一种蛋白药物的发酵生产工艺的制作方法

本发明涉及一种蛋白药物的发酵生产工艺，属于蛋白药物产业化制备技术领域。

背景技术：

大规模且经济地获得高度纯化的目的蛋白对于生物医药产业来说是一个重要的课题。通常，天然提取的活性蛋白更加直接有效，但是受原料、蛋白丰度、纯化工艺等因素限制，天然提取的蛋白往往并不经济高效。对于常规蛋白药物，包括激素、疫苗、抗体、多肽等，利用哺乳动物细胞、细菌、酵母菌等大规模发酵生产提供了一个更加经济高效的途径，并且极大地降低了药物成本。但是，对于活性蛋白，由于蛋白质本身易于发生反应，无论是发酵生产的表达效率和蛋白质纯化的效率都受到显著的影响。要将所需的活性蛋白质与细胞裂解液或发酵液进行分离纯化，达到足够临床使用的纯度和安全标准，并且尽可能的降低成本，这些是目前产业界面临的难题。

shfm1(splithand/splitfootmalformationtype1)基因是人蟹爪病中的关键基因之一，进化上高度保守，它所编码的蛋白dss1参与到稳定基因组、同源基因重组、dna损伤修复和细胞增殖等过程[1-4]。本专利发明人的研究结果显示dss1蛋白作为标签可以通过耗能的酶促反应添加到氧化蛋白上，帮助细胞清除氧化蛋白[5]。这些结果显示dss1蛋白在生物活动中的重要作用。sdss1蛋白是最新发现的dss1蛋白亚型，二者在氨基酸序列上有部分相似性，但是多肽结构完全不同。作为一种新型天然蛋白，sdss1在氨基酸序列和多肽结构上的差异决定了它的功能更加特殊，因而有更大的潜在应用价值。目前尚未有资料报道针对sdss1蛋白的发酵生产工艺。

以上内容涉及的引文：

1.vansilfhoutat,vandenakkerpc,dijkhuizent,verheijjb,olderode-berendsmj,kokk,sikkema-raddatzb,vanravenswaaij-artscm(2009)splithand/footmalformationduetochromosome7qaberrations(shfm1):additionalsupportforfunctionalhaploinsufficiencyasthecausativemechanism.eurjhumgenet17(11):1432-8.

2.lij,zouc,baiy,wazerde,bandv,gaoq(2006)dss1isrequiredforthestabilityofbrca2.oncogene25:1186–1194.

3.liuj,dotyt,gibsonb,heyerwd(2010)humanbrca2proteinpromotesrad51filamentformationonrpa-coveredsinglestrandeddna.natstructmolbiol17:1260–1262.

4.zhouq,kojicm,caoz,lisbym,mazloumna,hollomanwk(2007)dss1interactionwithbrh2asaregulatorymechanismforrecombinationalrepair.molcellbiol2:2512–2526.

5.zhangy,changfm,huangj,juncojj,maffisk,pridgenhi,catanog,dangh,dingx,yangf,kimdj,slagatj,her,weisj(2014)dssylation,anovelproteinmodificationtargetsproteinsinducedbyoxidativestress,andfacilitatestheirdegradationincells.proteincell5(2):124-40.

技术实现要素：

本发明提供了一种蛋白药物的发酵生产工艺，从而能够大规模制备sdss1蛋白药物。

具体涉及sdss1蛋白的重组载体、重组工程细胞、表达sdss1蛋白的重组工程细胞发酵生产工艺及应用等方面的内容。

具体的技术方案如下：

一种sdss1蛋白的重组载体，所述重组载体中包含能编码sdss1蛋白的基因片段。

优选地，所述的sdss1蛋白包括人、黑猩猩、倭黑猩猩、大猩猩、红毛猩猩、白颊长臂猿、川金丝猴、恒河猴、滇金丝猴、东非狒狒、安哥拉疣猴、白顶白眉猴、鬼狒、豚尾猴的任一sdss1蛋白序列，其中人sdss1的氨基酸序列如seqidno：1，黑猩猩sdss1的氨基酸序列如seqidno：2，倭黑猩猩sdss1的氨基酸序列如seqidno：3，大猩猩sdss1的氨基酸序列如seqidno：4，红毛猩猩sdss1的氨基酸序列如seqidno：5，白颊长臂猿sdss1的氨基酸序列如seqidno：6，川金丝猴sdss1的氨基酸序列如seqidno：7,恒河猴sdss1的氨基酸序列如seqidno：8，滇金丝猴sdss1的氨基酸序列如seqidno：9，东非狒狒sdss1的氨基酸序列如seqidno：10，安哥拉疣猴sdss1的氨基酸序列如seqidno：11，白顶白眉猴sdss1的氨基酸序列如seqidno：12，鬼狒sdss1的氨基酸序列如seqidno：13，豚尾猴sdss1的氨基酸序列如seqidno：14。

