学、酶催化、光催化、药物输送等许 多领域。无机氧化物纳米粉体(多为团聚体)，是一种无毒、无污染、成本低的无机非金属 材料。如纳米TiO2作为酶固定化载体时不易被微生物降解、耐酸碱、可提供更多固定位点， 是一种对酶分子具有高度吸附能力的非水溶性载体。纳米载体材料具有独特的表面与界面
3反应性能，纳米载体材料的粒径越小，其比表面积越大，吸附能力越强，酶分子负载量大，固 定化酶的催化活性就越高。但是纳米载体材料粒径小、比表面积大，在水介质中具有较高的表面能，容易团 聚。在水中分散时会形成难以分散的团聚体，产生沉淀和结块，这大大降低纳米载体材料对 酶的吸附能力。如何有效抑制团聚，提高分散性，形成均勻而稳定的纳米凝胶悬浮液，发挥 纳米载体高比表面等优异性能，高效吸附酶分子，减小载体对底物和产物的扩散影响，就需 要对团聚体进行表面改性，常用的方法是添加界面改性剂(崔爱莉，2001)，即分散剂，抑制 团聚，获得在水溶液中均勻分散的纳米凝胶悬浮液，充分发挥纳米载体高比表面等优异性 能。均勻分散形成的巨大的比表面积，为同时偶联多种生物酶即多酶固定提供了场所，更有 利于多酶链式反应的进行。本发明拟制备在水溶液中均勻分散的纳米凝胶悬浮液，运用分散_吸附固定化技 术，构建纳米凝胶-多酶组装体系，从单酶体系向多酶体系发展，利用平行的氧化还原反应 酶系统，自身循环再生NADH2/NAD+，多酶偶联生产1，3-PD。与溶胶凝胶(sol-gel)纳米固定化酶相比，分散-吸附法消除了载体与酶之间的 强相互作用，可以使酶活性得以保持(Kim et al.2006)。sol-gel纳米固定化酶过程中一 般采用酸、碱或盐作为sol-gel过程的催化剂，酶在较高、较低pH或者较高离子强度的条件 下极易失活；在sol-gel过程中，酶分子表面存在的大量0H、C00H与凝胶网络形成初期含有 M-O(H)-M和M-OH聚合物片段存在强烈的相互作用(许松伟，2004)，导致酶分子构象的改 变，引起酶活性降低。此外sol-gel过程前驱体水解产生的乙醇破坏适宜酶生存的微环境、 凝胶将酶限制在一些并不适合酶活性保持的微环境中，酶的构象变化和分子运动与在溶液 中相比受到限制。 利用纳米载体分散-吸附溶液中的酶分子，构建纳米凝胶-多酶组装体系，载体粒 径小，比表面大，能有效地维持酶分子催化活性，比水溶性酶更适合于多酶偶联反应。酶负 载量大，反应扩散限制小，成本低，无细胞污染，不易被微生物降解，是一种有效的纳米凝胶 固定化酶催化合成的新方法。[ 1 ] Wang P, Nanoscale biocatalyst systems. Current Opinion in Biotechnology,2006，17(6) :574_579·[2] Liu W, Zhang S, Wang P, Nanopart icle-supp or ted multi-enzyme biocatalysis with insitu cofactor regeneration. Journal of Biotechnology,2009, 139(1) :102-107.[3]崔爱莉，王亭杰，何红，金涌，超细二氧化钛粉末在水溶液中的分散，过程工程 学报，2001，1(1) 99-101.[4]Kim MI, Ham HO,Oh SD,et al. Immobilization of Mucor javanicus lipase oneffectively functionalized silica nanoparticles. J Mol Catal B-Enzymatic, 2006,39(1/4) :62-68.[5]许松伟，姜忠义，吴洪，黄淑芳，溶胶-凝胶生物包囊化物的制备与特性。化学 进展，2004，16(3) 443-449.
