本发明属于生物化学技术领域，具体涉及一种多头绒泡菌的代谢物作为生物标志物的应用。
背景技术：
纳米二氧化钛(ntio2)已被广泛应用于造纸、涂料、纺织、化妆品、动物饲料等领域。纳米二氧化钛是中国生产第二重要的纳米材料，其年产量为800-1800t，欧洲和美国的年产量分别为55-3000t和7800-38000t。要将ntio2广泛地应用于商业和释放到环境中需要深入了解其毒性机制，当暴露于阳光或紫外线时，ntio2显示出很强的细胞毒性。研究显示：当ntio2暴露于阳光或经过紫外线辐射后会通过光催化产生丰富的活性氧(ros)，如o2·-和ho2·,这些ros会造成环境中动物、植物、细菌和藻类细胞的氧化损伤；但是，关于生物体在黑暗环境下对ntio2毒性的应对机制的没有报道。
多头绒泡菌是一种典型的黏液霉菌真菌，主要生活在黑暗环境中，在发育周期内可分化成多种细胞类型。多头绒泡菌对环境刺激敏感，如化学物质、磁场、光和重力。此外，当多头绒泡菌生长在固体培养基上时，可以覆盖高达几平方厘米的面积而仍然作为单个细胞存在。单个大体积的多头绒泡菌可以提供足够的代谢产物进行检测。
代谢组学用于检测细胞、组织和其他生物基质中小分子量代谢产物的水平，能反映出机体对遗传修饰、生理变化和环境刺激的动态反应。非靶向代谢组学分析可以提供生物体内代谢物扰动的准确信息，因此被认为是发现毒物暴露生物标志物、评估毒物作用模式、研究环境风险的有力手段。因具有高分辨率、高灵敏度和综合代谢物数据库，质谱(ms)被认为是代谢组学和气相色谱质谱(gc/ms)的主要分析方法。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种多头绒泡菌的代谢物作为生物标志物的应用，旨在解决现有环境中的ntio2检测手段有限的技术问题。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明提供一种多头绒泡菌的代谢物作为生物标志物，在检测黑暗环境中纳米二氧化钛的应用；其中，
所述代谢物包括果糖-6-磷酸、3,6-脱水-d-半乳糖、葡萄糖、葡萄糖-6-磷酸、5-磷酸核糖、半乳糖、d-阿拉伯糖醇、甘露糖、蔗糖、海藻糖、葡萄糖-1-磷酸、海藻糖-6-磷酸、柠檬酸、琥珀酸、富马酸、苹果酸、肌醇半乳糖苷、酒石酸、草酸、顺乌头酸、异麦芽糖、5-磷酸核酮糖、肌苷、腺苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、鸟苷、胞苷、胞嘧啶、天门冬酰胺、天门冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸盐、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、4-羟基脯氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、o-乙酰-l-丝氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、谷胱甘肽、半胱胺、鸟氨酸、精氨酸、瓜氨酸、亚精胺、腐胺、5-羟基吲哚-3-乙酸、烟酰胺、烟草胺、芒柄花黄素、褪黑素和5-羟基色氨酸中的至少一种。
在本发明中，采用气相色谱质谱的代谢组学，在黑暗条件下研究ntio2对多头绒泡菌的影响。根据多变量模式识别分析发现，至少有60个与糖代谢、氨基酸代谢、核苷酸代谢、多胺生物合成、次生代谢相关的代谢生物标志物被ntio2显著干扰；许多代谢生物标志物和通路都与生物体的抗氧化机制有关，这表明即使在黑暗条件下，ntio2也可能诱发氧化应激；活性氧(ros)，8-羟基-2-脱氧鸟苷(8-ohdg)和总可溶性酚(tsp)的生化水平进一步证实了这一结论。本发明首次以粘液菌为模型探讨ntio2诱导细胞代谢干扰的研究，同时，提供了黑暗条件下ntio2毒性机制的新视角，找到多头绒泡菌的代谢物作为生物标志物可以用于黑暗环境中的ntio2检测；并表明代谢组学可作为快速、可靠和强大的工具来研究生物体、环境和纳米材料之间的相互作用。