优选地，所述的sdss1蛋白是任一与所述的sdss1蛋白相似度达到70％以上的蛋白。

优选地，所述的sdss1蛋白是任一以所述的sdss1蛋白氮端58个氨基酸为基础，在氮端或碳端融合其他多肽片段，用于融合的多肽片段的结构特征或氨基酸序列特征与所述的sdss1蛋白碳端31个序列相同或相似的蛋白。

优选地，所述的sdss1蛋白是任一以所述的sdss1蛋白氮端58个氨基酸为基础，在氮端或碳端融合其他多肽片段，融合后的蛋白能实现跨膜转运功能的蛋白。

本申请文件所述的sdss1蛋白氮端58个氨基酸和sdss1蛋白碳端31个序列分别是指sdss1蛋白的第1-58个氨基酸，和sdss1蛋白的第59-89个氨基酸。

优选地，所述重组载体是大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或链霉菌的表达质粒，或者是用于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或链霉菌的重组dna片段。

优选地，所述载体是酵母菌表达质粒，或者是用于酵母菌的重组dna片段。

优选地，所述载体是用于哺乳动物细胞表达的质粒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒或杆状病毒。

一种重组工程细胞，所述工程细胞是把上述方案任一所述的sdss1蛋白的重组载体导入到相应的宿主细胞中构建得到的能表达所述的sdss1蛋白的重组工程细胞。

优选地，所述重组工程细胞是大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或链霉菌，或者能够在表达产物中掺入非天然氨基酸的大肠杆菌、芽孢杆菌或链霉菌的改造细胞。

优选地，所述重组工程细胞是酵母菌，或者是能够在表达产物中掺入非天然氨基酸的酵母菌的改造细胞。

优选地，所述重组工程细胞是人胚肾上皮细胞(hek293细胞)、中国仓鼠卵巢细胞(cho细胞)、小仓鼠肾细胞(bhk细胞)、猴肾细胞(cos细胞)或昆虫细胞，或者是能够在表达产物中掺入非天然氨基酸的人胚肾上皮细胞(hek293细胞)、中国仓鼠卵巢细胞(cho细胞)、小仓鼠肾细胞(bhk细胞)、猴肾细胞(cos细胞)或昆虫细胞的改造细胞。

优选地，所述的蛋白表达形式是包涵体。

优选地，所述的蛋白表达形式是胞浆蛋白。

优选地，所述的蛋白表达形式是分泌蛋白。

一种重组工程细胞，所述工程细胞是上述方案任一所述的sdss1蛋白的重组载体中能表达所述的sdss1蛋白的细胞与肿瘤细胞融合形成的杂交瘤细胞。

一种表达sdss1蛋白的重组工程细胞发酵生产工艺，是指把上述方案任一所述的重组工程细胞进行发酵生产，包括发酵、目的蛋白粗纯与蛋白精细纯化步骤。

优选地，所述发酵过程中用于大肠杆菌的发酵培养基优化配方是：酵母浸粉10-50g/l、蛋白胨10-30g/l、硫酸铵2-10g/l、氯化钠2-10g/l、磷酸二氢钾0-10g/l、磷酸氢二钾2-15g/l、消泡剂0.01-0.1％(v/v)、feso4·7h2o0-0.1g/l、znso4·7h2o0-0.02g/l、cuso4·5h2o0-0.1g/l、mnso4·5h2o0-0.05g/l、cacl2·7h2o0-0.01g/l、cocl2·6h2o0-0.01g/l、na2moo4·2h2o0-0.01g/l、h3bo30-0.0005g/l、biotin0-0.005g/l。

优选地，目的蛋白粗纯是把发酵过程产生的培养物进行初步处理，其步骤如下：

①、收集所有细胞，破碎细胞后，分离出包涵体蛋白；

②、包涵体蛋白经过变性、复性、酶切，获得包含sdss1蛋白的粗纯产物。

优选地，目的蛋白粗纯是发酵过程产生的培养物进行初步处理，其步骤如下：

①、收集所有细胞，破碎细胞后，分离出胞浆蛋白；

②、胞浆蛋白经过变性、复性、酶切，获得包含sdss1蛋白的粗纯产物。

优选地，目的蛋白粗纯是把发酵过程产生的培养物进行初步处理，其步骤如下：

收集培养液，除去菌体和杂质，获得上清中包含sdss1蛋白的粗纯产物。

优选地，蛋白精细纯化是把粗纯目的蛋白进行色谱纯化，获得高纯度的sdss1蛋白。

优选地，所述的色谱纯化是可以选择以下层析方法中的任意一种或任意组合：

用强阴离子交换树脂、弱阴离子交换树脂或多模式阴离子交换树脂进行离子交换层析、亲和层析、用反相填料进行反相层析、用分子排阻填料进行分子筛层析以及用疏水填料进行疏水层析。