发明内容
技术问题本发明是一种纳米凝胶固定化多酶体系的制备及其在1，3_丙二醇合 成中的应用，采用无机氧化物纳米粉体作为固定化酶的载体，利用分散剂抑制纳米颗粒间 团聚，获得水中分散的纳米凝胶悬浮液，通过分散_吸附固定化方法，制备纳米凝胶_多酶 组装体系，自身偶联，多酶催化生产1，3_丙二醇。使用纳米凝胶固定化多酶体系催化合成1，3-丙二醇，充分发挥纳米载体高比表面 等优异性能，既为同时偶联多种生物酶即多酶固定提供场所，又减小载体对底物和产物的扩 散影响。较微生物发酵法等具有成本低，反应简单，无细胞污染，不易被微生物降解等优点。技术方案本发明的目的是提供在水溶液中均勻分散的纳米凝胶悬浮液，利用含 亲水基的羟基醇基团，分散无机氧化物纳米粉体，防止纳米粒子团聚，充分发挥纳米载体高 比表面等优异性能，有效吸附固定偶联酶体系的方法。一元或多元醇分散剂对酶分子二硫 键以及三维结构具有一定的保护作用，醇分散-吸附固定化酶技术可有效地束缚酶的构象 和维持微环境稳定，是稳定酶活性的重要方法之一。其特征包括以下步骤1)无细胞抽提 液制备；2)纳米载体的分散；3)纳米凝胶吸附负载固定化多酶体系。具体实施过程为1)无细胞抽提液制备将克雷伯杆菌进行增殖培养后，离心收集菌体；洗涤并称 重，加入2 10倍质量的生理盐水，混勻后，冰浴环境下超声破碎，离心后获得粗酶液，再经 饱和度30% 70%的硫酸铵分级沉淀，透析脱盐，用pH = 6. 5 10. 0的Tris-HCl缓冲溶 液配制成浓度为5. 0 100g/L的多酶体系溶液；2)纳米载体的分散将分散剂醇用TriS-HCl缓冲溶液溶解，按m # u:mTi02 =0.05 0.5:1的质量配比与TiO2纳米载体混合，超声分散30 60min，得到水中分散的纳米 TiO2凝胶悬浮液；3)纳米凝胶吸附负载固定化多酶体系将多酶体系溶液与纳米TiO2凝胶悬浮液 混勻，体积比1 1 10，于37-50°C时摇床中振荡吸附0. 5 6h，离心混合体系，保留上清 液测定酶含量，下层沉淀用缓冲溶液洗涤至上清液无蛋白检测出，获得纳米凝胶固定化多 酶体系，低温保存；所述的分散剂醇为一元或多元醇分散剂，是聚乙二醇、乙二醇、甘油、柠檬酸、二 硫苏糖醇或β-巯基乙醇中的一种或多种。所制备得到的纳米凝胶固定化多酶体系包括甘油脱氢酶、甘油脱水酶和1，3_丙
二醇氧化还原酶。所述的纳米凝胶固定化多酶体系在1，3_丙二醇合成中的应用，其特征在于多 酶偶联催化1，3_丙二醇合成方法为反应液的组成为甘油100 650mmol/L，NAD+O. 5 5mmol/L, VB12 5 30 μ mol/L, (NH4) 2S04 20 50mmol/L，(NH4) 2Fe (SO4) 2 0. 5 2 μ mol/L, Mg2+O. 5 2mmol/L，柠檬酸0. 2 2mmol/L，pH = 6. 5 10. 0缓冲溶液；加入纳米凝胶固 定化多酶体系10 100g/L，30 45°C条件下摇床振荡，反应2 12小时，离心取上清液测 定1，3-丙二醇含量。有益效果本发明提供了一种有效的纳米凝胶固定化酶催化合成的新方法。使 用纳米凝胶分散_吸附固定化技术，构建纳米凝胶_多酶组装体系，多酶偶联催化合成1， 3-丙二醇，分散的纳米凝胶载体具有大的比表面积，能有效提高酶的负载量；载体粒径小，具有小的扩散限制；制备工艺简便，条件温和，能有效地维持酶分子催化活性，适合于多酶 偶联反应。与微生物发酵法相比，具有反应简单，无细胞污染，不易被微生物降解、成本低等 优点。
图1.游离酶和纳米凝胶固定化多酶体系的热稳定性比较。