附图说明
图1为：黑暗条件下，0mg/ml、5mg/ml、9mg/ml、15mg/ml和18mg/ml浓度ntio2暴露三天对多头绒泡菌生长的影响，以平均值±标准偏差(n＝3)表示；
图2为：样品的pca和opls-da得分图：(a)pca评分图显示9mg/mlntio2处理组和对照组的差异；(b)pca评分图显示15mg/mlntio2处理组和对照组的差异；(c)opls-da得分图显示9mg/mlntio2处理组和对照组的差异；(d)opls-da得分图显示15mg/mlntio2处理组(n＝6)和对照组的差异；对照组、9mg/ml和15mg/mlntio2处理组分别以圆圈○、三角形△、黑条■表示；
图3为：在黑暗条件下ntio2显著扰乱代谢途径的统计图；来自9和15mg/mlntio2处理组的代谢途径分别呈现为白条□和黑条■，统计学显着性线(-log(p值)＝1.30)和高度显着性线(p值＝2)分别以实线和虚线表示；
图4为：在黑暗条件下，多头绒泡菌暴露于9和15mg/mlntio2组与对照组相比观察到的主要代谢扰乱的简化网络图；对每一种处理方法进行折叠变化计算(n＝6)，并将其与对照组的均值进行比较，曝光时间3天；
图5为：通过生物化学的方法测定多头绒泡菌暴露于ntio2下，其ros、8-ohdg和tsp水平；(a)ros水平的变化，
具体实施方式
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例提供一种多头绒泡菌的代谢物作为生物标志物，在检测黑暗环境中纳米二氧化钛的应用；其中，
所述代谢物包括果糖-6-磷酸、3,6-脱水-d-半乳糖、葡萄糖、葡萄糖-6-磷酸、5-磷酸核糖、半乳糖、d-阿拉伯糖醇、甘露糖、蔗糖、海藻糖、葡萄糖-1-磷酸、海藻糖-6-磷酸、柠檬酸、琥珀酸、富马酸、苹果酸、肌醇半乳糖苷、酒石酸、草酸、顺乌头酸、异麦芽糖、5-磷酸核酮糖、肌苷、腺苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、鸟苷、胞苷、胞嘧啶、天门冬酰胺、天门冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸盐、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、4-羟基脯氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、o-乙酰-l-丝氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、谷胱甘肽、半胱胺、鸟氨酸、精氨酸、瓜氨酸、亚精胺、腐胺、5-羟基吲哚-3-乙酸、烟酰胺、烟草胺、芒柄花黄素、褪黑素和5-羟基色氨酸中的至少一种。
在本发明实施例中，采用气相色谱质谱的代谢组学，在黑暗条件下研究ntio2对多头绒泡菌的影响。根据多变量模式识别分析发现，至少有60个与糖代谢、氨基酸代谢、核苷酸代谢、多胺生物合成、次生代谢相关的代谢生物标志物被ntio2显著干扰；许多代谢生物标志物和通路都与生物体的抗氧化机制有关，这表明即使在黑暗条件下，ntio2也可能诱发氧化应激；活性氧(ros)，8-羟基-2-脱氧鸟苷(8-ohdg)和总可溶性酚(tsp)的生化水平进一步证实了这一结论。本发明首次以粘液菌为模型探讨ntio2诱导细胞代谢干扰的研究，同时，提供了黑暗条件下ntio2毒性机制的新视角，找到多头绒泡菌的代谢物作为生物标志物可以用于黑暗环境中的ntio2检测；并表明代谢组学可作为快速、可靠和强大的工具来研究生物体、环境和纳米材料之间的相互作用。