一种应用，把上述方案所述的sdss1蛋白的重组载体、重组工程细胞以及重组工程细胞发酵生产工艺应用于工业上大规模发酵生产和纯化sdss1蛋白。

本发明的特点和/或有益效果有：

综合sdss1蛋白的重组载体、重组工程细胞、表达sdss1蛋白的重组工程细胞发酵生产工艺及应用等方面的内容，可以看出，本发明的蛋白药物的发酵生产工艺首先利用基因工程手段将合成的sdss1基因片段整合到表达载体上，整合基因片段同时构建用于蛋白纯化的标签以及酶切位点。表达载体经转化进入相应的表达宿主，从而获得sdss1蛋白高表达的重组工程细胞。重组工程细胞经发酵、诱导表达、裂解、复性、酶切获得粗纯的蛋白产物；继续进行一系列精细纯化步骤获得高纯度的sdss1蛋白。

本发明所要解决的技术问题是构建了完整的sdss1蛋白工业化生产工艺过程，从而满足sdss1蛋白的功能研究和临床应用的需求。sdss1蛋白是一类分泌蛋白，性质活泼，易于其他蛋白发生蛋白质互作并屏蔽毒性蛋白的毒性。在本发明提供的工艺过程中，添加辅助因子(如尿素和表面活性剂等试剂)能够通过提高目的蛋白与其他蛋白的分离度达到分离效果。发酵生产过程中，实现sdss1蛋白的包涵体表达或分泌表达，能够最大程度的降低蛋白酶酶切的影响。发酵产物通过粗纯过程和精细纯化两个过程，能最大程度的简化纯化工艺，提高纯化效率，最终获得纯度较高的目的蛋白。多种纯化工艺的组合应用能极大的提高蛋白纯度。本工艺经济有效，提供多条sdss1蛋白工业化生产的途径。

附图说明

下面结合附图，对本发明做进一步详细的阐述，以使本发明能够清楚、完整，但不是为了限制本发明的保护范围。

图1.琼脂糖凝胶电泳验证构建完成的大肠杆菌重组载体。经过内切酶bglii和bamhi双酶切，可以看到插入片段和质粒片段

图2.鉴定重组大肠杆菌。sds-page检测重组大肠杆菌经iptg诱导后目的蛋白sdss1表达。与不诱导的对照样品相比，经过iptg诱导可以显著看到目的蛋白(strepavidin-smt3-sdss1)表达上调。

图3.发酵过程中大肠杆菌生长曲线。在细菌生长3小时开始加入iptg诱导目的蛋白表达。

图4.发酵过程中监测目的蛋白表达。分别在iptg诱导的3小时、4小时、5小时取样进行sds-page检测目的蛋白表达，目的蛋白在细胞内能稳定表达。

图5.包涵体富集目的蛋白。sds-page显示目的蛋白大量富集在包涵体中，经过清洗步骤，包涵体中目的蛋白的纯度进一步提高。细菌裂解液和清洗液中残留的目的蛋白较少。

