相关申请的交叉引用
本申请要求于2014年9月24日提交的美国临时申请no.62/054,724的权益，所述临时申请以引用的方式全文纳入本文。
本公开内容涉及在肿瘤细胞中选择性地经历溶解性复制的重组腺病毒，其在e1a、e4orf1和/或e4orf6/7中包含一种或多种修饰。所述重组腺病毒任选地在纤维、六邻体(hexon)或衣壳蛋白中具有一种或多种修饰以使得可全身递送且在肿瘤细胞中吸收。
政府支持认可
本发明在由美国国立卫生研究院(thenationalinstitutesofhealth)颁予的授权号为5t32gm007240-35的政府支持下完成。政府对本发明享有某些权利。
背景技术：
癌症是一种复杂的衰竭性疾病，每年造成五十多万人死亡。深切需要针对癌症的更有效、更具选择性且更安全的治疗。对于这种普遍的、威胁生命的疾病的现有治疗，如化疗和手术，极少消除所有恶性细胞，而且常展示出可能超出治疗益处的有害副作用。
有潜力解决目前癌症治疗的多种不足的一种方法是溶瘤腺病毒疗法(pesonen等人,molecularpharmaceutics8(1):12-28,2010)。腺病毒(ad)是一种自我复制型生物机构。它由包装在蛋白质外壳内的线性双链36kbdna基因组组成。腺病毒侵入并劫持细胞复制机构去复制，经组装后，诱导溶解性细胞死亡以扩散到周围细胞。在癌症中通过突变来靶向这些极为相同的细胞控制。可采用这种认知以产生如导弹般发挥作用的合成性病毒，尤其在肿瘤细胞中感染和复制，以及溶解细胞从而释放可搜寻出且破坏远端转移性肿瘤的数千个病毒后代，同时克服可能的抗性。因此，溶瘤病毒设计的目标在于产生在癌细胞中特异性复制，而使正常细胞不受损害的病毒。然而，重要的挑战在于设计出可以选择性地在癌细胞中复制的病毒。因此，仍需要选择性地在癌细胞中复制的其他病毒。
发明简述
公开了选择性地在e2f失调的肿瘤细胞中复制的重组腺病毒。所述重组腺病毒具有编码经修饰的e1a蛋白、经修饰或缺失的e4orf1蛋白、经修饰或缺失的e4orf6/7蛋白或其任意组合的基因组，以使所述重组腺病毒在正常细胞中与在肿瘤细胞中相比展现复制缺陷。重组腺病毒的基因组任选地进一步编码将重组腺病毒靶向特定的细胞类型、使病毒自肝脏去靶向(detarget)、抑制肝脏中的病毒复制和/或逃避已有的中和抗体的其他修饰。
本文提供一种重组腺病毒，其中所述重组腺病毒的基因组编码经修饰的e1a蛋白、经修饰或缺失的e4orf1蛋白、经修饰或缺失的e4orf6/7蛋白或其任意组合，且其中所述重组腺病毒在正常细胞中与在肿瘤细胞中相比展现复制缺陷。
在一些实施方案中，所述重组腺病毒基因组进一步编码用于诱导型再靶向的修饰。例如，所述基因组任选地编码与fk506结合蛋白(fkbp)融合的靶向配体和与野生型fkbp-雷帕霉素结合(fkbp-rapamycinbinding，frb)蛋白或包含t2098l置换的突变体frb蛋白融合的腺病毒纤维蛋白。
在一些实施方案中，所述重组腺病毒基因组进一步编码使腺病毒自肝脏去靶向的修饰。在一些实例中，所述基因组编码六邻体蛋白的修饰和/或包括一个或多个肝特异性微rna的结合位点。
在一些实施方案中，所述重组腺病毒基因组编码嵌合纤维蛋白以将病毒重新导向至替代的细胞受体。
在一些实施方案中，所述重组腺病毒基因组编码衣壳交换腺病毒(capsid-swappedadenovirus)以逃避(evade)已有的中和抗体。在一些实例中，基因组的e1、e3和e4区域源自第一腺病毒血清型且基因组的e2b、l1、l2、l3、e2a和l4区域源自第二腺病毒血清型。
进一步提供重组报告腺病毒基因表达载体，其中所述重组腺病毒的基因组包含e1的缺失且编码ef1α启动子驱动的gfp-荧光素酶融合蛋白。在一些实施方案中，所述腺病毒表达载体进一步包括在3′-utr中的肝特异性微rna结合位点。
本文还提供包含所公开的重组腺病毒的组合物。另外，提供包含重组腺病毒基因组序列的重组核酸分子和载体。
本公开内容进一步提供通过施用本文公开的重组腺病毒(或其组合物)来抑制肿瘤细胞活力、抑制肿瘤发展、减小肿瘤体积和治疗患有癌症的对象的方法。
由参照附图进行的以下详细描述，本公开内容的上述和其他目标和特征将会变得更加清楚。
附图简述
图1a-1b是细胞裂解物的免疫印迹，其示出了来自重组腺病毒感染细胞的腺病毒e1a的表达。细胞受空白感染或受adsyn-co102(野生型)、adsyn-co181(e1aδlxcxe/δe4orf6/7)、adsyn-co189(e1aδlxcxe)或onyx-838(e1aδcr2)感染。对于图1a，以moi10感染静止(quiescent)人类原代小气道上皮细胞(saec)且针对e1a表达分析裂解物。在受adsyn-co102感染的细胞中，e1a水平在感染后期下降。类似地，在受adsyn-co189或onyx-838感染的细胞中，e1a水平在感染后期下降；然而，在较早的时间点，e1a表达大于adsyn-co102-感染细胞中的e1a表达。相反，受adsyn-co181感染的细胞在整个感染期间展现出更强且持续的e1a表达，这表示无法在整个腺病毒生命周期中进展。对于图1b，以moi30感染铺满的肺腺癌细胞(a549)且针对e1a表达分析裂解物。所有感染都导致e1a水平在感染后期下降，这表示典型的腺病毒生命周期发展。
图2a-2b是细胞裂解物的免疫印迹，其示出了受感染的原代和肿瘤细胞中的细胞周期蛋白和腺病毒晚期蛋白的表达。细胞受空白感染或受adsyn-co102(野生型)、adsyn-co181(e1aδlxcxe/δe4orf6/7)、adsyn-co189(e1aδlxcxe)、adsyn-co210(δe4orf6/7)或onyx-838(e1aδcr2)感染。对于图2a，以moi10感染saec。与野生型病毒和仅具有e1a突变的病毒相比，adsyn-co181无法活化e2f依赖性细胞周期靶蛋白、s期细胞周期蛋白、细胞周期蛋白a和细胞周期蛋白b。此外，具有e4orf6/7突变的adsyn-co181和adsyn-co210在晚期蛋白表达和复制方面存在缺陷。相对adsyn-co210而言，这两种缺陷的明显程度较小。对于图2b，以moi30感染a549细胞。与受感染的原代细胞相比，晚期结构蛋白的表达无明显缺陷，且细胞周期蛋白a和细胞周期蛋白b仍存在于所有受感染的a549样本中。
图3a-3b是分别定量受感染的saec和a549细胞中的细胞dna的facs直方图。细胞受空白感染或受adsyn-co102(野生型)、adsyn-co181(e1aδlxcxe/δe4orf6/7)、adsyn-co189(e1aδlxcxe)或adsyn-co210(δe4orf6/7)感染，且在感染后48小时收集。未受感染细胞的dna含量显示在背景谱(profile)中。y轴是细胞的相对丰度，且x轴是细胞中来自碘化丙啶(pi)的荧光，其与dna的量成正比。对于图3a而言，以moi10感染静止saec。adsyn-co181感染相对于adsyn-co102展示在saec中强烈的dna复制缺陷，这与病毒复制减少相关。在此时间点，受adsyn-co210感染的saec中也有明显的中度缺陷。对于图3b，以moi30感染a549细胞。在这些细胞中，通过任何突变体病毒感染均无明显的dna复制缺陷。
图4a-4b是分别示出了来自受感染的saec和a549细胞的腺病毒爆发的图表。细胞受空白感染或受adsyn-co102(野生型)、adsyn-co181(e1aδlxcxe/δe4orf6/7)、adsyn-co189(e1aδlxcxe)、adsyn-co210(δe4orf6/7)或onyx-838(e1aδcr2)感染，且在感染后48和72小时收集培养基。通过elisa对培养基中的感染性病毒颗粒进行定量。对于图4a，以moi10感染静止saec。adsyn-co181和adsyn-co210两种感染都显示出在saec中相对于adsyn-co102强烈的复制缺陷。对于图4b，以moi30感染a549细胞。除了adsyn-co210以外，在这些细胞中均未观察到病毒复制缺陷。
