与葡萄果皮颜色相关的SNP分子标记及应用的制作方法

本发明涉及分子生物学及作物育种技术领域，具体地说，涉及一种与葡萄果皮颜色相关的snp分子标记及应用。

背景技术：

葡萄是我国主要水果之一，我国鲜食葡萄产量多年稳居世界首位，栽培面积位居世界第二，对葡萄而言，果皮颜色是吸引消费者得一种重要果实性状。

目前，育种人员在葡萄育种工作中，主要采用的是传统的杂交育种手段，杂交种子培育成苗，经过数年童期后，再对杂种单株的生长结果习性和果实性状进行评价，以此来选择和淘汰杂种单株，该方法育种周期长，耗时耗力，耗土地资源，育种效率低，随着分子生物学技术的迅速发展，以及葡萄基因组测序的完成，分子标记辅助育种技术，可以对杂种单株进行早期选择，提前淘汰非目标性状单株。

葡萄果皮颜色主要受到花青苷(花青素)含量的影响，花青苷的合成是由多种合成酶基因调节，都属于多基因家族myb，研究表明myb结构和功能变异与果皮颜色有着密切关系，myb基因上插入的一个逆转座子导致了葡萄果皮无色，果实呈现出绿色，而没有该转座子的葡萄果皮有色，表现出从粉色、紫色到黑色的连续变化，但是有色与无色类似质量性状，开发有色/无色分子标记辅助选择，可以提高育种效率，节省育种成本。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种与葡萄果皮颜色相关的snp分子标记及应用。

为了实现本发明目的，本发明提供一种与葡萄果皮颜色相关的snp分子标记，所述snp分子标记位于葡萄vvmyba3基因上，snp位点位于vvmyba3基因cdna序列第2688位碱基，该处碱基为a或c。

其中，葡萄vvmyba3基因cdna序列如seqidno:1所示(genbank：ab442011.1)。seqidno:1所示序列的第2688位碱基为n，n为a或c。

本发明所述snp分子标记的aa基因型对应的葡萄果皮为无色，所述snp分子标记的cc或ac基因型对应的葡萄果皮为有色。

本发明还提供基于kasp技术开发的用于扩增权利要求1或2所述分子标记的引物，包括正向引物f1、正向引物f2和反向引物r，引物序列分别如下(seqidno:2-4)：

正向引物f1：5′-ctccttaagaagatatatactccatcata-3′

正向引物f2：5′-tccttaagaagatatatactccatcatc-3′

反向引物r：5′-gccgcatcaaaggctagaattatgc-3′

本发明还提供含有所述kasp引物的检测试剂或试剂盒。

本发明还提供所述snp分子标记、所述kasp引物或所述检测试剂或试剂盒在葡萄果皮早期筛选中的应用。包括以下步骤：

1)提取待测葡萄样品的dna；

2)kasp反应：以步骤1)提取的dna为模板，向其中加入特异的kaspprimermix和通用的kaspmastermix，进行pcr扩增；

3)分析pcr扩增产物。

优选地，kasp反应在384微孔板中进行(货号04729749001，roche)，pcr反应体系为：总体系3μl，dna模板1μl，浓度为4ng/ul，kaspprimermix1μl，2×kaspmastermix1μl；其中所述kaspprimermix中正向引物f1、f2和反向引物r的浓度均为10μm，kaspmastermix(购自lgc公司,www.lgcgroup.com，货号kbs-1016-002)。

pcr反应条件如下：

优选地，步骤3)对pcr扩增产物进行荧光检测分析：aa基因型对应的葡萄果皮为无色，cc或ca基因型对应的葡萄果皮为有色。

本发明还提供所述snp分子标记、所述kasp引物或所述检测试剂或试剂盒在葡萄分子标记辅助育种中的应用。

本发明还提供所述snp分子标记、所述kasp引物或所述检测试剂或试剂盒在葡萄果皮颜色基因分型中的应用。

本发明首次公开了一种用于筛选葡萄果皮无色/有色的snp分子标记，该snp位点位于葡萄vvmyba3基因中，通过基因分型检测，若该位点核苷酸为c/c或c/a，葡萄果皮则表现为有色，若该位点核苷酸为a/a，葡萄果皮表现为无色，以此标记开展葡萄果皮早期辅助选择，可以大大提高育种进程。

附图说明

图1为本发明实施例2中基于kasp技术的葡萄vvmyba3基因分型结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如sambrook等分子克隆实验手册(sambrookj&russelldw,molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1与葡萄果皮颜色相关的snp分子标记的开发

通过对北京市林业果树科学研究院葡萄资源圃内的23个绿色葡萄品种和25个有色葡萄品种进行重测序数据分析，结果发现在vvmyba3基因cdna序列(ab442011.1)第2688位碱基为a/c突变的snp位点。命名为vvmyba32688a/c。设计可用于kasp技术的特异引物：

正向引物f1：5′-ctccttaagaagatatatactccatcata-3′

正向引物f2：5′-tccttaagaagatatatactccatcatc-3′

反向引物r：5′-gccgcatcaaaggctagaattatgc-3′

上述引物由lgc公司合成。

绿色葡萄品种为：莎丽、新玫瑰、康能玫瑰、葡萄园皇后、戈尔比、维多利亚、亚历山大、瑞都香玉、牛奶、凤凰51号、香妃、艾莫无核、黎明无核、喜乐无核、国立一号、王妃、意大利、白罗莎、京香玉、奥古斯特、贵妃玫瑰、沙芭珍珠、无核白鸡心。

有色葡萄品种为：京秀、瑞都脆霞、艳红、早玫瑰香、玫瑰香、美人指、红双味、奇妙无核、爱神玫瑰、金星无核、圣诞玫瑰、塔米娜、里扎马特、瑞都早红、瑞都红玉、红鸠、绯红、凤凰51号、奥迪亚无核、摩尔多瓦、火焰无核、红宝石无核、克瑞森无核、红地球、瑞比尔。

实施例2基于kasp技术开发的用于扩增snp分子标记的引物及应用

用该snp标记验证了北京市农林科学院林业果树研究所葡萄资源圃保存的119个葡萄品种和251个杂种后代植株，

1、dna提取

选取待测品种的幼嫩叶片，约0.1g，使用新型植物基因组dna提取试剂盒(aidlab，货号dn15),用检测dna质量，a260/280介于1.7-1.9之间，将dna稀释成10ng/μl备用。

2、基于kasp技术的pcr反应

按照lgc公司提供的标准实验流程，整个实验步骤按照

genetypingassay,manualpart#15004070进行。kasp反应在384微孔板中进行，反应体系为3μl。

pcr反应条件如下：

3、snp分子标记与葡萄果皮颜色性状的关联度分析

用该snp标记验证了北京市农林科学院林业果树研究所葡萄资源圃保存的119个葡萄品种和杂交后代251个植株，基因分型和表型统计结果见表1，由表1可以看出，该分子标记用于鉴定有色/绿色植株葡萄的准确率为100％。

表1

基于kasp技术的葡萄vvmyba3基因分型结果如图1所示，图中左上角的分型结果为cc，对应的材料果皮颜色为有色，图中部分型结果为ca，对应的材料果皮颜色为有色，图中右下角的分型结果为aa，对应的材料果皮颜色为绿色，可见，利用该snp标记可用于区分葡萄果皮颜色的有无。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>北京市林业果树科学研究院

<120>与葡萄果皮颜色相关的snp分子标记及应用

<130>khp171117780.3

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>14315

<212>dna

<213>葡萄(vitisvinifera)

<400>1

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