图6.蛋白酶处理获得sdss1蛋白。经过ulp1蛋白酶孵育和酶切处理，获得sdss1蛋白和酶切产物(strepavidin-smt3)用于后续精细纯化。

图7.多拷贝插入酵母菌表达质粒构建。经过连续多次插入目的片段，获得6拷贝插入的酵母菌表达质粒。构建完成的质粒用双内切酶bglii和bamhi分别进行酶切鉴定。

图8.鉴定重组酵母菌。构建完成的酵母菌经甲醇诱导，可以检测到目的蛋白的表达上调(his-sdss1)。

图9.发酵过程中酵母菌生长曲线。在发酵过程中，酵母菌生长的30小时且细胞生长符合要求后开始加入甲醇进行诱导。

图10a.阴离子交换层析deaefastflow柱纯化过程。箭头标示sdss1蛋白洗脱峰。

图10b.检测经离子交换层析纯化蛋白样品。经过deaefastflow纯化后，获得较高纯度的sdss1蛋白。

图11a.用histrapexcel柱亲和层析纯化过程。箭头标示sdss1蛋白洗脱峰。

图11b.检测经亲和层析纯化蛋白样品。经过histrapexcel亲和层析纯化后，获得较高纯度的sdss1蛋白。

图12a.用hitrapoctylfastflow柱疏水层析纯化过程。箭头标示sdss1蛋白洗脱峰。

图12b.检测经疏水层析纯化蛋白样品。经过hitrapoctylfastflow疏水层析纯化后，获得较高纯度的sdss1蛋白。

图13a.用captoadhere柱多模式层析纯化过程。箭头标示sdss1蛋白洗脱峰。

图13b.检测经多模式层析纯化蛋白样品。经过captoadhere多模式层析纯化后，获得较高纯度的sdss1蛋白。

图14a.用source15rpcst4.6/100柱反相层析纯化过程。箭头标示sdss1蛋白洗脱峰。

图14b.检测经反相层析纯化蛋白样品。经过source15rpcst4.6/100柱反相层析纯化后，获得较高纯度的sdss1蛋白。

图15.用ni-nta琼脂糖凝胶柱亲和层析纯化his-sdss1蛋白。用sds-page检测不同阶段的洗脱峰，可以看到his-sdss1蛋白纯度越来越高。

具体实施方式

以下内容将结合实例对本发明中的优选方案进行说明和验证，不是对本发明的范围进行限定。本发明的所有范围限定以权利要求书中的限定为准。

下述实施案例中所用的实验方法如无特殊说明，均为常规实验方法。

下述实施案例中材料和试剂均可以通过商业途径获取。

实施例1、利用大肠杆菌发酵生产sdss1蛋白。

1.大肠杆菌表达质粒构建

在人sdss1蛋白的基因序列基础上进行核苷酸序列修饰，从而获得能在大肠杆菌中正常编码sdss1蛋白的核苷酸序列，并且添加strepavidin标签(不完整strepavidin蛋白片段)、酶切位点smt3，核苷酸序列如seqidno.15。委托生工生物工程(上海)有限公司合成核苷酸片段，片段的序列结构strepavidin-smt3-sdss1(942bp)。在酶切位点ncoi(r0193l，购自newenglandbiolabs)和bamhi(r0136l，购自neb)之间切开pet28a(+)质粒，把核苷酸片段插入质粒，构建完整的重组质粒载体。重组质粒载体的验证如图1。

2.大肠杆菌重组菌株构建

本阶段用到的溶液和培养基配方：

soc培养基(100ml)：2％蛋白胨(购自安琪酵母股份有限公司)，0.5％酵母提取物(购自安琪酵母股份有限公司)，0.05％nacl，2.5mmkcl，10mmmgcl2，20mm葡萄糖。

lb培养基(1l)：10g蛋白胨，5g酵母提取物，10gnacl，ph7.2。

5ⅹsds上样缓冲液：250mmtris-hcl(ph6.8)，10％sds，0.5％溴酚蓝，50％甘油，5％β-巯基乙醇，混匀后4℃分装保存。

iptg溶液：iptg粉末(i6758，购自sigma-aldrich)加水溶解成23.83mg/ml(100mm)的水溶液，过滤除菌后4℃保存。

大肠杆菌重组菌株构建过程：

①.感受态细胞转化100μlbl21(de3)感受态细胞(cd601-01，购自北京全式金生物技术有限公司)从-80℃拿出后放置在冰上30分钟，取100ng质粒(大约1μl)加入感受态细胞溶液，轻轻叩击三次ep管使质粒与感受态混合。将ep管再放置在冰上孵育5分钟，然后将ep管置于42℃水中热激90秒，然后迅速将管子插在冰上孵育15分钟。取1000μlsoc培养基悬浮细胞，并将重悬液移至一个新的15ml离心管内，将离心管放入摇床，37℃，180转每分钟(rpm)振荡培养1小时。

②.单克隆挑选取50μl转化细胞涂布在含有卡那霉素的lb琼脂板上(卡那霉素浓度0.005％)，37℃孵育过夜。第二天，随机挑取5至6个克隆分别接种于2mllb培养基中(含0.005％卡那霉素浓度)，37℃环境中250rpm振荡培养3小时。

③.验证目的蛋白表达取1.5ml细菌培养液移至一个新的无菌试管中，加入iptg至终浓度1mm继续振荡培养，诱导目的蛋白表达。2小时后，取200μl诱导的和没有诱导的培养液分别置于1.5ml离心管内，离心15000g，5分钟得到细菌的细胞沉淀。移除上清，用200μl1xsds上样缓冲液重悬细胞，100℃孵育10分钟，然后用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)(10％预制胶，c#np0321box，购自lifetechnology公司)检测目的蛋白表达情况(图2)，最终确定阳性单克隆细胞，即为重组大肠杆菌菌株。