具体地，上述所述代谢物包括糖、糖醇、有机酸、氨基酸、多胺、类黄酮等，被认为是ntio2毒性暴露的潜在生物标志物。更近一步地，代谢物为d-阿拉伯糖醇、酒石酸、黄嘌呤、胞苷、5-羟基吲哚-3-乙酸、烟草胺、芒柄花黄素和谷胱甘肽中的至少一种，在黑暗环境胁迫处理下，多头绒泡菌的该8种代谢物的水平显著升高；可以更好地适合做检测黑暗环境中纳米二氧化钛的生物标志物。更进一步地，黑暗环境中，所述纳米二氧化钛的浓度为9-15mg/ml。
进一步地，所述检测黑暗环境中纳米二氧化钛的步骤包括：
将含有纳米二氧化钛的待测样品在黑暗环境下，对多头绒泡菌进行胁迫处理；
检测所述胁迫处理后的多头绒泡菌中所述代谢物的表达水平。
进一步地，所述胁迫处理的时间为3-5天，优选3天。
进一步地，所述检测黑暗环境中纳米二氧化钛的步骤还包括：
检测所述胁迫处理后的多头绒泡菌中ros、8-ohdg和tsp中至少一种的水平变化。
在本发明实施例中，将多头绒泡菌在黑暗条件下暴露于ntio2，并利用gc/ms的代谢组学技术鉴定其代谢变化。利用模式识别和途径分析识别研究多头绒泡菌的代谢紊乱情况。此外，通过检测活性氧(ros)、8-羟基-2-脱氧鸟苷(8-ohdg)和总可溶性酚(tsp)在内的多种生理因子水平验证和支持代谢组学研究的结果。
要将ntio2广泛地应用于商业和释放到环境中需要更加深入地了解其毒性机制。在光照条件下，ntio2的毒性机制已有了很好的研究。然而，有关ntio2在黑暗条件下对环境和生物体影响的研究没有。与定制的纳米颗粒相比，工业ntio2更能代表实际的环境污染。在本发明实施例中，评估了商业应用中的ntio2对多头绒泡菌生长的潜在影响，并使用基于gc/ms的代谢组学技术来研究ntio2对多头绒泡菌代谢扰动，这种方法是一种快速、可靠和强大的方法，用于识别受毒物暴露扰乱的代谢途径的潜在生物标志物。
在本发明实施例中，在黑暗条件下，多头绒泡菌暴露于剂量逐渐增加的ntio2下3天，确定ntio2的抑制浓度并用于随后的代谢研究。相对低剂量的ntio2(5和9mg/ml)加速了多头绒泡菌的生长，而相对较高剂量的ntio2(15和18mg/ml)抑制了多头绒泡菌的生长(如图1所示)。ntio2被报道可以加速菠菜的生长，其原因是提高了菠菜利用光能的效率以及增强了光合碳反应。显然，该理论不适用于ntio2对多头绒泡菌的生物刺激作用，因为多头绒泡菌是在黑暗条件下暴露于ntio2，此环境下无法进行光合作用。
本实施例中，ntio2对多头绒泡菌的生物刺激作用是通过一种激素作用产生的。激素现象具有高剂量抑制和低剂量刺激双相剂量反应的特征，并已被证实发生在多种不同毒物刺激的各种生物学模型中能解释这一现象的一个假说是，低剂量的毒物会激活生物体中某些通路，这些通路过度补偿有毒物质暴露造成的负面影响。大面积的多头绒泡菌可以提供足够的代谢产物通过基于gc/ms的代谢组学研究单细胞水平的代谢情况，这表明多头绒泡菌是研究生物体接触毒性物质时，单细胞水平上代谢情况的优良细胞模型。
在本实施例中，通过gc/ms为基础的代谢组学在黑暗条件下筛选ntio2暴露的潜在生物标志物，从而确定了ntio2毒性的机制和其干扰代谢的途径。本实施例中，首次使用基于gc/ms的代谢组学技术通过研究多头绒泡菌的代谢物水平确定ntio2影响多头绒泡菌的代谢途径和毒性机制。碳水化合物代谢，包括糖酵解途径和三羧酸循环(tca循环)，在产生细胞所需能量的物质中具有中心作用。碳水化合物被水解成葡萄糖或其他中间产物进入糖酵解途径和tca循环。tca循环是能量生产的代谢枢纽，也是氧化磷酸化主要燃料的生产来源。本实施例代谢组测定的结果显示，当多头绒泡菌暴露于受抑制剂量的ntio2时，tca循环中的中间体柠檬酸、顺式乌头酸、琥珀酸、富马酸和苹果酸的水平下降，这表明tca循环的活性受到了干扰，因此，多头绒泡菌生长受抑制的现象与上述代谢物水平下降直接相关。