图5a-5b是分别示出了受感染的saec和a549细胞在感染7天后的细胞活力的图表。细胞受空白感染或受adsyn-co102(野生型)、adsyn-co181(e1aδlxcxe/δe4orf6/7)、adsyn-co189(e1aδlxcxe)、adsyn-co210(δe4orf6/7)或onyx-838(e1aδcr2)的连续稀释液感染，且通过wst-1测定对细胞代谢活性进行定量。如图5a中所示，与adsyn-co102相比，adsyn-co181展示出在saec中降低的细胞杀死能力。如图5b中所示，在测试的突变体病毒中，细胞杀死相对于野生型病毒而言并无缺陷。
图6a是细胞裂解物的免疫印迹。使以moi10感染的正常人类星形胶质细胞(nha)经历免疫印迹法来检测腺病毒晚期结构蛋白表达和细胞的细胞周期蛋白诱导。adsyn-co181不诱导细胞周期蛋白a，且相对于adsyn-co102展示出延迟且减少的晚期病毒蛋白表达，这表示存在复制缺陷。
图6b-6c是示出了adsyn-co181展示nha中感染减弱的图表。对于图6b，通过病毒组感染nha，且在感染后48和72小时对培养基中感染性颗粒的数量进行定量。adsyn-co181和adsyn-co189相对于adsyn-co102展示在nha中的复制缺陷。对于图6c，在感染后48小时通过pifacs对moi10感染的nha中的dna复制进行定量。未受感染细胞的dna含量显示在直方图的背景谱中。y轴是细胞的相对丰度，且x轴是细胞中来自pi的荧光，其与核酸的量成比例。adsyn-co181相对于adsyn-co102展示dna复制的减弱的诱导，这与病毒复制减少相关。
图7a是来自受感染成胶质细胞瘤u87细胞的细胞裂解物的免疫印迹。使以moi20感染的u87细胞经历免疫印迹法来检测腺病毒晚期结构蛋白表达和细胞周期蛋白诱导。
图7b-7c是示出了重组腺病毒在成胶质细胞瘤u87细胞中无复制缺陷的图表。对于图7b，通过病毒组感染u87细胞，且在感染后48和72小时对培养基中感染性颗粒的数量进行定量。对于图7c，在感染后48小时通过pifacs对以moi20感染的u87细胞中的dna复制进行定量。未受感染细胞的dna含量显示在直方图的背景谱中。y轴是细胞的相对丰度，且x轴是细胞中来自pi的荧光，其与核酸的量成比例。
图8a是来自受感染成胶质细胞瘤u118细胞的细胞裂解物的免疫印迹。使以moi20感染的u118细胞经历免疫印迹法来检测腺病毒晚期结构蛋白表达和细胞的细胞周期蛋白诱导。
图8b-8c是示出了在成胶质细胞瘤u118细胞中无复制缺陷的重组腺病毒的图表。对于图8b，通过病毒组感染u118细胞，且在感染后48和72小时对培养基中感染性颗粒的数量进行定量。对于图8c，在感染后48小时通过pifacs对以moi20感染的u118细胞中的dna复制进行定量。未受感染细胞的dna含量显示在直方图的背景谱中。y轴是细胞的相对丰度，且x轴是细胞中来自pi的荧光，其与核酸的量成比例。
图9a是来自受感染人类成纤维细胞(imr90细胞)的细胞裂解物的免疫印迹。使以moi10感染的成纤维细胞经历免疫印迹法来检测晚期结构蛋白表达。adsyn-co181相对于adsyn-co102展示出延迟且减少的晚期病毒蛋白表达，这表示存在复制缺陷。
图9b-9c是示出了adsyn-co181在imr90细胞中具有中度复制缺陷的图表。对于图9b，通过病毒组感染成纤维细胞，且在感染后48和72小时对培养基中感染性颗粒的数量进行定量。在这些时间点由此分析可知，经修饰腺病毒的复制能力无明显差异。对于图9c，在感染后48小时通过pifacs对以moi20感染的成纤维细胞中的dna复制进行定量。未受感染细胞的dna含量显示在直方图的背景谱中。y轴是细胞的相对丰度，且x轴是细胞中来自pi的荧光，其与核酸的量成比例。adsyn-co181相对于adsyn-co102展示dna复制的减弱的诱导，这与病毒复制减少相关。
图10是示出了受感染的原代nha细胞在感染10天后的细胞活力的图表。细胞受野生型或突变体病毒的连续稀释液感染。通过wst-1测定对代谢活性进行定量。以每个细胞三个和十个感染性颗粒，明显分为两组病毒，在图表中标记为“较少杀死”和“较多杀死”。诱导较少细胞杀死的病毒具备具有rb-结合突变的e1a和e4orf6/7缺失两者。诱导较多杀死的病毒具有野生型e1或野生型e4。
图11是示出了受感染的静止saec-htert细胞在感染9天后的细胞活力的图表。细胞受野生型或突变体病毒的连续稀释液感染。通过wst-1测定对代谢活性进行定量。以每个细胞三个和十个感染性颗粒，明显分为两组病毒，在图表中标记为“较少杀死”和“较多杀死”。诱导较少细胞杀死的病毒具备具有rb-结合突变的e1a和e4orf6/7缺失两者。诱导较多细胞杀死的病毒具有野生型e1或野生型e4。
图12是示出了受感染的增殖中的saec-htert细胞在感染9天后的细胞活力的图表。细胞受野生型或突变体病毒的连续稀释液感染。通过wst-1测定对代谢活性进行定量。以每个细胞三个和十个感染性颗粒，明显分为两组病毒，在图表中标记为“较少杀死”和“较多杀死”。诱导较少细胞杀死的病毒具备具有rb-结合突变的e1a和e4orf6/7缺失。诱导较多细胞杀死的病毒具有野生型e1或野生型e4。
图13是示出了受感染的a549细胞在感染7天后的细胞活力的图表。细胞受野生型或经修饰病毒的连续稀释液感染。通过wst-1测定对代谢活性进行定量。
图14是示出了受感染的人类乳腺癌细胞(mdamb231)在感染7天后的细胞活力的图表。细胞受野生型或经修饰病毒的连续稀释液感染。通过wst-1测定对代谢活性进行定量。
图15是示出了受感染的成胶质细胞瘤细胞(u87)在感染7天后的细胞活力的图表。细胞受野生型或经修饰病毒的连续稀释液感染。通过wst-1测定对代谢活性进行定量。
图16是示出了对于图10-15中示出的受感染的原代nha、saec-htert(静止)、saec-htert(增殖)、a549、mdamb231和u87细胞的定量细胞活力分析的表格。
图17是示出了受感染的u2os细胞(其具有功能性p53和rb)和saos2细胞(其具有非功能性p53和rb)的定量细胞活力测定的表格。细胞受野生型或经修饰的病毒的连续稀释液感染。通过wst-1测定对代谢活性进行定量。
图18a是示出了frb结构域与雷帕霉素和fkbp12的结合界面的图表。突变frb结构域(frb*；mtor残基t2098l)经诱导与雷帕霉素或雷帕霉素同系物ap21967形成frb/fkbp12异二聚体。图18b是示出了具有frb-纤维的egfr靶向病毒(adsyn-co205；seqidno:88)在存在雷帕霉素但无ap21967的情形下具有改善的mdamb453乳腺癌细胞转导的图表。具有frb*-纤维的egfr靶向病毒(adsyn-co220；seqidno:98)在雷帕霉素或ap21967存在下具有改善的mdamb453细胞转导。图18c是示出了mtor抑制剂雷帕霉素阻断其靶p70s6k的磷酸化的活性的免疫印迹。雷帕霉素同系物ap21967在靶向浓度下不抑制mtor。图18d是示出了受感染的hs578t转移性乳腺癌细胞在感染9天后的细胞活力的图表。细胞受adsyn-co312的连续稀释液感染。在感染后24、48、72和96小时，添加新鲜雷帕霉素或ap21967至50nm。通过wst-1测定定量代谢活性，且由匹配的药物处理标准化为未感染的细胞。adsyn-co312具备e1aδlxcxe、δe4orf6/7、δe3-ridα/β、δe3-14.7k的溶瘤突变，且表达雷帕霉素-或ap21967-依赖性egfr-靶向基因egfrvhh-fkbp和frb*-纤维。与无靶向相比，接受雷帕霉素或ap21967的egfr靶向溶瘤病毒感染的细胞的杀死增强。图18e是示出了受感染的hs578t转移性乳腺癌细胞在感染9天后的细胞活力的图表。细胞受adsyn-co313的连续稀释液感染。在感染后24、48、72和96小时，添加新鲜雷帕霉素至50nm。通过wst-1测定定量代谢活性，且由匹配的药物处理标准化为未感染的细胞。adsyn-co313具备e1aδlxcxe、δe4orf6/7、δe3-ridα/β、δe3-14.7k的溶瘤突变，且表达雷帕霉素依赖性egfr-靶向基因egfrvhh-fkbp和frb-纤维。与无靶向相比，接受雷帕霉素的egfr靶向溶瘤病毒感染的细胞的杀死增强。