3.重组大肠杆菌发酵

本阶段用到的溶液和培养基配方：

一级种子培养基：酵母浸粉5g/l、蛋白胨10g/l、硫酸卡那霉素50mg/l、葡萄糖8g/l，ph7.2，121℃灭菌20分钟。

二级种子培养基：酵母浸粉5g/l、蛋白胨10g/l，硫酸卡那霉素50mg/l、葡萄糖8g/l，ph7.2，121℃灭菌20分钟。

发酵培养基成分包括：酵母浸粉24g/l、蛋白胨12g/l、硫酸铵5g/l、氯化钠5g/l、磷酸二氢钾5g/l、消泡剂0.05％(v/v)。

所述补料培养基主要成分包括：酵母浸粉100g/l、蛋白胨200g/l。

重组大肠杆菌发酵过程：

①.一级种子制备，将冻存管菌种按照0.05％(v/v)接种量接种至无菌的一级种子培养基，30℃，200rpm摇床震荡培养16小时，为一级种子。；

②.二级种子制备，将一级种子液按照5％(v/v)接种量接种至无菌的二级种子培养基，37℃，250rpm摇床震荡培养3小时，为二级种子。

③.发酵生产，将二级种子液按照5％的接种量接入到含灭菌后的发酵培养基发酵罐中，发酵温度为37℃，用氨水或氢氧化钠控制ph6.5-7.5之间，溶氧(do)设定在10-30％之间，转速100-700rpm，通风量1.5vvm，罐压0.05mpa。

④.发酵过程监控和补料，发酵开始后定期取样进行od600测定从而确定细菌生产水平，绘制生长曲线(图3)。定期取样进行葡萄糖浓度的测定从而控制葡萄糖浓度在35-45mm。发酵开始3小时后一次添加无菌补料培养基。

⑤.诱导表达，发酵开始3小时后发酵罐中加入终浓度为1.0mm的iptg在37℃进行诱导表达，不同时段取样进行sds-page分析监测诱导的目的蛋白表达情况(图4)。

⑥.发酵产物收集，诱导表达5小时后结束发酵，收获发酵液，15000g离心30分钟收集菌体。

4.包涵体处理

本阶段用到的溶液和培养基配方：

破碎缓冲液：20mmtis-hcl，1mmedta，5mmdtt，ph7.5。

洗涤缓冲液：20mmtis-hcl，1mmedta，5mmdtt，4％tritonx-100；

溶解缓冲液：8m尿素，1mmedta，20mmtris-hcl，5mmdtt，ph7.5。

复性缓冲液：1mmedta，20mmtris-hcl，ph8.0。

包涵体处理过程：

①.收获包涵体15000g高速离心收集菌体，按重量体积比1:10加入破碎缓冲液，高压均质机压力破碎两遍，离心收集包涵体沉淀。

②.溶解包涵体将包涵体沉淀按重量体积比1:10加入洗涤缓冲液，室温磁力搅拌1小时，离心收集的沉淀用洗涤缓冲液洗涤两次。超滤去除杂质后再用包涵体溶解缓冲液按重量体积比1:10溶解过夜。溶解后的包涵体经离心去除杂质后，蛋白溶液用sds-page分离并用考马斯亮蓝染色(图5)。

③.获得sdss1蛋白粗纯溶液稀释到蛋白浓度25g/l，在复性缓冲液中，室温复性10分钟。在复性的蛋白溶液中按照1：3000-1：20000比例(根据酶活决定实际比例)(质量比率，w/w)添加sumo蛋白酶(ubiquitin-like-specificprotease1，ulp1)，混合均匀后在室温下酶解0.5小时，得到包含sdss1蛋白粗纯溶液。酶切前后的蛋白样品经sds-page分离并经考马斯亮蓝染色(图6)。

实施例2.利用酵母菌发酵生产sdss1蛋白。

1.酵母菌表达质粒构建

在人sdss1蛋白的基因序列基础上进行核苷酸序列修饰，从而获得能在酵母菌中正常编码sdss1蛋白的核苷酸序列，并且添加6ⅹhis标签，核苷酸序列如seqidno.16。委托金斯瑞生物科技有限公司合成基因片段，片段的序列结构his-sdss1(285bp)。

利用通用的分子生物学技术将合成的his-sdss1基因片段插入到ppiczαa质粒的α因子后面，使α因子的基因与his-sdss1基因片段融合，得到质粒ppiczαa-his-sdss1。下面的操作步骤可实现在单个ppiczαa质粒内插入多个bglii和bamhi之间的序列拷贝：

①.利用pcr技术扩增出质粒上bglii和bamhi之间的dna序列(此片段包含aox1promoter,α-factorsecretionsignal和his-sdss1片段，简称为表达单元)，引物为primerforward：gtctgacgctcagtggaacg，dna序列如seqidno.17和primerbackward：cggagtccgagaaaatctggaagag，dna序列如seqidno.18。

②.利用琼脂糖凝胶电泳，切胶纯化出pcr反应的产物(plusdnaclean/extractionkit,genemark)。用内切酶bglii和bamhi-hf对纯化后的pcr产物进行双酶切，利用pcr产物纯化试剂盒纯化出酶切产物(plusdnaclean/extractionkit,genemark)。