尽管tca循环在暴露于低剂量ntio2(9mg/ml)(图3所示)的情况下也受到干扰，但这种干扰作用可能与高剂量ntio2处理组观察到的效果不同，因为在低剂量ntio2(9mg/ml)处理组中tca循环中只有代谢物(苹果酸)的水平有所增加(图4所示)。除了tca循环中出现的扰动以外，还观察到糖酵解途径中涉及的代谢物水平的变化：在使用两个浓度(9和15mg/ml)ntio2处理组中检测到一些碳水化合物如异麦芽糖和半乳糖的水平升高，而仅在高剂量(15mg/ml)ntio2处理组中检测到蔗糖、葡萄糖、葡萄糖-1-磷酸的水平显著下降。基于代谢网络图(图4所示)，糖酵解途径中代谢物水平的扰动与参与戊糖磷酸途径(ppp)、核苷酸生物合成途径、氨基酸代谢、糖醇生物合成途径和负责二次代谢产物生产途径的代谢物水平变化有关。
来自糖酵解途径的葡萄糖和葡萄糖-6-磷酸进入ppp，其对于以nadph的形式产生的细胞还原能力至关重要的。nadph是还原氧化物质如谷胱甘肽(gssg)所必需的，且可以保护细胞免受ros的影响。ppp产物的提供是芳香族氨基酸和核酸合成的前体所必需的。ppp被分为非氧化和氧化分支。前者将葡萄糖-6-磷酸转化成核酮糖-5p和nadph。后者为核酸和芳香族氨基酸合成提供核糖-5p。本实施例显示，当多头绒泡菌暴露于ntio2时，核酮糖-5p和核糖-5p的水平显着增加，表明ppp可能作为抗氧化防御机制的一部分抵抗ntio2的应激。上述结果表明ppp和ntio2暴露之间存在密切关系。此外，在低剂量和高剂量ntio2处理组中，与ppp相关的几种代谢产物的含量(低黄嘌呤、肌苷、鸟嘌呤、腺嘌呤和黄嘌呤)的含量明显增加。在同一组中也检测到胞嘧啶和胞苷含量也类似地增加。这些结果表明，在暴露于ntio2下的多头绒泡菌有潜在的核苷酸需求。对于人体皮肤细胞，葡萄糖分解代谢作为对uv和h2o2诱导的氧化应激的第一反应阻碍氧化戊糖磷酸途径(ppp)和核苷酸合成。
ppp也与芳香族氨基酸(包括苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸)的生物合成有关。芳香族氨基酸不仅是蛋白质的重要成分，而且也是生产某些酚类次级代谢产物的前体。在本实施例中，在ntio2暴露下一些芳香族氨基酸和次级代谢产物(酪氨酸、色氨酸、甲状腺素、褪黑激素和5-羟色氨酸)的水平显著升高(图4所示)。尤其是在低剂量和高剂量ntio2处理的组中，芒柄花黄素(一种类黄酮)的水平分别增加了3.12e02和5.15e04倍。黄酮类化合物被认为是比维生素c和e还有类胡萝卜素更有效的抗氧化剂，而类黄酮衍生物则通过其ho·清除活动降低了紫外辐射下tio2在水溶液中的氧化作用。黄酮类化合物也被证明可以通过它们的-oh官能团来与ntio2结合。因此，对于暴露于tio2的多头绒泡菌来说，芒柄花黄素被认为可能是类黄酮生物标志物或解毒剂。另外，根据tsp测定结果(图5c)，多头绒泡菌中总可溶性酚类化合物的含量增加。酚类化合物对细胞的抗氧化作用有显著的促进作用，其结构与其抗氧化性能直接相关。酚类化合物，具有芳香环，通过形成共振稳定的苯氧基自由基来抑制自由基的产生。酚类化合物也被证明可以通过其分子结构中的羟基清除ros来保护机体免受氧化应激的影响。基于以上阐述，酚类化合物的积累是多头绒泡菌对抗ntio2诱导氧化应激的一种机制，而酚类化合物含量的增加可能是多头绒泡菌抵抗ntio2暴露的重要防御策略。
