本发明涉及抗生素的分离纯化方法，具体地说是从非达霉素发酵菌丝体中提纯非达霉素的一种方法。
背景技术：
非达霉素（fidaxomicin）是通过指孢囊菌发酵产生的一种18元环结构的新型大环内酯类抗生素，分子式c52h74cl2o18。非达霉素属于窄谱型抗菌药物，主要抗革兰阳性需氧及厌氧菌、艰难梭菌，对耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌、产气夹膜梭菌和肠球菌有良好的抗菌作用，而对革兰阴性菌抗菌活性极弱。非达霉素对艰难梭菌的mic50和mic90均明显低于万古霉素或甲硝唑，治疗减少艰难梭菌感染的复发率和综合治愈率显著优于万古霉素和甲硝唑，且产生抗性的倾向低，具有延长的抗生素后效应、治疗方案简单、交叉耐药性低和不良反应少等优点。
目前，提纯非达霉素的方法，通常是采用非达霉素发酵菌发酵产生非达霉素，然后经过分离、纯化，由此得到高纯度的非达霉素。如cn200880009132公开了一种非达霉素的制备方法，该方法将大孔树脂加入到非达霉素发酵液中，在发酵完成后，首先通过筛析从培养基中分离固体物质（包括吸收剂树脂），用有机溶剂进行洗脱，减压浓缩得非达霉素粗品，粗品再经过反相二氧化硅柱层析（meoh/h2o/acoh）、浓缩（浓缩至原始体积的三分之一）、过滤、干燥、结晶过程，可得到纯度为78-94.7%的非达霉素。该方法存在以下缺点：（1）发酵液过滤后树脂和菌丝体共存，筛分困难，树脂难于重复利用，环保处理困难；（2）洗脱液未经脱色除杂，直接得到粗提物，含杂质较多，对下游纯化介质造成的损伤大；（3）反相二氧化硅柱层析采用meoh/h2o/acoh的三相洗脱系统，其中醋酸不仅会破坏柱体本身的键合相，降低反相柱的利用率，而且醋酸沸点较高为118℃，在回收溶剂时，水和甲醇可以回收完全，但是醋酸则只能回收一部分，这样一则回收的混合溶剂比例发生变化而无法重复使用，而造成生产成本提高，二则有一部分酸残留于浓缩液中，有可能会与非达霉素发生反应或残存于结晶液中而导致非达霉素精粉纯度降低。cn201110104051公开的非达霉素的制备方法，是反复经过大孔树脂、硅胶柱、凝胶柱、反相柱等层析柱进行分离，最后经薄层制备色谱进行富集。该方法的缺点是反复用多种层析柱，制备方法太复杂繁琐，而且经过多次层析柱分离亦会使收率低，另外使用薄层制备色谱进行富集，批处理量太小，不适于规模化生产。wo2011146621a2公开的一种高纯度非达霉素的制备方法，该方法用制备液相对非达霉素粗品进行制备，可得到纯度大于93%的非达霉素精粉，此方法虽然步骤简单，但是其所需设备比较昂贵，而且制备出的精粉量较少，不适合于工业化生产。
技术实现要素：
本发明的目的就是要提供一种操作简便、成本低廉，适于工业化规模生产的非达霉素的提纯方法。为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：首先将非达霉素发酵液过滤、浸提，浸提液用水稀释后通过大孔树脂脱色、吸附、解析，所得解析液经浓缩、萃取、干燥后得非达霉素粗品；然后将非达霉素粗品用极性有机溶剂溶解，注入含有硝酸银的大孔吸附树脂柱进行层析分离，得到高纯度的非达霉素精粉，具体制备步骤包括：
a）常温下将非达霉素发酵液过滤得到菌丝体，然后用极性有机溶剂浸泡菌丝体并进行固液分离，得非达霉素浸提液；b）将上述非达霉素浸提液用水稀释后导入大孔脱色树脂柱中进行脱色处理，得非达霉素脱色液；c）将非达霉素脱色液导入大孔吸附树脂柱中进行吸附，吸附饱和后的树脂用解析剂梯度解析，解析液浓缩、萃取、干燥后得到非达霉素粗品；d）将非达霉素粗品用极性有机溶剂溶解，然后将溶解液注入含有硝酸银的大孔吸附树脂柱，用含有硝酸银的洗脱剂进行梯度洗脱，收集洗脱液，合并hplc测定非达霉素含量大于97%的洗脱液，浓缩、干燥后得到非达霉素精粉。