③.用bamhi-hf单酶切ppiczαa-his-sdss1,纯化酶切产物(plusdnaclean/extractionkit,genemark)。

④.连接以上步骤②和③所得产物(quickligasekit,neb),并将连接产物直接转入top10感受态细胞内，将转化后的细胞涂在含zeocin的lb琼脂板上，置于37℃孵育过夜。

⑤.挑取10个克隆分别接种在含5mllb培养基的试管中，37℃，250rpm，振荡培养过夜。

⑥.收获过夜培养的细胞，分别纯化质粒(plasmid分钟ipreppurificationkitii,genemark)

⑦.从每份步骤⑥所得质粒中取100ng，利用内切酶bglii和bamhi分别进行双酶切，酶切后的产物用琼脂糖电泳分析观察，产生了2000bp(质粒酶切片段)和4000bpdna片段(表达单元酶切片段)的克隆就是表达单元为双拷贝的(即含两个首尾相接的表达单元)克隆。继续重复步骤①-⑦，直到获得插入6个拷贝的重组ppiczαa质粒。构建完成的2-6拷贝质粒经酶切鉴定基因片段插入情况(图7)

2.重组酵母菌构建

毕赤酵母菌(gs115，购自天根生化科技(北京)有限公司)首先制作成感受态细胞，然后与重组质粒混合，进行电击转化的方法构建重组酵母菌株，过程如下：

本阶段所用的培养基和溶液配方：

ypd培养基(1l):10g酵母提取物、20g蛋白胨溶于700ml水，后定容至900ml，高压灭菌后冷至室温；加过滤除菌的20％葡萄糖溶液100ml，混匀，室温或4℃保存。

1m山梨醇(sorbitol)(1l):182.2g山梨醇溶于900ml水，定容至1l，高压灭菌后，4℃保存。

ypd/hepes(120ml)：100mlypd培养基，20ml1mhepes(ph8.0)，高压灭菌后室温或4℃保存。

ypd/sorbitol(1l):10g酵母提取物，20g蛋白胨，182.2g山梨醇溶于700ml水，定容至900ml，高压灭菌后加100ml20％葡萄糖溶液，4℃保存。

ypd/sobitol/抗生素平板(100ml)：1g酵母提取物、2g蛋白胨、18.2g山梨醇，定容至90ml，加1.5克琼脂，高压灭菌。冷却至70～80度取出，加10ml20％葡萄糖溶液，再加100μl(1000x)博莱霉素。所有溶液混匀后快速倒入直径10cm的培养板，室温冷却，凝固后，加盖、倒置4℃保存备用。

制作感受态细胞

①.种子孵育，10mlypd培养基接入酵母种子，于100ml三角瓶中30℃、250rpm摇过夜。

②.酵母培养，第二日测三角瓶中菌液的od值，计算添加量，接种于50ml或100mlypd培养基中，于1～2只250ml三角瓶中培养至od值在0.8到1之间。

③.收集菌体，转移菌液至无菌离心管中，4℃3000g离心5分钟，弃去上清。

④.菌体预处理，每支50ml离心管加10mlypd/hepes，振荡重悬；加1.25ml1mdtt，翻转几次混匀。30度孵育15分钟。

⑤.菌体处理，预处理结束后每支管加入40ml预冷1m山梨醇溶液，混匀后4℃3000g离心5分钟，弃上清。

⑥.菌体处理，沉淀中的菌体继续用50ml预冷1m山梨醇振荡，然后4℃3000g离心5分钟，弃上清。重复清洗三次，即获得感受态酵母细胞。

电击转化过程

①.吸取含6个表达单元的ppiczαa质粒(最多10ug)加入100μl感受态的1.5mlep管中，轻柔混匀，置冰上。

②.将感受态细胞转移到电转杯中，杯子插进电转仪，电转仪设置好程序，开始电击转化。

③.电击转化结束后，迅速拿出电转杯，加入1ml冷ypd/sorbitol，再吸出放入ep管，30度孵育1-2小时(不要振荡)。

挑选阳性克隆

①.轻度离心富集菌体后，弃去一半上清液，余下菌液均匀涂布在含博莱霉素(1％，为了获得转入多拷贝的菌株，抗生素浓度提高20倍)的ypd/sobitol平板。平板于30℃孵育72-96小时。

②.挑选阳性克隆，加入50mlypd培养基内(zeocin+)30℃培养过夜(250rpm)。

③.第二天，检测菌液od值大约在1.5时取10ml菌液作为诱导前的对照样品，离心收集上清液。剩下的培养液加入0.5％的甲醇诱导72小时。诱导完成后，收集所有菌液，4℃3000g离心30分钟，取上清制样。