在真菌中葡萄糖-6-磷酸从糖酵解途径转化为海藻糖-6-磷酸和海藻糖。海藻糖，一种非还原性二糖，存在于从细菌和真菌到无脊椎动物的各种生物体中，并且可作为渗透剂或蛋白质/膜保护剂。海藻糖水平的提高使得植物能耐受氧化、冷、热、渗透和盐胁迫。海藻糖的积累被认为是对抗各种应激源的一种常见的细胞防御策略。正如代谢组学结果显示，暴露于ntio2的多头绒泡菌中海藻糖-6-磷酸和海藻糖的含量增加，表明涉及渗透液保护剂的防御策略也被激活。这种假说通过其他类型渗透液的生物合成例如脯氨酸和多胺(亚精胺和腐胺)进一步证实(图4所示)。在植物对非生物胁迫的反应中，脯氨酸被广泛研究。除了其作为渗透剂的功能之外，脯氨酸可能通过其他机制参与重金属耐受性，如氧化还原调节、金属螯合和自由基清除。在本实施例中，亚精胺和腐胺的水平分别提高了8倍和3倍(表1所示)。多胺在所有生物体中都是普遍存在的，它们的含量随着重金属的暴露而改变。多胺积聚稳定且能保护膜系统免受氧化还原活性金属的影响，促进金属离子分隔，并抑制脂质过氧化。在先前的研究中亚精胺已被证明可与ti反应，并促进ntio2作为生物催化剂的沉淀。据报道，多胺池中精胺和腐胺的比例增加，是一些非生物应力如渗透压、紫外线、盐和干旱胁迫的生物标志物。根据结果显示，本实施例推测ntio2可能影响细胞内的渗透压，多头绒泡菌产生的一些渗透物质在保护其免受ntio2应激作用的过程中起重要作用。
除了上述氨基酸和氨基酸衍生的代谢物(如酪氨酸，色氨酸，脯氨酸，亚精胺和腐胺)外，氨基酸衍生的代谢物(烟碱胺)的含量也显著上升。值得注意的是，该代谢物的水平增加了至少五个数量级。烟碱胺的功能已在植物中得到广泛的研究，许多研究表明烟碱胺涉及重金属解毒作用。每个烟碱胺分子内的三个羧酸基都能够实现与过渡金属的高效结合。在本实施例中，烟碱胺的含量取决于ntio2的剂量，表明烟碱胺在暴露于ntio2的多头绒泡菌中在解毒机制方面起作用，可作为ntio2暴露的潜在生物标志物。
谷胱甘肽(gsh)，一种γ-谷氨酰-l-胱氨酰甘氨酸三肽，也许是通过非酶防御系统维持细胞氧化还原状态最著名的例子。gsh是一种自由基清除剂，因为巯基基团能与氧化剂发生反应，产生还原谷胱甘肽(gssg)，gsh是细胞中最丰富的氧化还原分子。在本实施例中，9和15mg/mlntio2处理组中的gsh水平分别上升了1.67e0.5倍和4.67e0.6倍。除了gsh的水平上升以外，gsh的组成部分(半胱氨酸和谷氨酸)的水平也显著提升(图4所示)，这与gsh水平的提升一致。在已有的研究中有报道百里醌和燕麦生物碱在对暴露于ntio2的sd大鼠起保护作用时，gsh的水平会上升。此外，抗氧化相关基因尤其是参与调节gsh的基因的表达下调可能导致ntio2诱导的细胞损伤。gsh水平被认为是氧化应激的生物标志物，是非酶抗氧化系统的重要组成部分，甚至是各种非生物胁迫诱导的氧化损伤的解毒剂。在本实施例中，尽管在用低剂量和高剂量ntio2处理的组中，gsh水平都显著增加，但仅在高剂量ntio2处理组中，生物体发生了dna的氧化损伤(图5b)。因此，当多头绒泡菌暴露于高剂量ntio2中时，即使在黑暗条件下，ntio2也会引发多头绒泡菌的dna氧化损伤，从而，使多头绒泡菌引起dna氧化损伤的ntio2临界值在9–15mg/ml之间。
当暴露于阳光或紫外线辐射下，ntio2通过光催化产生丰富的ros，例如o2·-和ho2·，这会造成许多生物体的氧化损伤。但是引起氧化损伤的ros的来源尚不清楚。在本实施例中，所有剂量的ntio2诱导都出现了短暂的细胞内ros失衡，这可能与黑暗条件下多头绒泡菌受到的氧化损伤有关(图5a)。值得注意的是，在黑暗条件下，多头绒泡菌中的ros水平没有与ntio2(特别是18mg/ml)显示出剂量反应关系。根据结果显示，在多头绒泡菌中激活抗氧化机制或诱导氧化损伤的ros主要是内源性的。已有的研究结果也支持了这一观点，在黑暗条件下ntio2诱导hacat细胞和细菌的细胞发生膜脂质过氧化反应。