具体实施例方式1)无细胞抽提液制备将克雷伯杆菌进行增殖培养后，离心收集菌体；洗涤并称 重，加入2 10倍质量的生理盐水，混勻后，冰浴环境下超声破碎，离心后获得粗酶液，再经 饱和度30% 70%的硫酸铵分级沉淀，透析脱盐，用pH = 6. 5 10. 0的Tris-HCl缓冲溶 液配制成浓度为5. 0 100g/L的多酶体系溶液；2)纳米载体的分散将分散剂醇用Tris-HCl缓冲溶液溶解，按m · _」:ιηΤ θ2 =0.05~0.5:1的质量配比与TiO2纳米载体混合，超声分散30 60min，得到水中分散的纳米 TiO2凝胶悬浮液；3)纳米凝胶吸附负载固定化多酶体系将多酶体系溶液与纳米TiO2凝胶悬浮液 混勻，体积比1 1 10，于37-50°C时摇床中振荡吸附0. 5 6h，离心混合体系，保留上清 液测定酶含量，下层沉淀用缓冲溶液洗涤至上清液无蛋白检测出，获得纳米凝胶固定化多 酶体系，低温保存；实施例一不同醇分散剂对TiO2负载率影响菌种克雷伯肺炎杆菌(K. pneumoniae)取IOOOmL发酵液离心收集菌体，洗涤并称重，加入10倍质量0. 9%生理盐水，混勻 后，冰浴环境下超声破碎、离心后获得粗酶液，以饱和度50%的硫酸铵沉淀，透析脱盐后， 用Tris-HCl缓冲溶液配制浓度为20. Og/L的多酶体系溶液。分别称取50mg TiO2 (粒径16nm，比表面280m2/g)纳米载体到1-7号试管中，1号 试管无分散剂，以5mLTris-HCl缓冲溶液作空白，超声分散30min。2-7号试管中加入5mL 不同醇分散剂溶液，超声分散30min。再往1-7号试管分别加入5mL多酶体系溶液，于37°C 时摇床中振荡吸附约lh，取出在8000rpm下离心lOmin，下层沉淀用pH = 7. 0的Tris-HCl 缓冲溶液洗涤至上清液无蛋白后，合并洗涤液及上清液用于酶含量及负载率的分析。酶蛋白质含量测定采用Bradford法测定，以牛血清蛋白为标准蛋白。根据吸附前 后溶液中的蛋白含量CQ，Ct，计算纳米1102粒子对酶蛋白的负载率ε
Co-Ctε =-χ 100%
Co式中Ctl为初始酶浓度(g · L-1)，Ct为吸附t时刻残余酶浓度(g · L-1)，ε为负载 率。表1不同醇分散剂对TiO2负载率影响
6 实施例一研究了不同醇分散剂对纳米载体TiO2负载率的影响。表1结果表明添 加醇分散剂有效改善纳米TiO2分散性，可充分发挥纳米载体高比表面等优异性能，有效提 高了 TiO2对酶蛋白的负载率。其中，聚乙二醇分散剂的分散机制属于空间位阻稳定机制。聚乙二醇作为非离子 型表面活性剂，主要通过在纳米凝胶颗粒表面形成吸附层，产生并强化位阻效应，使胶粒间 产生强位阻排斥力，抑制纳米粒子团聚。不同分子量聚乙二醇对TiO2负载率影响不同。甘油介电常数高，可以溶解无机化合物，对TiO2纳米载体的分散也起到一定改善 作用。甘油对溶液中TiO2凝胶颗粒的分散作用是溶剂化作用的结果。醇分子的羟基与TiO2 表面的羟基氧通过氢键形成羟桥结构，从而在TiO2表面形成溶剂化层，抑制纳米TiO2颗粒 间团聚。分散的纳米载体具有大的比表面积，有效提高酶的负载率。此外，甘油又是酶作用底物，可诱导酶空间构型，有效地束缚酶的构象和维持微环 境稳定，对固定化酶活性稳定有一定辅助作用。实施例二不同pH负载工艺对纳米凝胶载体负载甘油脱氢酶负载率的影响多酶体系溶液制备同实施例一。以甘油为分散剂，称取等量TiO2 (粒径16nm，比表面280m2/g)粉体12份，分别加入 不同pH Tris-HCl缓冲溶液(pH = 5. 0 10. 