④.获得阳性克隆，sds-page分离蛋白并用考马斯亮蓝染色，检测成功诱导目标蛋白表达的阳性克隆(图8)。

3.酵母菌发酵

本阶段所用的培养基和溶液配方：

ptm1溶液：cuso4·5h2o6g/l，naci0.08g/l，mnso4·h2o3g/l，na2moo40.2g/l，h3bo30.02g/l，cocl20.5g/l，zncl220g/l，feso4·7h2o65g/l，h2so45ml/l，生物素0.2g/l，过滤除菌。

bsm无机培养基：85％h3po426.7ml/l，caso4·2h2o0.93g/l，k2so418.2g/l，mgso4·2h2o14.9g/l，koh4.13g/l，甘油40g/l，pmt14.0ml/l(不能灭菌，使用前添加)，25％氨水调ph5.0或10g/l硫酸铵调ph5.0，

酵母菌发酵过程

①.一级种子制备取一只甘油管基因工程细胞，融化后吸取500μl接入50mlypd培养基，220rpm，30℃培养18小时。检测菌体密度(od600)约为1-2，镜检无杂菌污染，作为一级种子液。

②.二级种子制备将一级种子液20ml接入500mlypd培养基，220rpm，30℃培养10小时。检测菌体密度(od600)达约为2-4。镜检无杂菌污染，作为二级种子液。

③.发酵罐准备16lbsm无机培养基(无ptm1)在发酵罐中进行灭菌,灭菌条件121℃，20分钟，冷却至30℃后，加入无菌的64mlptm1。

④.发酵罐接种二级种子液以5％比例接种于发酵罐的培养基中。发酵温度为30.0±0.5℃，初始ph5.00±0.05，初始转速200rpm培养，通气量0.5vvm，通过转速和风量使溶氧控制在20％。

⑤.发酵罐发酵发酵24小时左右，碳源消耗完毕时，溶氧迅速上升,此时菌体湿重达到约80g/l。随后每小时200ml/h的速率补加体积百分比50％的甘油溶液(每升添加10mlptm1)。通过调节搅拌转速、空气流量、罐压使溶氧水平维持在30％以上。补加甘油约6小时后，菌体湿重约150g/l时，停止补料。

⑥.诱导目的蛋白表达待溶氧上升时，将ph值控制调为6.20±0.05，开始加入甲醇(每升添加12mlptm1)诱导。初始2小时甲醇(100141190，购自国药集团化学试剂有限公司)诱导加入量控制在25ml/h。随后6个小时内逐步将甲醇速度提高至80ml/h。维持溶氧值30％。甲醇诱导60小时后发酵结束。酵母菌生长曲线如图9所示。

4.发酵液处理

本步骤中用到的溶液配方

100mmpmsf溶液(100ml)：称量0.174g晶体pmsf(10837091001，购自sigma-aldrich)溶于100ml乙醇中，混合溶解后4℃保存。