在黑暗条件下，ntio2通过造成内源性ros的不平衡，诱导多头绒泡菌发生氧化应激，甚至氧化损伤。多头绒泡菌中代谢物相关防御系统被激活以抵抗ntio2应激。基于gc/ms的代谢组学研究为我们提供了一个独特的机会来深入研究ntio2诱导的完整的代谢变化，其结果表明该技术适用于这种类型的研究。同时，本实施例也提出了将这种敏感且体积大的多头绒泡菌应用于单细胞毒性实验的可能。
本发明先后进行过多次试验，现举一部分试验结果作为参考对发明进行进一步详细描述，下面结合具体实施例进行详细说明。
化学试剂
从杭州万景股份有限公司(中国杭州)购买了含有100mg/mlntio2悬浮液的锐钛矿ntio2vk-ta33(初级直径：30nm)储液。用于代谢组学分析的试剂来自于sigma-aldrichchemical(st.louis,mo)。除另有说明外，在实验中使用的所有化学试剂和试剂都是分析级的。
ntio2的特性
透射电子显微镜(philips，cm12，荷兰)被用于测量ntio2颗粒的尺寸。在深圳大学材料科学与工程学院进行了平均流体动力粒子半径分析。使用激光粒度分析仪(brookhaven,usa)从90度散射角通过动态光散射测量了msd培养基中1mlntio2的粒径。在26℃下进行3分钟平衡步骤后，对样品进行5次测量。每个测量的读数和持续时间设置为默认参数。收集强度分布数据进行分析，并利用brookhaven的专有软件计算测量的平均值。
多头绒泡菌的培养和ntio2的暴露
所有实验都是使用由eggehardholler教授(德国雷根斯堡大学生物物理研究所)提供的多头绒泡菌m3cvii(atcc204388)进行的，该菌可在msd液体培养基中以150r/min或msd固体培养基上不搅拌培养。培养温度维持在26℃左右,msd培养基配方已在以前的研究中有所报道(danielandbaldwin,1964)。在暴露于ntio2之前，多头绒泡菌先在msd液体培养基中培养进行活化。在多头绒泡菌生长到对数生长期末端时，收集大约0.1g多头绒泡菌菌体并接种于msd固体培养基上。等多头绒泡菌在固体培养基上生长5天以后，将一大片的菌体切成等重(0.1g)的几份并分别接种到含有0、9、15、18mg/mlntio2的固体培养基上。对每一组浓度的样品都进行三组生物学重复，并在各组样品暴露于ntio2三天后对多头绒泡菌的重量进行测量。称重后，将刚称重的多头绒泡菌样品用于随后的测定，如代谢物提取，生化分析等。
代谢物提取和分析
将每一组多头绒泡菌样品在玻璃容器中溶于2ml甲醇/水溶液(体积比4:1)并分散到0.4ml氯仿溶液里。将样品放入超声破碎器中并调节功率到500w，超声破碎6min使所用样品均质化。然后从每组样品中取0.8ml混合物置于冰浴上利用超声波法提取20min。各组样品在12000r/min，-4℃的条件下离心10min后，将各组样品的上清液(0.5ml)转移到新的ep管中然后利用冷冻浓缩离心干燥机使其完全干燥。向干燥的样品中加入80μlbstfa(with1％tmcs)和20μl正己烷，然后剧烈地涡旋振荡1min以及在70℃的条件下衍生60min。衍生好的样品在室温下孵育30min，然后进行gc-ms分析。
gc-ms的条件和数据采集
用安捷伦7890b气相色谱系统与agilent5977amsd系统(agilent，ca，usa)结合分析1μl各组衍生的样品。gc柱是db-5ms熔融石英毛细管柱(30m×250μm×0.25μm，j&wscientific，folsom，ca，usa)，氦气以恒定流速1ml/min。注射器温度设置为260℃。gc柱的初始温度设定为90℃，以10℃/min的速度升至180℃，再以5℃/min的速度升高至240℃，然后以25℃/min的速度升至290℃。最后，将温度保持在290℃11分钟。ms四极杆温度和离子源温度分别设定为150℃和230℃。使用全扫描模式(m/z50-450)的碰撞能量(70ev)获取质量数据，溶剂延迟时间设定为5分钟。gc-ms的操作和数据采集根据以前的研究进行。