0)，超声分散30min，加入一定量酶液于37°C 时摇床中振荡吸附lh，取出在8000rpm下离心lOmin，下层沉淀用Tris-HCl缓冲溶液洗涤 至上清液无蛋白后，合并洗涤液及上清液用于分析不同PH条件下酶的负载率。两个平行样 取平均值，实验结果如表2。表2不同pH负载工艺对纳米凝胶载体负载甘油脱氢酶负载率的影响 实施例二以甘油为分散剂，对比了不同pH条件对TiO2凝胶负载酶分子负载率的 影响。结果表明，PH条件对固定化酶的负载率影响较大，pH8-9负载率较高。可能是TiO2 与酶分子表面都带有羟基、氨基等官能团，在不同PH条件下会发生两性解离，所以TiO2凝 胶颗粒负载酶分子时，不同PH条件会影响带电微粒间的静电相互作用，影响载体吸附性能寸。实施例三纳米凝胶固定化多酶体系的热稳定性菌种克雷伯肺炎杆菌(K. pneumoniae)甘油脱氢酶GDH 酶活测定5mL GDH 反应液(含 30mmol/L (NH4) 2S04，0. 2mol/L 甘 油，2mmol/L NAD+, 1 μ mol/L(NH4)2Fe (SO4)2，用 pH = 11 的碳酸钾缓冲溶液配制)在 37°C条 件下加入实验用酶启动反应，在摇床中恒温反应40分钟，转移到离心管中于8000r/min离 心10分钟，上清液于340nm下测定吸光度A。一个酶活力单位(U)是在该条件下一分钟内 消耗Imol底物所需要的酶量。多酶体系溶液制备同实施例一。称取一定量TiO2粉体，以甘油为分散剂，用Tris-HCl缓冲溶液超声分散30min，得 纳米凝胶悬浮液，向其中加入一定量酶液于37°C时摇床中振荡吸附约lh，离心洗涤得纳米 凝胶固定化多酶体系。取等量的游离酶液和纳米凝胶固定化多酶各6组，分别放在4、20、 37、50、60和70°C下保温2h，测其甘油脱氢酶GDH酶活力，结果如图1。实施例三比较了游离酶液和纳米凝胶固定化多酶在不同温度条件下相对酶活 情况。结果表明，酶蛋白经固定后，提高了热稳定性。游离酶在70°C保温2h，酶活力仅剩 11. 7%，此时酶蛋白基本都变性失活，而纳米凝胶固定化多酶在70°C保温2h保持了 77. 5% 的酶活力，且纳米凝胶固定化多酶比游离酶具有了更宽的适宜反应条件范围。这可能由于 分散剂醇羟基与酶分子形成了氢键，提高酶的热变性温度，或醇分子包裹在酶分子周围，稳 定了酶的空间结构，对酶分子二硫键的三维结构具有一定的保护作用，从而提高了固定化 酶的热稳定性。实施例四纳米凝胶-多酶组装体系偶联催化1，3-丙二醇合成多酶体系溶液制备同实施例一。以甘油为分散剂，称取适量TiO2 (粒径16nm，比表面280m2/g)，加入Tris-HCl缓冲 溶液(pH = 5. 0 10. 0)，超声分散30min，加入一定量酶液于37°C时摇床中振荡吸附lh， 离心洗涤得纳米凝胶固定化多酶体系。
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取制备好的纳米凝胶固定化多酶体系1. 5g与50mL反应液混合，反应液的组成为 甘油 0. 50mol/L, NAD+2mmol/L, VB1215 μ mol/L, (NH4) 2S0430mmol/L, (NH4) 2Fe (SO4) 21 μ mol/L, Mg2+L 7mmol/L，柠檬酸1. lmmol/L, Tris-HCl缓冲溶液(pH = 7. 0)。多酶偶联催化反应在 摇床中进行，经摇床反应2 12小时，离心取上清液用气相色谱法测定1，3-丙二醇浓度， 结果如表3。表3纳米凝胶固定化多酶体系偶联催化产1，3-丙二醇情况