trisbase溶液：121.14gtris盐溶解到1l蒸馏水中，溶解后制成1mtrisbase溶液，4℃保存。

发酵产物处理过程

①.收集上清液收集所有发酵培养物，立即按照0.1％比例添加蛋白酶抑制剂pmsf,混匀后4℃3000g离心30分钟，取含有目的蛋白的上清液。

②.用trisbase调整上清液ph值至8.0，4℃10000g离心15分钟去除不溶物，所得澄清液用于后续纯化。

实施例3.酶切后不带标签的sdss1蛋白纯化过程。

1.阴离子交换纯化条件：

本步骤所用的缓冲液

缓冲液a：20mmtris-hcl，1mmedta，5mmdtt，110mmnacl，8m尿素，ph8.0。

缓冲液b：20mmtris-hcl，1mmedta，5mmdtt，0.5mnacl，5％甘油，ph8.0。

缓冲液c：20mmtris-hcl，1mmedta，5mmdtt，ph8.0。

deae阴离子交换纯化过程

a.平衡，以线速度300cm/h将缓冲液a平衡deaesepharosefastflow阴离子柱(17-0709-01，购自ge生命科学)5cv；

b.上样，以线速度150cm/h将处理好的蛋白液上柱；

c.清洗，以线速度300cm/h用缓冲液c清洗柱子10cv

d.洗脱，以线速度300cm/h用缓冲液b洗脱蛋白5cv，10mau，100mau/min开始收集，50mau，75mau/min结束收集(图10a)。

e.检测，收集纯化的蛋白，进行sds-page检测，分析纯度(图10b)。

2.亲和层析纯化条件：

本步骤所用的缓冲液

缓冲液a：20mmtris-hcl，1mmedta，5mmdtt，8m尿素，ph8.0。

缓冲液b：20mmtris-hcl，1mmedta，5mmdtt，0.5m咪唑，5％甘油，8m尿素，ph8.0。

histrapexcel亲和层析纯化过程

a.平衡，以线速度300cm/h将缓冲液a平衡histrapexcel柱(17-3712-06，购自ge生命科学)5cv；

b.上样，以线速度150cm/h将处理好的蛋白液上柱；

c.清洗，以线速度300cm/h用缓冲液a清洗柱子10cv；

d.洗脱，以线速度300cm/h用缓冲液b洗脱蛋白5cv，10mau，100mau/min开始收集，50mau，75mau/min结束收集(图11a)。

e.检测，收集纯化的蛋白，进行sds-page检测，分析纯度(图11b)。

3.疏水层析纯化条件：

本步骤所用的缓冲液

缓冲液a：20mmtris-hcl，1mmedta，5mmdtt，8m尿素，1m硫酸铵，ph8.0。

缓冲液b：20mmtris-hcl，1mmedta，5mmdtt，5％甘油，8m尿素，ph8.0。

疏水层析纯化过程

a.平衡，以线速度300cm/h将缓冲液a平衡octylsepharose4fastflow柱(17-0946-02，购自ge生命科学)5cv；

b.上样，以线速度150cm/h将处理好的蛋白液上柱；

c.清洗，以线速度300cm/h用缓冲液a清洗柱子10cv；

d.洗脱，以线速度300cm/h用缓冲液b洗脱蛋白5cv，10mau，100mau/min开始收集，50mau，75mau/min结束收集(图12a)。

e.检测，收集纯化的蛋白，进行sds-page检测，分析纯度(图12b)。

4.多模式层析captoadhere纯化条件：

本步骤所用的缓冲液

缓冲液a：20mmtris-hcl，1mmedta，5mmdtt，8m尿素，ph8.0。

缓冲液b：20mmtris-hcl，1mmedta，5mmdtt，5％甘油，8m尿素，1mnacl，ph8.0。

多模式层析captoadhere纯化过程

a.平衡，以线速度300cm/h将缓冲液a平衡captoadhere柱(28-4058-44，购自ge生命科学)5cv；

b.上样，以线速度150cm/h将处理好的蛋白液上柱；

c.清洗，以线速度300cm/h用缓冲液a清洗柱子10cv；

d.洗脱，以线速度300cm/h用缓冲液b洗脱蛋白5cv，10mau，100mau/min开始收集，50mau，75mau/min结束收集(图13a)。

e.检测，收集纯化的蛋白，进行sds-page检测，分析纯度(图13b)。

5.反相纯化的纯化条件：

本步骤所用的缓冲液

缓冲液a：10mmtrishcl，ph7.5

缓冲液b：60％乙腈，10mmtrishcl，ph7.5

反相纯化过程

a.平衡，以线速度300cm/h将缓冲液a平衡source15rpcst4.6/100柱

(17506801，购自ge生命科学)5cv；

b.上样，以线速度150cm/h将处理好的蛋白液上柱；

c.清洗，以线速度300cm/h用缓冲液a清洗柱子10cv；

d.洗脱，以线速度300cm/h用缓冲液b洗脱蛋白5cv，10mau，100mau/min开始收集，50mau，75mau/min结束收集(图14a)。

e.检测，收集纯化的蛋白，进行sds-page检测，分析纯度(图14b)。

实施例4.带his标签的sdss1蛋白表达纯化。

本步骤中用到的溶液配方

平衡缓冲液(50ml)：50mltris-hcl，ph7.5，20mm咪唑，300mmnacl，5mm2-巯基乙醇。

洗涤缓冲液(50ml)：50mltris-hcl，ph7.5，40mm咪唑，300mmnacl，5mm2-巯基乙醇。

低盐缓冲液(50ml)：50mltris-hcl，ph7.5，40mm咪唑，5mm2-巯基乙醇。

洗脱缓冲液洗(50ml)：tris-hcl，ph7.5，350mm咪唑，5mm2-巯基乙醇。

蛋白纯化操作步骤

①.柱子平衡，用15ml平衡5mlni-nta琼脂糖凝胶柱(30210，购自qiagen)。

②.蛋白挂柱，澄清的酵母培养上清液上柱。

③.柱子洗涤，用100ml洗涤缓冲液洗涤柱子。

④.柱子脱盐，用10ml低盐缓冲液清洗柱子去盐。

⑤.蛋白洗脱，用50ml洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，分部收集洗脱组份，用sds-page检测组分中的蛋白(图15)。

⑥.蛋白浓缩，检测到纯化目的蛋白的溶液用3k浓缩管(ufc900508，购自millipore)进行蛋白浓缩。

序列表

<110>上海清流生物医药科技有限公司

<120>一种蛋白药物的发酵生产工艺

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<160>18

<170>siposequencelisting1.0

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<213>人工序列(artificialsequence)

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