代谢组学数据处理
使用chromatof软件(v4.34，leco，stjoseph，mi)分析所有gc/ms数据，使用fiehn数据库对代谢物进行定性分析。简单来说，在与统计比较组校对后，生成的文件包含样本信息、峰值名称、保留时间、m/z和峰值强度。将数据归一化为excel2007(microsoft，usa)log2转化的每个样品的总峰面积，然后导入simca(版本14.0，umetrics，
代谢途径分析
metaboanalyst2.0以kegg为后端知识通过将代谢途径可视化来分析代谢通路及其变动情况。
生化分析
用已有研究报道的方法(singletonetal.,1999)测定多头绒泡菌中总的可溶性酚(tsp)浓度。根据先前研究所述(lawrenceetal.,2016)，使用具有485nm和535nm发射滤光片的h2dcfda(beyotimebiotechnology，china)和激光共聚焦显微镜(olympus，japan)测量细胞内ros水平。利用基因组提取试剂盒(transgen,beijing,china)提取多头绒泡菌的dna然后按照已有的研究方法测定8-ohdg的水平。根据已有研究和试剂盒说明书利用8-ohdgelisa试剂盒和总蛋白分析试剂盒测定8-ohdg的水平。
统计分析
以t检验5％的显著性水平分析了从代谢分析中获得的数据。对于生化测定，进行单因素方差分析和hocbonferroni校正，p<0.05被认为是显著的。
实施例1
ntio2对多头绒泡菌生长的影响
在缺少光催化的情况下，ntio2被认为是一种生物相容材料。在本实施例中，多头绒泡菌暴露于浓度逐渐增加的含ntio2(0mg/ml、5mg/ml、9mg/ml、15mg/ml和18mg/ml)的固体培养基中三天，对各组多头绒泡菌的重量进行称量；结果如图1所示：与对照组相比，多头绒泡菌在5mg/ml和9mg/ml浓度中的生长速度略有增加(约10％和20％)；与对照组相比，较高浓度的ntio2(15mg/ml)显著抑制生长(约50％)，18mg/ml的ntio2几乎完全抑制多头绒泡菌的生长。
实施例2
ntio2诱导多头绒泡菌的代谢紊乱
利用gc/ms进行半定量分析多头绒泡菌样品中代谢产物的水平，并采用多变量统计分析包括无监督主成分分析(pca)和受监督正交偏最小二乘判别分析(opls-da)评估解析后的峰。pca评分图(图2a)和opls-da评分图(图2c)显示了对照组和9mg/mlntio2处理组的显著差异。opls-da模型各部分对差异变化的解释分别为x矩阵(代谢物数据)61％，y矩阵(ntio2处理组：1，对照：0)99.7％，由于对opls-day模型矩阵预测精度的累积q2为91.6％，表明多变量分析的组间差异非常显著。类似地，pca评分图(图2b)和opls-da评分图(图2d)显示了对照组和15mg/mlntio2处理组的显著差异。opls-da模型各部分对差异变化的解释分别为x矩阵62.4％，y矩阵99.8％，由于对opls-day模型矩阵预测精度的累积q2为94.6％，表明多变量分析的组间差异非常显著。
基于vip值>1且p<0.05，使用opls-da方法和t检验筛选发生改变的代谢物。分别从9和15mg/mlntio2处理组中成功地筛选了42和60种代谢物，表1为暴露于ntio2后多头绒泡菌中作为生物标志物的潜在的候选代谢物；这些发生改变的代谢物包括糖(包括磷酸三辛酯)、糖醇、有机酸、氨基酸、多胺、类黄酮等，被认为是ntio2毒性暴露的潜在生物标志物。