图19是示出了经处理的小鼠体内的hs578t皮下异种移植物的平均肿瘤体积的图表。具有以建立的肿瘤的小鼠接受瘤内注射adsyn-co313，接着随后接受定期腹膜内注射8mg/kg雷帕霉素(n＝5)或媒介物对照物(n＝4)，或其接受瘤内媒介物对照物，接着随后接受定期腹膜内注射8mg/kg雷帕霉素(n＝5)或媒介物对照物(n＝4)。相同组中自初始感染后19天开始，每4天重复感染，重复三次。adsyn-co313携带e1aδlxcxe、δe4orf6/7、δe3-ridα/β、δe3-14.7k的溶瘤突变，且表达雷帕霉素依赖性egfr-靶向基因egfrvhh-fkbp和frb-纤维。接受egfr靶向溶瘤病毒与雷帕霉素的小鼠体内的肿瘤展示出最佳的反应。
图20是示出了受感染的hs578t转移性乳腺癌细胞在感染9天后的细胞活力的图表。细胞受adsyn-co335的连续稀释液感染。在感染后24、48、72和96小时，添加新鲜雷帕霉素或ap21967至50nm。通过wst-1测定定量代谢活性，且由匹配的药物处理标准化为未感染的细胞。adsyn-co335携带e1aδlxcxe、δe4orf6/7、δe3-ridα/β、δe3-14.7k的溶瘤突变；肝去靶向六邻体突变e451q；且表达雷帕霉素-或ap21967-依赖性egfr-靶向基因egfrvhh-fkbp和frb*-纤维。与无靶向相比，接受雷帕霉素或ap21967的egfr靶向溶瘤病毒感染的细胞的杀死增强。
图21a-21b是示出了经处理小鼠体内的hs578t皮下异种移植物的平均体积的图表。图21c-21d是示出了经处理小鼠体内的hs578t皮下异种移植物的体积变化倍数的图表。具有已建立的肿瘤的小鼠每4天接受三次瘤内注射adsyn-co335，接着随后在之后每隔一天接受腹膜内注射2或8mg/kg雷帕霉素(分别为n＝8和n＝8)或在之后每隔一天接受媒介物对照物(n＝6)；或其每4天接受三次瘤内注射adsyn-co442，接着随后在之后每隔一天接受腹膜内注射2或8mg/kg雷帕霉素(分别为n＝6和n＝6)；或其每4天接受三次瘤内注射媒介物对照物，接着随后在之后每隔一天接受腹膜内注射2或8mg/kg雷帕霉素(分别为n＝6和n＝6)。接受egfr靶向溶瘤病毒与8mg/kg雷帕霉素的小鼠体内的肿瘤展示最佳的反应。
图22a-22c示出了在肝脏中腺病毒介导的基因表达的消除，且腺病毒感染至肝脏的去靶向。如图22a中所示，adsyn-co199，一种缺少e1区域的腺病毒载体，在全身感染后以在肝脏中独有的高水平来表达荧光素酶。如图22b中所示，除了肝特异性微rnamir122消除了荧光素酶表达以外，当小鼠被adsyn-co200(一种匹配adsyn-co199的病毒)全身性感染时，荧光素酶信号丢失。如图22c中所示，除了腺病毒六邻体蛋白携带使其自肝脏去靶向的突变e451q以外，当小鼠被adsyn-co171(一种匹配adsyn-co200的病毒)全身性感染时，在脾脏中可检测到荧光素酶的表达。
图23a-23e包括对纤维蛋白结构的说明和一系列图表和图像，这些图表和图像表征重组腺病毒，其通过合并来自两种腺病毒血清型的模块以产生具有更好地转导各种细胞类型的嵌合纤维蛋白的病毒所产生。
图24a示出用以产生衣壳交换嵌合病毒(capsidswappedchimericvirus)的模块修饰的说明。图24b是列举具体突变体病毒及其e1、核、e3和e4模块修饰的表格。
图25a-25e是一系列免疫印迹，其示出了来自衣壳交换病毒的蛋白含量和表达。
图26a-26c是一系列图表，其示出了衣壳交换病毒并未被含有抗-ad5抗体的人类血清中和。
图27示出了来自人类腺病毒物种的e1a序列比对，包括物种a(ad12；seqidno:47)、物种b(ad7；seqidno:48)、物种c(ad2和ad5；分别为seqidno:49和seqidno:50)、物种d(ad9；seqidno:51)、物种e(ad4；seqidno:52)、物种f(ad40；seqidno:53)和物种g(ad52；seqidno:54)。框出的是y47，它是在本文公开的溶瘤腺病毒组合物中发现的一个突变位点。以灰框强调的是含有c124的lxcxe基序，其对于强e1a-rb相互作用是必要的。
图28示出了来自人类腺病毒物种的e4orf1序列的比对，包括物种a(ad12；seqidno:55)、物种b(ad7；seqidno:56)、物种c(ad2和ad5；分别为seqidno:57和seqidno:58)、物种d(ad9；seqidno:59)、物种e(ad4；seqidno:60)和物种g(ad52；seqidno:61)。以灰框强调的是pdz结合基序，e4orf1通过其上调pi3k且防止对细胞增殖的负调节。
图29示出了由具有雷帕霉素-依赖性egfr-靶向组分的合成性腺病毒感染的293-e4细胞的蛋白表达的免疫印迹。通过adsembly野生型ad(adsyn-co170)、经靶向-修饰的adsyn-co205或对照病毒adsyn-co206或adsyn-co207，以10的感染复数(moi)来感染293-e4细胞。对于雷帕霉素控制的egfr靶向病毒adsyn-co205，使gfp报告体与e1a融合作为感染标记。e3b转录物通过缺失ridα、ridβ和14.7k来修饰，且用于表达egfrvhh-fkbp。adsyn-co206含有adsyn-co205的所有修饰，但保留野生型纤维且因此不具有frb结构域。adsyn-co207具有adsyn-co206的所有修饰，但保留野生型e3区域，且因此不具有fkbp-融合基因。纤维的迁移变化示出了在adsyn-co207和adsyn-co205中插入90个氨基酸的frb结构域。通过探测fkbp12来检测egfrvhh-fkbp融合蛋白的表达。晚期蛋白表达的时间进程示出与adsembly野生型ad相比，衣壳突变体、或表达egfrvhh-fkbp的具有gfp-e1a报告体的病毒的复制无显著缺陷。
图30是示出了在三次瘤内注射媒介物(未感染)、对照病毒(adsyn-co442)或溶瘤腺病毒(adsyn-co335)且3周每隔一天腹膜内共同施用雷帕霉素(0、2或8mg/kg)后28天的hs578t异种移植物肿瘤反应的瀑布图。从左到右显示(a)未感染，无雷帕霉素；(b)未感染，2mg/kg雷帕霉素；(c)未感染，8mg/kg雷帕霉素；(d)adsyn-co335，无雷帕霉素；(e)adsyn-co335，2mg/kg雷帕霉素；(f)adsyn-co335，8mg/kg雷帕霉素；(g)adsyn-co442，2mg/kg雷帕霉素；和(h)adsyn-co442，8mg/kg雷帕霉素。n＝每组的肿瘤数量。每一列表示一种单独的肿瘤，数据相对于其处理前的肿瘤体积来表示。
图31示出了hs578t异种移植物组织的免疫组织化学(ihc)染色。通过腹膜内注射100μl媒介物、2mg/kg雷帕霉素或8mg/kg雷帕霉素来治疗患有皮下hs578t异种移植物肿瘤的小鼠。注射后一小时，收集异种移植物组织，固定在10％的福尔马林(formalin)中并切片以供由识别磷酸-t378形式的p70s6k的抗体来进行ihc染色。示出了针对在苏氨酸389处磷酸化的p70s6k(p70s6kp-t389)进行hs578t异种移植物组织切片染色的显微图像。在t389处磷酸化的p70s6k是mtor活性的标志。在无处理或具有低腺病毒egfr-靶向有效剂量(2mg/kg)的组织中，如p70s6kp-t389的染色所证实，mtor活性未受到抑制。在较高的腺病毒egfr-靶向有效剂量(8mg/kg)下，mtor活性受到抑制，标记为缺少p70s6kp-t389染色。
序列表