多酶偶联催化反应时间/h 产物1,3-丙二醇浓度(mmol/L) 2 18.2 6 86.1 10126.3以上结果表明，采用分散-吸附固定化技术，构建纳米凝胶-多酶组装体系，该纳 米凝胶固定化多酶体系能实现NADH2/NAD+自身循环再生，偶联催化合成1，3_丙二醇。使用纳米凝胶分散-吸附固定化多酶体系，催化甘油合成1，3_丙二醇，充分发挥 纳米凝胶高比表面等优异性能，既反应简单，无细胞污染，又为同时偶联多种生物酶即多酶 固定提供场所，方法简便、成本低。
权利要求
一种纳米凝胶固定化多酶体系的制备，其特征在于用含亲水基的多醇基团，分散纳米载体，抑制纳米粒子团聚，获得水中分散的纳米凝胶悬浮液，充分发挥纳米载体高比表面等优异性能，以分散 吸附固定化方法，制备纳米凝胶固定化多酶体系，具体为1)无细胞抽提液制备将克雷伯杆菌进行增殖培养后，离心收集菌体；洗涤并称重，加入2～10倍质量的生理盐水，混匀后，冰浴环境下超声破碎，离心后获得粗酶液，再经饱和度30％～70％的硫酸铵分级沉淀，透析脱盐，用pH＝6.5～10.0的Tris HC1缓冲溶液配制成浓度为5.0～100g/L的多酶体系溶液；2)纳米载体的分散将分散剂醇用Tris HCl缓冲溶液溶解，按的质量配比与TiO2纳米载体混合，超声分散30～60min，得到水中分散的纳米TiO2凝胶悬浮液；3)纳米凝胶吸附负载固定化多酶体系将多酶体系溶液与纳米TiO2凝胶悬浮液混匀，体积比1∶1～10，于37 50℃时摇床中振荡吸附0.5～6h，离心混合体系，保留上清液测定酶含量，下层沉淀用缓冲溶液洗涤至上清液无蛋白检测出，获得纳米凝胶固定化多酶体系，低温保存。FSA00000181005700011.tif,FSA00000181005700012.tif
2.根据权利要求1所述的纳米凝胶固定化多酶体系的制备，其特征在于在纳米载体的 分散中，所述的分散剂醇为一元或多元醇分散剂，是聚乙二醇、乙二醇、甘油、柠檬酸、二硫 苏糖醇或β-巯基乙醇中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的纳米凝胶固定化多酶体系的制备，其特征在于所制备得到的 纳米凝胶固定化多酶体系包括甘油脱氢酶、甘油脱水酶和1，3_丙二醇氧化还原酶。
4.一种如权利要求1所述的纳米凝胶固定化多酶体系在1，3_丙二醇合成中的应用，其 特征在于多酶偶联催化1，3-丙二醇合成方法为反应液的组成为甘油100 650mmol/L， NAD+ 0. 5 5mmol/L，VB12 5 30 μ mol/L, (NH4) 2S04 20 50mmol/L，(NH4) 2Fe (SO4) 2 0· 5 2 μ mol/L, Mg2+ 0. 5 2mmol/L，柠檬酸 0. 2 2mmol/L，pH = 6. 5 10. 0 缓冲溶液；加入 纳米凝胶固定化酶10 100g/L，30 45°C条件下摇床振荡，反应2 12小时，离心取上清 液测定1，3-丙二醇含量。
全文摘要
本发明涉及使用纳米凝胶分散-吸附固定化酶技术，构建纳米凝胶-多酶组装体系，自身偶联，多酶催化合成1，3-丙二醇。通过制备在水溶液中均匀分散的纳米凝胶悬浮液，直接吸附固定多酶体系。该方法能有效抑制团聚，提高分散性；充分发挥纳米凝胶载体高比表面等优异性能，既为同时偶联多种生物酶即多酶固定提供场所，又减小载体对底物和产物的扩散影响；较微生物发酵法等具有成本低，反应简单，无细胞污染，不易被微生物降解等优点。是一种有效的纳米凝胶固定化酶催化合成的新方法。
文档编号C12N11/14GK101914520SQ20101022237
公开日2010年12月15日 申请日期2010年7月8日 优先权日2010年7月8日
发明者何琴, 倪恨美, 卜长飞, 吴敏, 张玲 申请人:东南大学