步骤a所述的极性有机溶剂，可选择乙醇、甲醇、丙醇、丁醇等溶液。其中以体积百分含量为80～95%的甲醇或乙醇溶液为优选。其加入量以每千克菌丝中加入2～4升为优选。本发明步骤b中的大孔脱色树脂可选用lx98、或d301树脂其中以lx98树脂为优选。本发明步骤c所述的大孔吸附树脂可选用hz-816、hz818或d312树脂，其中以hz816树脂为优选。本发明步骤d中所述的大孔吸附树脂选用hz-816、hz818或d312树脂，其中以hz-816为优选树脂。本发明所述解析剂或洗脱剂均为选用甲醇、乙醇、丙酮，其中以丙酮或乙醇溶液为优选；所述萃取剂可选用乙酸乙酯、乙酸丁酯、正丁醇，其中以乙酸乙酯或乙酸丁酯为优选。
本发明方法用解析剂对吸附树脂进行梯度洗脱时，洗脱剂的浓度依次有一定的浓度差，如洗脱剂的体积比浓度可依次为40%、80%或50%、75%。
本发明中浸泡菌丝体的极性有机溶剂的浓度可选择以体积比计为65—95%的极性有机溶剂。由于采用了上述技术方案，本发明取得如下有益效果：本发明方法有效排除了发酵次级代谢产物的干扰，用含有硝酸银的洗脱剂进行梯度洗脱有效去除了非达霉素同系物，提高了非达霉素的品质及产品收率。整个工艺简单、易操作；所提纯的非达霉素精粉可供药品使用；非达霉素纯度大于97.5%，全程总收率大于48%。所用溶剂均为常规溶剂，毒性小，适宜于工业化生产。
具体实施例
下述实施例仅用于阐述实现本发明的方法，不应理解为对本发明的限制，所有基于本发明的思路做出的修改和变化都应归于本发明的保护范围。本发明中所使用的游动放线菌菌株n12w0304保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为cgmccno.7043。非达霉素发酵液可按照现有技术制得。大孔树脂hz-816、hz-818，上海华震科技公司、d312、d301，安徽三星树脂科技有限公司；大孔树脂lx98，西安蓝晓公司；；甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等试剂均为市售。本发明使用的高效液相色谱仪为安捷伦110型检测器。
实施例1
取非达霉素发酵液10l，发酵单位为520μg/ml。将非达霉素发酵液过滤，得到2.6kg菌丝体。在上述菌丝体中加入体积比浓度为80%的甲醇5.0l，搅拌浸提1小时后过滤，收集非达霉素浸提液。浸提液加水稀释至甲醇浓度为30%后导入大孔脱色树脂lx98柱进行脱色，树脂装量为500ml，流速为1000ml/h。脱色液导入大孔吸附树脂d301柱进行吸附，树脂装量为500ml，流速为1000ml/h。吸附饱和后的树脂依次用浓度为40%、80%的甲醇溶液解析，流速为500ml/h，分段收集解析液。将浓度为80%的甲醇解析液在50℃下减压浓缩至无溶剂流出，然后用乙酸乙酯萃取，萃取液浓缩、干燥得到非达霉素粗品6.1g，hplc含量为66.8%。将上述所得非达霉素粗品用甲醇溶解至浓度为100g/l,然后注入500ml的含有硝酸银的hz-818大孔吸附树脂层析柱，再依次用浓度40%、80%含5%硝酸银的甲醇溶液洗脱，流速为500ml/h，分段收集洗脱液。合并hplc含量大于96%的非达霉素洗脱液并将其浓缩、萃取，结晶干燥得到非达霉素精粉2.45g，hplc含量为98.1%。
实施例2
非达霉素发酵液10l，发酵单位为625μg/ml。将非达霉素发酵液过滤，得到2.7kg菌丝体。在上述菌丝体中加入体积比浓度为95%的乙醇10l，搅拌浸提1小时后过滤，收集非达霉素浸提液。浸提液加水稀释至乙醇浓度为35%后导入大孔脱色树脂lx98柱脱色，树脂装量为500ml，流速为1000ml/h。脱色液再次导入大孔吸附树脂d312柱进行吸附，树脂装量为500ml，流速为1000ml/h。吸附饱和后的树脂依次用浓度为40%、80%的乙醇溶液洗脱，流速为500ml/h，分段收集洗脱液。将上述非达霉素解析液浓缩，然后用乙酸丁酯萃取，萃取液浓缩、干燥得到非达霉素粗品7.4g，hplc含量为68.0%。将上述所得非达霉素粗品用丙酮溶解至浓度为120g/l,然后注入1000ml的含有硝酸银的hz-816大孔吸附树脂层析柱，再依次用体积比浓度为50%、75%含5%硝酸银的丙酮溶液洗脱，流速为1000ml/h，分段收集洗脱液。合并hplc含量大于97%的非达霉素洗脱液并将其浓缩、萃取，结晶干燥得到非达霉素精粉3.1g，hplc含量为98.5%。