列于所附序列表中的核酸和氨基酸序列是使用如37c.f.r.1.822中所定义的核苷酸碱基的标准字母缩写和氨基酸的三字母代码来显示。仅显示每条核酸序列的一条链，但应理解任何提及所示链时均包括其互补链。序列表以ascii文本文件提交，创建于2015年9月23日，2.91mb，以引用的方式纳入本文。在所附序列表中：
seqidno:1-31和68-98是重组腺病毒的核苷酸序列(参见表1-5；实施例6；和实施例7)。
seqidno:32是ad5e1a的氨基酸序列。
seqidno:33是ad5e1aδlxcxe的氨基酸序列。
seqidno:34是ad5e1ac124g的氨基酸序列。
seqidno:35是ad5e1aδ2-11的氨基酸序列。
seqidno:36是ad5e1ay47hc124g的氨基酸序列。
seqidno:37是ad5e1aδ2-11y47hc124g的氨基酸序列。
seqidno:38是ad5e4orf1的氨基酸序列。
seqidno:39是ad5e4orf1δpdzb的氨基酸序列。
seqidno:40是ad5e4orf6/7的氨基酸序列。
seqidno:41是ad5纤维的氨基酸序列。
seqidno:42是ad5frb-纤维的氨基酸序列。
seqidno:43是ad5frb*-纤维的氨基酸序列。
seqidno:44是egfrvhh-gs-fkbp的氨基酸序列。
seqidno:45是ad5六邻体的氨基酸序列。
seqidno:46是ad5六邻体e451q的氨基酸序列。
seqidno:47是物种a(ad12)e1a的氨基酸序列。
seqidno:48是物种b(ad7)e1a的氨基酸序列。
seqidno:49是物种c(ad2)e1a的氨基酸序列。
seqidno:50是物种c(ad5)e1a的氨基酸序列。
seqidno:51是物种d(ad9)e1a的氨基酸序列。
seqidno:52是物种e(ad4)e1a的氨基酸序列。
seqidno:53是物种f(ad40)e1a的氨基酸序列。
seqidno:54是物种g(ad52)e1a的氨基酸序列。
seqidno:55是物种a(ad12)e4orf1的氨基酸序列。
seqidno:56是物种b(ad7)e4orf1的氨基酸序列。
seqidno:57是物种c(ad2)e4orf1的氨基酸序列。
seqidno:58是物种c(ad5)e4orf1的氨基酸序列。
seqidno:59是物种d(ad9)e4orf1的氨基酸序列。
seqidno:60是物种e(ad4)e4orf1的氨基酸序列。
seqidno:61是物种g(ad52)e4orf1的氨基酸序列。
seqidno:62是ad2的核苷酸序列。
seqidno:63是ad5的核苷酸序列。
seqidno:64是ad2e4orf6/7的氨基酸序列。
seqidno:65是ad5e3-ridá的氨基酸序列。
seqidno:66是ad5
seqidno:67是ad5e3-14.7k的氨基酸序列。
发明详述
i.缩写
ad腺病毒
car柯萨奇(coxsackie)腺病毒受体
cpe细胞病变效应
egfr表皮生长因子受体
elisa酶联免疫吸附测定
facs荧光活化细胞分选
fkbpfk506结合蛋白
frbfkbp-雷帕霉素结合
htert人类端粒酶逆转录酶
huvec人类血管内皮细胞
mav-1小鼠腺病毒1
mir微rna
moi感染复数
mtor雷帕霉素的哺乳动物靶
nha正常人类星形胶质细胞
pet正电子发射断层扫描
pi碘化丙啶
prppet报告探针
rb成视网膜细胞瘤
saec小气道上皮细胞
wt野生型
ii.术语和方法
除非另有说明，根据常规用法使用技术术语。分子生物学中的常用术语的定义可以见于benjaminlewin,genesv,由oxforduniversitypress出版，1994(isbn0-19-854287-9)；kendrew等人(编),theencyclopediaofmolecularbiology,由blackwellscienceltd.出版，1994(isbn0-632-02182-9)；和roberta.meyers(编),molecularbiologyandbiotechnology:acomprehensivedeskreference,由vchpublishers,inc.出版，1995(isbn1-56081-569-8)。
为了便于阅读本公开内容的各个实施方案，提供了以下对具体术语的解释：
腺病毒：一种具有线性双链dna基因组和二十面体衣壳的无包膜病毒。目前人类腺病毒的已知的68种血清型，分为7个物种(物种a、b、c、d、e、f和g)。不同血清型的腺病毒与不同类型的疾病相关，其中一些血清型导致呼吸道疾病(主要是物种b和c)、结膜炎(物种b和d)和/或肠胃炎(物种f和g)。
施用：为了通过任何有效途径向对象提供或给予一种药剂，如治疗剂(例如，重组病毒)。示例性的施用途径包括(但不限于)注射(如皮下、肌内、真皮内、腹膜内和静脉内)、口服、管内、舌下、直肠、经皮、鼻内、阴道和吸入途径。
抗体：一种多肽配体，包含识别且结合(如特异性地识别和特异性地结合)抗原的表位的至少一条轻链和/或重链免疫球蛋白可变区。免疫球蛋白分子包含重链和轻链，其各自具有可变区，称为可变重链(vh)区和可变轻链(vl)区。vh区和vl区一起负责结合抗体所识别的抗原。
抗体包括本领域公知的完整免疫球蛋白以及抗体的变体和部分(片段)，如单域抗体(例如，vh结构域抗体或vhh抗体)、fab片段、fab'片段、f(ab)'2片段、单链fv蛋白(“scfv”)和二硫键稳定的fv蛋白(“dsfv”)。scfv蛋白是一种融合蛋白，其中免疫球蛋白的轻链可变区和免疫球蛋白的重链可变区通过接头连接，而在dsfv中，链经过突变引入二硫键来稳定链的缔合。术语“抗体”还包括遗传工程化的形式，如嵌合抗体(例如，人源化鼠抗体)和异源缀合抗体(如双特异性抗体)。也参见piercecatalogandhandbook,1994-1995(piercechemicalco.,rockford,il)；kuby,j.,immunology,第3版,w.h.freeman&co.,newyork,1997。
化疗剂：在以细胞生长异常为特征的疾病治疗中具有治疗用处的任何化学药剂。所述疾病包括肿瘤、新生物和癌症以及具有增生性生长特征的疾病，如牛皮癣。在一个实施方案中，化疗剂是放射性化合物。本领域技术人员能够容易地确认使用的化疗剂(参见例如，slapak和kufe,principlesofcancertherapy,harrison'sprinciplesofinternalmedicine中的第86章，第14版；perry等人,chemotherapy,abeloff,clinicaloncology第2版中的第17章，
嵌合：由具有不同来源的至少两部分组成。在本公开内容的上下文中，“嵌合腺病毒”是具有源自至少两种不同血清型(如源自ad5和另一种血清型的腺病毒)的遗传物质和/或蛋白质的腺病毒。在此上下文中，“衣壳交换”腺病毒是指其中衣壳蛋白源自一种腺病毒血清型且其余蛋白质源自另一种腺病毒血清型的嵌合腺病毒。类似地，“嵌合纤维”是具有源自至少两种不同的腺病毒血清型的氨基酸序列的纤维蛋白。例如，嵌合纤维可由来自ad5的纤维轴和来自第二种腺病毒血清型的纤维结节(fiberknob)组成(参见图23a)。
接触：置于直接物理结合，包括以固体和液体形式。
简并变体：在本公开内容的上下文中，“简并变体”是指编码包括由于遗传密码子而简并的序列的肽的多核苷酸。存在20种天然氨基酸，其中大多数由多于一个密码子规定。因此，只要核苷酸序列所编码的肽的氨基酸序列不变，就包括编码该肽的所有简并核苷酸序列。
缺失的：编码“缺失的”e4orf1或e4orf6/7蛋白的腺病毒基因组是指完全缺失e4orf1或e4orf6/7编码序列，或部分缺失导致不存在e4orf1或e4orf6/7蛋白表达的腺病毒。