表1中：使用从每个组获得的平均值来评估折叠变化(fc)值：小于1的折变值表示浓度的相对下降，而大于1的折变值表示浓度相对于对照组相对增加；fca为9mg/mlntio2处理组；fcb为15mg/mlntio2处理组。在9mg/mlntio2处理组和15mg/mlntio2处理组中分别有4种和8种代谢物的水平显著升高了100倍以上。当增加ntio2浓度时，22种受干扰的糖代谢物中有8种呈现增加趋势，4种呈下降趋势。当增加ntio2浓度时，7种受干扰的核苷酸代谢物中2种呈现增加趋势，3种呈下降趋势。当增加ntio2浓度时，22种受干扰的氨基酸代谢物中有13种呈现增加趋势，4种呈下降趋势。除了主要的代谢产物外，次级代谢产物如黄酮类化合物也受到了显著地干扰。在9mg/ml和15mg/mlntio2处理组中一种黄酮类化合物芒柄花黄素分别提高了3.12e02倍和5.15e04倍。在所有已鉴定的代谢物中，谷胱甘肽在15mg/mlntio2处理组中与对照相比显示出了最大的ntio2诱导增加量(4.67e06倍)。在9mg/mlntio2处理组中，与对照相比谷胱甘肽的水平也提高了1.67e05倍。
表1
发生变化的代谢物通过kegg(http://www.genome.jp/kegg/pathway.html)和mbrole(http://csbg.cnb.csic.es/mbrole/)通路分析，识别出多头绒泡菌暴露于ntio2后被扰乱的代谢途径。在分析富集通路和拓扑路径后，构建了一个统计图，如图3所示。较高的log(p值)值表明在黑暗条件下被ntio2扰乱相关代谢途径更多；1.3<-log(p值)值<2和-log(p值)值≥2分别被认为具有统计学显着性和高度显着性。有12条代谢通路在9和15mg/mlntio2处理组中显著富集，包括精氨酸和脯氨酸代谢、嘌呤代谢、谷胱甘肽代谢、柠檬酸循环、乙醛酸和二羧酸代谢、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、淀粉和蔗糖代谢、β-丙氨酸代谢、嘧啶代谢、烟酸和烟酰胺代谢、酪氨酸代谢和苯丙氨酸代谢。氧化磷酸化途径也被15mg/mlntio2处理显著扰乱，但没有被9mg/mlntio2处理显着扰乱。在常见的代谢途径中，精氨酸和脯氨酸代谢，嘌呤代谢和谷胱甘肽代谢被9和15mg/mlntio2处理最显著地扰乱(log(p值)值≥2)。在图4中，主要受干扰的代谢物被绘制为简化的代谢网络图，反映了黑暗条件下，ntio2对多头绒泡菌代谢产物的影响。
实施例3
多头绒泡菌被ntio2诱导的生物化学变化
高的ros水平会诱导生物大分子的氧化损伤，因此ros水平可作为氧化应激的指标。可使用h2dcfda探针检测ros水平，以确定ntio2是否可以在黑暗条件下使多头绒泡菌的ros水平升高。如图5a所示：对照组经过短暂的接触(100分钟)其ros水平波动在一个相对狭窄的范围内(初始值的0.8-1.2倍)而暴露于ntio2(9mg/ml和15mg/ml)的多头绒泡菌，其ros水平在接触后迅速增加,并迅速达到峰值(分别为2.2倍和3倍)。尽管ros水平在达到峰值后有所降低，但仍然高于对照组的水平，表明ntio2在黑暗条件下会引起多头绒泡菌ros水平的失衡。
8-ohdg是dna氧化损伤的主要形式之一，因此8-ohdg的积累被广泛用作dna损伤过程的生物标志物。检测全基因组dna中8-ohdg的水平评估ntio2诱导多头绒泡菌氧化损伤的程度，如图5b所示，与对照组相比，15mg/mlntio2处理组的多头绒泡菌中8-ohdg水平增加了1.6倍，而8-ohdg水平在对照组和9mg/mlntio2处理组之间没有明显差异。
酚类化合物可显著增强细胞抗氧化能力。它们的结构与其抗氧化性能直接相关。酚类化合物由含有一个或多个羟基的芳香环组成，它们通过形成共振稳定的苯氧基自由基来抑制自由基的产生。对9和15mg/mlntio2处理组的多头绒泡菌的总可溶性酚含量进行了评估，结果表明总可溶性酚含量分别增加了1.5和2.2倍(图5c)。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。