土沉香的鉴定的制作方法

本发明涉及分子生物学领域，具体地说，涉及用于鉴定土沉香的snp分子标记及其应用。

背景技术：

土沉香(学名：aquilariasinensis(lour.)spreng.)，被子植物门(angiospermae)，双子叶植物纲(dicotyledoneae)，桃金娘目(myrtiflorae)，瑞香科(thymelaeaceae)，沉香属(aquilaria)。产中国广东、海南、广西、福建，喜生于低海拔的山地、丘陵以及路边阳处疏林中。老茎受伤后所积得的树脂，俗称沉香，可作香料原料，并为治胃病特效药；树皮纤维柔韧，色白而细致可做高级纸原料及人造棉；木质部可提取芳香油，花可制浸膏。形态学鉴定是土沉香鉴定中常采用的方法，但形状特征易受生境、气候、生理状况等的影响而常常导致主观辨别上的偏差，仅靠形态差异难以准确鉴定。

近年来，利用分子生物学技术进行物种鉴定已经在一些珍惜物种及检验检疫方面得到了应用，如何利用分子生物学技术建立高效、快速、灵敏且准确度高的鉴定方法将是土沉香鉴定领域的关键技术之一。

技术实现要素：

本发明第一个目的是提供一种用于鉴定土沉香的snp分子标记，该snp分子标记为seqidno.1所示序列的第65位碱基为c，若第65为碱基为c则鉴定为土沉香。

本发明第二个的目的是将上述snp分子标记在应用于土沉香的鉴定。

本发明第三个的目的是提供一种用于鉴定土沉香的核苷酸序列，所述核苷酸序列包括seqidno.1，或者seqidno.1所对应的cdna或mrna，所述seqidno.1序列的第65位碱基为c。

本发明第四个的目的是提供一种包含对应于seqidno.1序列至少10个连续核苷酸并且包含所述序列的第65位碱基为c的探针。

更具体的说，所述探针序列选自seqidno.6所示序列。

本发明第五个的目的是提供一种鉴定土沉香的试剂盒，包括用于检测seqidno.1或包含有seqidno.1序列的核苷酸的反应体系，所述反应体系包含用于特异性地检测seqidno.1序列第65位碱基为c的存在与否的一种或多种引物和/或探针。

所述试剂盒的反应体系体可选择荧光pcr反应体系或测序反应体系。

所述引物或探针可选自seqidno.2至6中定义的引物或探针。

所述试剂盒还包括阳性对照、阴性对照和空白对照。在一个具体的实例中，以土沉香叶片dna为阳性对照，云南沉香叶片dna为阴性对照，灭菌双蒸水为空白对照。

本发明第六个的目的是提供一种鉴定土沉香试剂盒的制备方法，包括制备反应体系的步骤，所述反应体系包含用于特异性地检测seqidno.1序列第65位碱基为c的存在与否的一种或多种引物和/或探针。

本发明还提供了一种鉴定土沉香的方法，包括提取待测植物dna和pcr反应步骤，进一步的包括检测seqidno.1序列第65位碱基为c的存在与否的步骤。

检测seqidno.1序列第65位碱基为c的存在与否的步骤可采用荧光pcr反应步骤或测序反应步骤。

上述snp分子标记及应用、以及用于鉴定土沉香的核苷酸序列、探针、试剂盒、制备方法和检测方法，均可用于从土沉香、马来沉香或云南沉香中鉴定出土沉香。

本发明建立了基于snp位点的分子生物学技术鉴定土沉香的方法体系，能迅速将土沉香与马来沉香、云南沉香等近源树种区分开，对于口岸物种检验工作及品种资源鉴别、种质资源保护具有重大意义。

附图说明

图1是土沉香、马来沉香和云南沉香的序列比对图。

图2是土沉香荧光pcr扩增曲线图。

图3是马来沉香荧光pcr扩增曲线图。

图4是云南沉香荧光pcr扩增曲线图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细的说明，这些具体的实施例仅仅是在不违背本发明精神下的有限列举，并不排除本领域的一般技术人员把现有技术和本发明结合而产生的其他具体的实施方案。

以下实施例均按照常规实验条件，如sambrook等分子克隆实验手册(newyork:goldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的操作技术规程，或按照制造厂商所建议的实验条件。

实施例1土沉香snp分子标记的获得

rdna上的5.8、18和28srrna基因有极大的保守性,即存在着广泛的异种同源性。而由于its区不加入成熟核糖体,所以its片段在进化过程中承受的自然选择压力非常小，因此能容忍更多的变异。在绝大多数的真核生物中表现出了极为广泛的序列多态性,即使是亲缘关系非常接近的2个种都能在its序列上表现出差异,显示最近的进化特征。这种特点使its适合于物种的分子鉴定以及属内物种间或种内差异较明显的系统发育关系分析。由于its的序列分析能实质性地反映出属间、种间的碱基对差异,此外its序列片段较小、易于分析,目前已被广泛应用于不同种间或近似属间的系统发育研究中。