e2f失调：是指e2f转录因子和下游靶基因的活性增加，这发生在几乎所有类型的人类癌症中。e2f途径活性和转录的失调可起因于途径的任何上游组件的各种不同突变，如丧失功能的突变以及rb、p107和p130肿瘤抑制因子的缺失。rb是第一个确认的肿瘤抑制因子且在至少三分之一的人类肿瘤中不存在或发生突变。另外，p16突变和/或表观遗传沉默可在肿瘤细胞中活化e2f。细胞周期蛋白d和cdk4突变、基因扩增或过表达也可以导致人类肿瘤中的e2f活性失调。另外，e2f由包括egfr、rtk、ras、raf、pi-3k、pten、raf、myc的生长因子受体途径突变而活化。p16ink4a-细胞周期蛋白d:cdk4/6-rb-e2f途径的突变通常以互相排斥的方式发生，使得一种‘命中’(例如，p16)不伴随有其他情形(例如，rb突变或细胞周期蛋白d:cdk过表达)。然而，目前大多数化疗剂是抑制e2f转录靶的增殖性毒药，但对正常细胞也具有毒性且常具有毁灭性的医原性并发症。如本文中公开，一种替代性的治疗方法是使用在使p16-细胞周期蛋白d:cdk4-rb-e2f途径失调的癌细胞病变中进行选择性溶解性复制的病毒。
e1a：腺病毒早期区域1a(e1a)基因和由此基因表达的多肽。e1a蛋白通过驱动细胞进入细胞周期在病毒基因组复制中发挥作用。如本文所用，术语“e1a蛋白”是指由e1a基因表达的蛋白且该术语包括由任何腺病毒血清型产生的e1a蛋白。举例而言，野生型ad5e1a蛋白的氨基酸序列在本文中由seqidno:32所示，且经修饰的ad5e1a序列在本文中由seqidno:33-37来提供。另外，来自各种不同腺病毒血清型的野生型e1a蛋白序列在本文中由seqidno:47-54所示。在一些实施方案中，经修饰的e1a蛋白包括与seqidno:32-37或seqidno:47-54中任一者具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性的蛋白。本文涵盖的经修饰的e1a蛋白是导致重组腺病毒在正常细胞中与在肿瘤细胞中相比存在复制缺陷的那些蛋白。本文公开的经修饰的e1a蛋白是ad5e1a蛋白。然而，可在任何需要的血清型中进行相应修饰，且因此为本公开内容所涵盖。例如，所有物种的人类腺病毒均含有lxcxe基序，其在ad5中对应于ltche(seqidno:32的残基122-126)。类似地，残基2-11缺失以及y47h和c124g置换参考ad5来编号，但可以引入任何其他血清型中(参见图27，其提供来自所有人类腺病毒物种的e1a比对)。
e3-ridα/ridβ和e3-14.7k：由e3基因产生的早期表达的蛋白。e3-ridα、e3-ridβ和e3-14.7k蛋白构成受体内化和退化复合物(rid)，其定位至核膜且导致包括cd95(fasl受体)及tnfr1和2(tnf/trail受体)的各种受体的内吞作用和降解，从而保护受感染细胞以免于宿主抗病毒反应。e3-ridα、e3-ridβ和e3-14.7k编码序列以此顺序彼此相邻。在本公开内容的一些实施方案中，e3-ridα的起始密码子至e3-14.7k的终止密码子被缺失且由fkbp-融合蛋白的编码序列置换(参见例如，adsyn-co312、adsyn-co313、adsyn-co335和adsyn-co440)。ad5e3-ridα、e3-ridβ和e3-14.7k的氨基酸序列在本文中由seqidno:65-67所示。
e4orf1：由e4基因产生的腺病毒蛋白质。术语“e4orf1蛋白”包括由来自任何腺病毒血清型的e4基因产生的e4orf1蛋白。举例而言，野生型ad5e4orf1蛋白的氨基酸序列在本文中由seqidno:38所示，且具有pdz-结合基序缺失的经修饰的ad5e4orf1蛋白在本文中以seqidno:39提供。另外，来自各种不同腺病毒血清型的野生型e4orf1蛋白序列在本文中由seqidno:55-61所示。在一些实施方案中，经修饰的e4orf1蛋白包括与seqidno:38、39和55-61中任一者具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性的蛋白。本文涵盖的经修饰的e4orf1蛋白是导致重组腺病毒在正常细胞中与在肿瘤细胞中相比存在复制缺陷的那些蛋白。本文公开的经修饰的e4orf1蛋白是ad5e4orf1蛋白。然而，可在任何需要的血清型中进行相应修饰，且因此为本公开内容所涵盖。如图28中所示的e4orf1比对所示，e4orf1的c末端三个残基构成腺病毒物种a、b、c、d、e和g中的pdz-结合基序。在本文的一些实施方案中，重组腺病毒编码完全缺失e4orf1。
e4orf6/7：由腺病毒e4基因编码的蛋白。术语“e4orf6/7蛋白”包括由来自任何腺病毒血清型的e4基因产生的e4orf6/7蛋白。举例而言，野生型ad5e4orf6/7蛋白的氨基酸序列在本文中由seqidno:40所示，且野生型ad2e4orf6/7蛋白的氨基酸序列在本文中由seqidno:64所示。在一些实施方案中，e4orf6/7蛋白包括与seqidno:40或seqidno:64中任一者具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性的蛋白。本文涵盖的经修饰的e4orf6/7蛋白是导致重组腺病毒在正常细胞中与在肿瘤细胞中相比存在复制缺陷的那些蛋白。在一些实施方案中，经修饰的e4orf6/7蛋白包含破坏或损伤其e2f结合位点和/或损伤e2f相互作用的突变(如缺失)。在其他实施方案中，经修饰的e4orf6/7蛋白包含缺失或损伤核定位信号的修饰，所述核定位信号为e2f4有效易位所需要的。示例性的e4orf6/7修饰在下文章节中进一步论述。
表皮生长因子受体(egfr)：细胞外蛋白配体egf家族成员的细胞表面受体。egfr也称为erbb-1和her1。许多类型的癌症含有导致egfr过表达的突变。
纤维：腺病毒纤维蛋白是一种介导结合至细胞表面受体的三聚体蛋白。纤维蛋白包含长的n末端轴和球状的c末端结节(参见图23a)。
fk506结合蛋白(fkbp)：在真核细胞中表达的蛋白家族，其充当蛋白折叠伴侣。fkbp因其结合雷帕霉素的能力而闻名。示例性的fkbp序列在本文中由seqidno:44的残基132-238所示。
fkbp-雷帕霉素结合(frb)：哺乳动物雷帕霉素靶(mtor)的结构域，其结合雷帕霉素。frb的示例性序列在本文中由seqidno:42的残基547-636所示。能够结合雷帕霉素和雷帕霉素类似物(rapalog)(也称为ap21967)的frb的突变体形式(本文中称作“frb*”)在本文中由seqidno:43的残基547-636所示。frb*在人类mtor的2098位(对应于seqidno:43的残基620)处含有苏氨酸到亮氨酸(t2098l)的置换。
融合蛋白：一种含有来自至少两种不同(异源)蛋白或肽的氨基酸序列的蛋白。融合蛋白例如可以通过表达由编码两种不同(异源)蛋白的至少一部分的核酸序列工程化的核酸序列而产生。为了产生融合蛋白，核酸序列必须在同一阅读框中且不含内部终止密码子。融合蛋白，尤其是短的融合蛋白，也可以通过化学合成而产生。
异源：异源蛋白或多肽是指源自不同来源或物种的蛋白或多肽。
六邻体：一种主要的腺病毒衣壳蛋白。来自ad5的示例性六邻体序列在本文中由seqidno:45所示。包含e451q置换的突变体六邻体序列在本文中由seqidno:46所示。
分离的：“分离的”生物组分(如核酸分子、蛋白质、病毒或细胞)已基本上自生物体细胞或组织中的其他生物组分或自生物体本身分离或纯化，其中所述组分天然存在，例如其他染色体和染色体外的dna和rna、蛋白质和细胞。已“分离的”核酸分子和蛋白质包括通过标准纯化方法纯化的那些核酸分子和蛋白质。该术语也涵盖通过在宿主细胞中重组表达制备的核酸分子和蛋白质以及化学合成的核酸分子和蛋白。