1、根据ncbi数据库公开的its基因，设计相应的引物进行pcr扩增，采用上游引物(its):5’-cgtaacaaggttttcgtaggtgaac-3’(seqidno.2)、下游引物(its):5’-gctacgttcttcatcgat-3’(seqidno.3)和如下的pcr反应体系和pcr反应程序，以经鉴定的土沉香(aquilariasinensis(lour.)spreng.)、马来沉香(aquilariamalaccensis)和云南沉香(aquilariayunnanensiss.c.huang)3个沉香属物种基因组dna为模板，进行pcr扩增，扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测并在紫外凝胶成像系统观察合格后进行测序。

其中，vazymeacetaqdna酶(货号p401-d1250u)

所述沉香属物种基因组dna的提取采用杭州百迈生物股份有限公司的植物基因组dna提取试剂盒(koning^tm木质部基因组dna提取试剂盒，货号f2612)，参照试剂盒说明进行操作，将提取的dna置于-20℃下保存备用。

2、序列比对及物种特异的分子标记的开发

将步骤1获得的3个沉香属物种的its基因序列，通过dnaman软件进行序列比对寻找合适的snp位点。序列比对结果如图1所示，经分析发现位于土沉香its基因内的seqidno.1所示序列的第65个碱基为c，而其它沉香属物种为t。即seqidno.1所示序列的第65个碱基为c是土沉香的snp位点(序列中方框所示位置)，seqidno.1基因序列为：

实施例2土沉香snp分子标记在荧光pcr扩增法鉴定土沉香中的应用

本实施例是在获得土沉香snp位点的基础上，针对包含所述snp位点的基因序列，利用primerpremier5.0分别设计出特异性上游引物f、下游引物r和探针，引物和探针由苏州金唯智生物科技有限公司合成。利用所述特异性引物和探针对土沉香样品、马来沉香样品和云南沉香样品进行荧光pcr扩增检测。具体的，所述上游引物f、下游引物r和探针分别是：

上游引物f：5’-gatgcgcgctatgattgaac-3’(seqidno.4)

下游引物r：5’-cggtgtatgccatgatgca-3’(seqidno.5)

探针：5’-agggcatgatgcgcatgatgct-3’(seqidno.6)

在一个具体实例中，探针5’端标记fam报告荧光染料，3’端标记bhq1淬灭荧光染料。

以3个沉香属物种基因组dna为模板，20μlpcr反应体系中包括：

反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整，也可用市售实时荧光pcr检测试剂盒进行体系配制，反应体系参照说明书进行。

荧光pcr反应程序：

包括以下步骤：1)提取待测植物的基因组dna；2)以待测植物的基因组dna为模板，利用引物和探针，pcr扩增土沉香its基因；3)采用荧光pcr法检测pcr扩增产物，扩增曲线有标准的s型曲线，且ct≤36，则待测植物为土沉香物种。并且以土沉香叶片dna为阳性对照，云南沉香叶片dna为阴性对照，灭菌双蒸水为空白对照。

当分子生物学检测的阴性、阳性、空白对照试验结果正常，被检测样品有明显的荧光增幅现象，则判断样品为土沉香。

本实施例2采用的土沉香、马来沉香和云南沉香样品也是经现有方法鉴定不同与实施例1的另一组样品，检测结果如图2至4所示，仅土沉香样品的荧光pcr扩增出的曲线出现s型曲线，且ct≤36，而其他沉香类没有出现s型曲线。并且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常。这表明本发明的针对土沉香its基因snp位点具有极高的特异性，因此可以用于快速鉴定土沉香。

序列表

<110>杭州百迈生物股份有限公司

浙江省检验检疫科学技术研究院

<120>土沉香的鉴定

<130>201701

<150>2017108138776

<151>2017-09-11

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>103

<212>dna

<213>土沉香(aquilariasinensis)

<400>1

cagggcggtgtatgccatgatgaacggtggtgtgtgcttagcctgccgtcgttagagcat60

catgcgcatcatgcccttgaggtatgtttcgtggacaaccccg103

<210>2

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

cgtaacaaggttttcgtaggtgaac25

<210>3

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

gctacgttcttcatcgat18

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

gatgcgcgctatgattgaac20

<210>5

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

cggtgtatgccatgatgca19

<210>6

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

agggcatgatgcgcatgatgct22