微rna(mirna或mir)：在植物、动物及病毒中调节基因表达的单链rna分子。编码微rna的基因经过转录形成初级转录物微rna(pri-mirna)，其经过加工形成短的茎环分子，称为前体微rna(pre-mirna)，紧接着内切核苷酸裂解形成成熟的微rna。成熟的微rna长度为约21-23个核苷酸且与一个或多个靶信使rna(mrna)的3'utr部分互补。微rna通过促使靶mrna裂解或通过阻断细胞转录物翻译来调节基因表达。在本公开内容的上下文中，“肝特异性微rna”是优先在肝脏中表达的微rna，如仅在肝脏中表达的微rna或与其他器官或组织类型相比在肝脏中表达显著更多的微rna。
修饰：对核酸序列或蛋白序列的改变。例如，氨基酸序列修饰包括例如置换、插入和缺失或其组合。插入包括氨基和/或羧基末端融合以及序列内插入单个或多个氨基酸残基。缺失的特征在于自蛋白序列去除一个或多个氨基酸残基。在本文的一些实施方案中，修饰(如置换、插入或删除)导致功能改变，如蛋白的特定活性减小或增强。如本文所用，“δ”或“δ”是指缺失。例如，e1aδlxcxe是指缺失lxcxe基序的e1a多肽。置换修饰是其中去除至少一个残基且在其位置处插入另一残基的那些修饰。氨基酸置换典型的是对于单一残基，但可同时发生在多个不同位置。置换、缺失、插入或其任意组合可组合达到最终的突变体序列。这些修饰可以通过修饰编码蛋白的dna中的核苷酸来制备，从而产生编码所述修饰的dna。用于在具有已知序列的dna中的预定位点进行插入、缺失和置换突变的技术是本领域公知的。“经修饰的”蛋白质、核酸或病毒是具有一种或多种如上文概述的修饰的蛋白质、核酸或病毒。
新生物、恶性肿瘤、癌症和肿瘤：新生物是因过度细胞分裂导致的组织或细胞异常生长。新生物生长可产生肿瘤。个体中的肿瘤量是可根据肿瘤的数量、体积或重量进行测量的“肿瘤负荷”。不转移的肿瘤称作“良性的”。侵袭周围组织和/或可转移的肿瘤称作“恶性的”。恶性肿瘤也称为“癌症”。
血液癌症是血液或骨髓癌症。血液(或血源性)癌症的实例包括白血病，包括急性白血病(如急性淋巴细胞白血病、急性粒细胞白血病、急性髓性白血病和骨髓性、早幼粒细胞、骨髓单核细胞、单核细胞和红白血病)、慢性白血病(如慢性髓细胞(粒细胞)白血病、慢性髓性白血病和慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金氏病(hodgkin'sdisease)、非霍奇金氏淋巴瘤(non-hodgkin'slymphoma)(不活跃的和高级别形式)、多发性骨髓瘤、华氏巨球蛋白血症(waldenstrom'smacroglobulinemia)、重链病、骨髓增生异常综合症、毛细胞白血病和脊髓发育不良。在一些情况下，认为淋巴瘤是实体肿瘤。
实体肿瘤是通常不含囊肿或液体区域的异常组织肿块。实体肿瘤可以是良性或恶性的。不同类型的实体肿瘤以形成它们的细胞类型来命名(如肉瘤、癌瘤和淋巴瘤)。实体肿瘤(如肉瘤和癌瘤)的示例包括纤维肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤和其他肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤(ewing'stumor)、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髓样癌、甲状腺乳头状癌、嗜铬细胞瘤皮脂腺癌、乳头状癌、人类乳头瘤病毒(hpv)感染的瘤形成、乳头状腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、威尔姆氏肿瘤(wilms'tumor)、宫颈癌、睾丸肿瘤、精原细胞瘤、膀胱癌、黑素瘤和cns肿瘤(如神经胶质瘤(如脑干神经胶质瘤和混合型神经胶质瘤)、成胶质细胞瘤(也称为多形性成胶质细胞瘤)、星形细胞瘤、cns淋巴瘤、生殖细胞瘤、成神经管细胞瘤、神经鞘瘤(schwannoma)、颅咽管瘤(craniopharyogioma)、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤(menangioma)、成神经细胞瘤、成视网膜细胞瘤和脑转移)。
溶瘤病毒：选择性地杀死增殖性失调的细胞(例如，癌症/肿瘤细胞)的病毒。癌症细胞的杀死可以通过本领域中确认的任何方法来检测，如确定活细胞的计数，或检测病毒蛋白在癌细胞中的细胞病变效应、细胞凋亡或合成(例如，通过对复制所必需的病毒基因进行代谢标记、免疫印迹或rt-pcr)或肿瘤尺寸的减小。
可操作地连接：当第一核酸序列与第二核酸序列置于功能性关系中时，所述第一核酸序列与第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，所述启动子即与所述编码序列可操作地连接。一般来说，可操作地连接的dna序列是连续的，并且在必要时在同一阅读框中连接两个蛋白编码区。
药学可接受的载体：可用于本公开内容的药学可接受的载体(媒介物)是常规的。remington’spharmaceuticalsciences,bye.w.martin,mackpublishingco.,easton,pa,第15版(1975)记载了适用于一种或多种治疗组合物、分子或药剂(例如，本文公开的重组病毒)的药物递送的组合物和配制物。
一般来说，载体的性质将取决于所采用的施用具体方式。例如，肠胃外配制物通常包含包括药学上和生理学上可接受的流体(例如水、生理盐水、平衡盐溶液、水性右旋糖、甘油等)作为媒介物的可注射流体。对于固体组合物(例如，粉末、丸剂、片剂或胶囊形式)，常规的非毒性固体载体可包括例如药物级的甘露糖醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除生物学上中性的载体以外，待施用的药物组合物可以含有少量的非毒性辅助物质，如湿润剂或乳化剂、防腐剂和ph缓冲剂等，例如乙酸钠或山梨糖醇单月桂酸酯。
多肽、肽或蛋白质：其中单体是通过酰胺键连接在一起的氨基酸残基的聚合物。当氨基酸为α-氨基酸时，可使用l-光学异构体或d-光学异构体。术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用。这些术语适用于其中一个或多个氨基酸残基为天然存在的氨基酸对应的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。术语“残基”或“氨基酸残基”包括提到并入蛋白质、多肽或肽中的氨基酸。
多肽中的保守性置换是将蛋白序列中的一个氨基酸残基置换成具有类似生物化学特性的不同氨基酸残基。保守性置换通常对所得多肽的活性具有极小影响或无影响。例如，包括一个或多个保守性置换(例如，不超过1、2、3、4或5个置换)的蛋白质或肽保留野生型蛋白质或肽的结构和功能。多肽可以通过使用例如标准方法(如定点诱变或pcr)操纵编码所述多肽的核苷酸序列产生以含有一个或多个保守性置换。在一个实例中，通过测试抗体交叉反应性或其诱发免疫反应的能力，可容易地选择这类变体。下文示出保守性置换的实例。
保守性置换一般维持(a)置换区域中多肽主链的结构，例如折叠或螺旋构象，(b)靶位点处分子的电荷或疏水性或(c)侧链的体积。
通常被预期产生蛋白质特性的最大改变的置换将为非保守性的，例如如下中的改变：(a)亲水性残基(例如丝氨酰基或苏氨酰基)置换(或被置换为)疏水性残基(例如亮氨酰基、异亮氨酰基、苯丙氨酰基、缬氨酰基或丙氨酰基)；(b)半胱氨酸或脯氨酸置换(或被置换为)任何其他残基；(c)具有带正电的侧链的残基(例如赖氨酰基、精氨酰基或组氨酰基)置换(或被置换为)带负电的残基(例如谷氨酰基或天冬氨酰基)；或(d)具有大的侧链的残基(例如苯丙氨酸)置换(或被置换为)不具有侧链的残基(例如甘氨酸)。
预防、治疗或改善疾病：“预防”疾病是指抑制疾病的全面发展。“治疗”是指在疾病或病理状态开始发展后改善其迹象或症状的治疗性干预。“改善”是指减少疾病的迹象或症状的数量或严重性。
启动子：指导/起始核酸(例如，基因)转录的dna区域。启动子包括转录开始位点附近的必需核酸序列。启动子通常位于其转录的基因附近。启动子还任选地包括位于离转录开始位点多至数千碱基对的远端增强子或抑制元件。“组成型启动子”是具有连续活性而且不受外部信号或分子调节的启动子。相反，“可诱导型启动子”的活性由外部信号或分子(例如，转录因子或四环素)来调节。
蛋白ix(pix)：与六邻体蛋白相关的腺病毒衣壳的次要组分。
纯化的：术语“纯化的”不需要绝对纯度；而是意欲作为相对的术语。因此，例如，纯化的肽、蛋白、病毒或其他活性化合物是完整地或部分地从天然相关的蛋白质和其他污染物分离的肽、蛋白、病毒或其他活性化合物。在某些实施方案中，术语“基本上纯化的”是指从细胞、细胞培养基或其他粗制备物中分离且经历分级去除初始制备物中的各种组分(如蛋白、细胞碎片和其他组分)的肽、蛋白、病毒或其他活性化合物。
雷帕霉素：具有已知免疫抑制和抗增殖特性的小分子。雷帕霉素，也称为西罗莫司(sirolimus)是最初作为细菌吸水链霉菌(streptomyceshygroscopicus)的产物而被发现的一种大环内酯。雷帕霉素结合且抑制mtor的活性。
rb缺陷细胞：其中肿瘤抑制物rb的水平与正常或对照细胞中的rb水平相比降低的细胞(如肿瘤细胞)，或其中rb途径被破坏或失活的细胞。术语“rb途径”或“rb信号途径”至少部分地是指影响prb活性的分子，包括prb/p107、e2f-1/-2/-3和g1细胞周期蛋白/cdk复合物。将了解，目前未知的分子也可以在此定义中。
rb/p16/细胞周期蛋白d:cdk4/e2f复制损伤或缺陷腺病毒：在感染细胞后，在正常水平的功能性细胞rb/p107/p130/p16/细胞周期蛋白:cdk/e2f途径蛋白(包括rb/p107/p130/p16/e2f/cdk-细胞周期蛋白检查点)存在下展现部分或完全减弱的复制的腺病毒(如修饰/重组腺病毒)。例如，如果受感染细胞是rb/p16途径损伤或缺陷的(即，受感染细胞不表达正常水平的完全功能性rb或rb/p16途径中的其他蛋白)，rb/p16/e2f途径复制受损伤的腺病毒的复制将继续正常进行。相反，如果细胞表达正常水平的功能性rb(例如，具有正常活性的rb，在本文中也称为“rb表达细胞”)，rb复制受损伤或缺陷的腺病毒的复制则被减弱或受阻。细胞因无法表达正常水平的rb(例如，rb基因的调节区的突变)或表达具有低于正常rb活性的突变rb而可能为rb受损伤或缺陷的。在相同类型的健康无疾病细胞中可见正常水平的rb和正常的rb活性水平。因此，rb受损伤细胞包括突变rb基因。任选地，rb受损伤细胞包括其中rb基因完全或部分缺失的基因组。rb受损伤细胞可以是癌症/肿瘤细胞。可导致丧失正常rb功能的其他基因组损伤包括(但不限于)cdk突变、细胞周期蛋白突变和扩增、p16突变和/或表观遗传沉默、p107突变、p130突变和生长因子受体途径突变。
rb/p16肿瘤抑制途径或rb/p16途径：是指整个信号途径，其包括成视网膜细胞瘤(rb)蛋白和该途径中的其他蛋白/蛋白家族，包括但不限于cdk、e2f、非典型蛋白激酶c和skp2。术语“rb/p16肿瘤抑制途径受损伤或缺陷”意思是信号途径中的一个或多个分子例如因无法表达正常水平的蛋白质或表达具有低于正常活性的突变蛋白质而受损伤或缺陷，使得途径功能不正常。这类缺陷导致高表达水平的游离e2f和高活性的e2f启动子。因此，细胞可因无法表达正常水平的蛋白质或表达在rb/p16肿瘤抑制途径中具有低于正常活性的突变体蛋白而受损伤或缺陷。
重组：重组核酸分子、蛋白质或病毒是具有非天然存在的序列或具有通过人工组合两种分开的序列区段制得的序列的核酸分子、蛋白或病毒。这种人工组合可以通过化学合成或通过人工操作分离的核酸分子区段来实现，如通过遗传工程技术。术语“重组”还包括已通过添加、置换或缺失天然核酸分子、蛋白或病毒的一部分来改变的核酸、蛋白和病毒。
复制缺陷：在非肿瘤细胞(与肿瘤细胞相比)中展现“复制缺陷”的腺病毒是指与肿瘤细胞相比，在正常细胞中展现病毒复制减少的腺病毒。复制缺陷通过例如与肿瘤细胞相比，在正常细胞中病毒晚期蛋白质表达缺乏、病毒dna合成减少、诱发e2f靶基因(例如，细胞周期蛋白a和b)的能力降低、引发s期进入的能力降低和/或诱发细胞杀死的能力降低而得以证实。
复制缺陷病毒：在具有给定表型的预定细胞群(例如，e2f途径失调的肿瘤细胞)中，优先抑制细胞增殖、导致细胞溶解或诱发细胞凋亡(总体上认为杀死)的病毒。这类病毒在不具有预定细胞表型的细胞(如正常非肿瘤细胞)中无法减少或抑制细胞增殖、导致细胞溶解、诱发细胞凋亡或复制，或这些能力受到限制。
序列一致性：序列之间的一致性或相似性表达两个或更多个核酸序列或两个或更多个氨基酸序列之间的一致性或相似性。可以根据一致性百分比来测量序列一致性；百分比越高，序列一致性越大。可以根据相似性百分比(考虑保守性氨基酸置换)测量序列相似性；百分比越高，序列越相似。在使用标准方法比对时，核酸或氨基酸序列的同源物或直系同源物具备相对高度的序列一致性/相似性。当直系同源蛋白或cdna源自更密切相关的物种(如人类和小鼠序列)时，与相关性更远的物种(如人类和秀丽隐杆线虫(c.elegans)序列)相比，此同源性更显著。
比对用于比较的序列的方法是本领域中公知的。多种程序和比对算法记载于：smith&waterman,adv.appl.math.2:482,1981；needleman&wunsch,j.mol.biol.48:443,1970；pearson&lipman,proc.natl.acad.sci.usa85:2444,1988；higgins&sharp,gene,73:237-44,1988；higgins&sharp,cabios5:151-3,1989；corpet等人,nuc.acidsres.16:10881-90,1988；huang等人computerappls.inthebiosciences8,155-65,1992；和pearson等人,meth.mol.bio.24:307-31,1994。altschul等人,j.mol.biol.215:403-10,1990提出了对序列比对方法和同源性计算的详细见解。
ncbi基本局部比对搜索工具(basiclocalalignmentsearchtool，blast)(altschul等人,j.mol.biol.215:403-10,1990)可由几种来源获得，包括国家生物技术信息中心(nationalcenterforbiologicalinformation，ncbi)和网络，其结合序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx来使用。其他信息可见于ncbi网站。
血清型：由一组抗原特征区别的一组密切相关的微生物(如病毒)。
对象：活的多细胞脊椎动物生物体，包括人类和非人类哺乳动物的一类。
合成性的：在实验室中通过人工方式产生，例如合成性的核酸或蛋白质可在实验室中化学合成。
靶向配体：在本公开内容的上下文中，“靶向配体”是将重组腺病毒导向特定细胞类型的蛋白，所述特定细胞类型表达对靶向配体具有特异性的受体或结合蛋白。在一些实施方案中，靶向配体是对在肿瘤中过表达的细胞表面蛋白(例如，egfr)具有特异性的抗体。
治疗剂：在适当施用于对象时能够诱发所需的治疗或预防作用的化学化合物、小分子、重组病毒或其他组合物，如反义化合物、抗体、肽或核酸分子。例如，癌症治疗剂包括预防或抑制癌症发展或转移的药剂。
治疗有效量：指定的药学或治疗性药剂(例如，重组病毒)的量，其足以在以该药剂治疗的对象或细胞中达成所需作用。药剂的有效量可取决于几种因素，包括但不限于被治疗的对象或细胞及治疗性组合物的施用方式。
u外显子：位于早期e3区域与纤维基因之间的l链(向左转录)上的开放阅读框(tollefson等人,jvirol81(23):12918-12926)。
载体：载体是允许插入外来核酸，但不破坏载体在宿主细胞中复制和/或整合的能力的核酸分子。载体可包括允许其在宿主细胞中复制的核酸序列，如复制原点。载体还可以包括一个或多个选择性标记基因和其他遗传元件。表达载体是含有必要的调控序列以允许插入的基因转录和翻译的载体。
除非另有说明，本文中所使用的所有技术和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。除非上下文中另有明确说明，单数术语“一”(“a”)、“一个”(“an”)和“所述”(“the”)包括复数指代对象。“包含a或b”意思是包括a、或b、或a和b。还应理解，对于核酸或多肽给出的所有碱基大小或氨基酸大小和所有分子量或分子质量值都是近似值，并且为了描述而提供。虽然可以在本公开内容的实施或测试中使用与本文中所描述的那些类似或等同的方法和材料，但在下文中描述了合适的方法和材料。本文中所提及的所有出版物、专利申请、专利以及其他参考文献以引用的方式全文纳入。如出现冲突，以本说明书(包括对术语的解释)为准。另外，材料、方法以及实施例仅仅是说明性的，不意欲进行限制。
iii.重组腺病毒
本公开内容提供了能够在e2f失调肿瘤细胞中选择性地复制的重组腺病毒。本文中公开的所述重组腺病毒具有编码经修饰的e1a蛋白、经修饰或缺失的e4orf1蛋白、经修饰或缺失的e4orf6/7蛋白或其任意组合的基因组。由于e1a、e4orf1和/或e4orf6/7突变，所述重组腺病毒在正常(即，非肿瘤)细胞中展现复制缺陷，同时保留在肿瘤细胞中复制和溶解肿瘤细胞的能力。在一个实例中，相对于相同细胞类型的肿瘤细胞，所述重组腺病毒在正常(即，非肿瘤)细胞中的复制减少(例如，乳腺癌细胞相对于正常乳腺细胞)，例如通过比较受感染正常细胞与受感染肿瘤细胞中的感染性颗粒的数量所确定，如减少至少20％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％。
本文中提供的所述重组腺病毒任选地包括其他修饰，如用于靶向特异性细胞类型，抑制靶向肝脏和在肝脏中的复制，以及逃避已有的常见的腺病毒血清型的中和抗体。还提供编码所述溶瘤腺病毒的重组核酸分子。
本文中还提供在ef1α启动子控制下表达gfp-荧光素酶的重组报告腺病毒基因表达载体。在一些情况下，所公开的报告腺病毒包括一种或多种修饰从而抑制靶向肝脏和在肝脏中的复制。还提供编码所述重组报告腺病毒的重组核酸分子。
a.溶瘤修饰
参考腺病毒5(ad5)基因组序列描述本文公开的具体的溶瘤修饰。然而，可以在任何人类腺病毒血清型中进行相同的修饰和缺失。在一个示例性的实施方案中，重组腺病毒为ad34。在其他具体的实施方案中，所述重组腺病毒为ad11或ad37。图27和28说明人类腺病毒物种之间e1a和e4orf1区域的序列相似性。
e1a的cr1区与细胞e2f具有序列和结构同源性，且与e2f-rb相互作用竞争。保守的e1a疏水性残基l43、l46和y47充当与rb相互作用的疏水性锚。l43、l46和/或y47突变为极性氨基酸(如d、e、h、k或r)将消除这种e1a-rb相互作用。在本公开内容的一些实施方案中，所述重组腺病毒包括e1a中的y74h突变从而破坏e1a-rb相互作用。
e1a通过其lxcxe基序来与rb强烈地相互作用。由于第一亮氨酸和中心半胱氨酸的侧链在rb的bbox基序的小疏水口袋中结合，因此缺失这些残基或这些残基突变为小的氨基酸(如g)或极性氨基酸(如d、e、h、k或r)将消除这种e1a-rb相互作用。因此，在本文的一些实施方案中，所述重组腺病毒包括lxcxe基序缺失(δlxcxe)或e1a中的c124g置换。
两个e1a残基c124和y47对于结合至rb和使rb失活都很重要。因此，在一些实施方案中，所述重组腺病毒编码双重突变体y/f47h和c124g，但相信对这些残基和区域进行的任何突变(如上文所述)将导致减弱e1a-rb相互作用。因此，本文涵盖破坏rb-e1a相互作用的任何残基的突变或缺失。
缺失e1a的残基2-11消除p300/cbp相互作用且破坏dp-1相互作用，进一步降低e1a使e2f靶上调的能力。本文中还涵盖e1a残基2-11中的点突变，如保守的r2或h3残基的甘氨酸或丙氨酸突变，或来自不同腺病毒血清型的疏水性i/l/v4的极性残基突变(例如，d、e、h、k或r)(参见图27中所示的e1a比对)以消除此相互作用。
e4orf1通过pdz-结合基序在其c末端与含有pdz基序的细胞蛋白质相互作用。在本文公开的一些实施方案中，缺失e4orf1的最后三个氨基酸以消除其pdz-结合基序。本文中还涵盖ad5e4orf1的高度保守s126点突变为大的疏水性残基，如v、l或i；或ad5e4orf1的v128点突变为极性残基，如d、e、h、k或r。相信这些置换消除e4orf1的pdz-结合活性且消除e4orf1的此转化功能。在其他腺病毒血清型(如ad34)中可对e4orf1进行相同的缺失和/或突变。也可以引入e4orf1的完全缺失。
本文中提供一种重组腺病毒，其中所述重组腺病毒的基因组编码经修饰的e1a蛋白、经修饰或缺失的e4orf1蛋白、经修饰或缺失的e4orf6/7蛋白或其任意组合，且其中所述重组腺病毒在正常细胞中与在肿瘤细胞中相比展现复制缺陷。
在一些实施方案中，所述基因组编码经修饰的e1a蛋白和经修饰或缺失的e4orf1蛋白。在其他实施方案中，所述基因组编码经修饰的e1a蛋白和缺失的e4orf6/7蛋白。又在其他实施方案中，所述基因组编码经修饰的e1a蛋白、经修饰或缺失的e4orf1蛋白和缺失的e4orf6/7蛋白。
在一些实例中，所述重组腺病毒的所述经修饰的e1a蛋白包含lxcxe基序缺失；残基2-11缺失；c124g置换；y47h置换；y47h置换和c124g置换；或y47h置换、c124g置换和残基2-11缺失。参考具有氨基酸序列seqidno:32的ad5e1a来描述这些突变；然而，相应突变可在任何其他人类腺病毒中进行，因为e1a序列是高度保守的(参见图27)。
在一些实例中，所述经修饰的e4orf1蛋白包含pdz-结合基序缺失。在其他实例中，所述e4orf1蛋白包含c末端的10个氨基酸或20个氨基酸缺失，或d68突变为a、k、r、p、f、g或l。
在一些实例中，经修饰的e4orf6/7蛋白包含破坏或损害其e2f结合位点和/或损害e2f相互作用的突变(如缺失)。在其他实施方案中，经修饰的e4orf6/7蛋白包含缺失或损伤核定位信号的修饰，所述核定位信号为e2f4的有效易位所需要。
在具体的非限制性实例中，重组腺病毒的基因组编码包含lxcxe基序缺失的经修饰的e1a蛋白和e4orf6/7蛋白缺失(参见例如，adsyn-co181、adsyn-co312、adsyn-co313、adsyn-co335、adsyn-co442)；
包含lxcxe基序缺失的经修饰的e1a蛋白、包含pdz-结合基序缺失的经修饰的e4orf1蛋白和e4orf6/7蛋白缺失(参见例如adsyn-co285)；
包含lxcxe基序缺失的经修饰的e1a蛋白、e4orf1蛋白缺失和e4orf6/7蛋白缺失(参见例如adsyn-co286)；
包含c124g置换的经修饰的e1a蛋白和e4orf6/7蛋白缺失(参见例如adsyn-co287)；
包含c124g置换的经修饰的e1a蛋白、包含pdz-结合基序缺失的经修饰的e4orf1蛋白和e4orf6/7蛋白缺失(参见例如adsyn-co288)；
包含c124g置换的经修饰的e1a蛋白、e4orf1蛋白缺失和e4orf6/7蛋白缺失(参见例如adsyn-co289)；
包含残基2-11缺失的经修饰的e1a蛋白和e4orf6/7蛋白缺失(参见例如adsyn-co290)；
包含残基2-11缺失的经修饰的e1a蛋白、包含pdz-结合基序缺失的经修饰的e4orf1蛋白和e4orf6/7蛋白缺失(参见例如adsyn-co291)；
包含残基2-11缺失的经修饰的e1a蛋白、e4orf1蛋白缺失和e4orf6/7蛋白缺失(参见例如adsyn-co292)；
包含y47h置换和c124g置换的经修饰的e1a蛋白，和e4orf6/7蛋白缺失(参见例如adsyn-co293)；
包含y47h置换和c124g置换的经修饰的e1a蛋白、包含pdz-结合基序缺失的经修饰的e4orf1蛋白和e4orf6/7蛋白缺失(参见例如adsyn-co294)；
包含y47h置换和c124g置换的经修饰的e1a蛋白、e4orf1蛋白缺失和e4orf6/7蛋白缺失(参见例如adsyn-co295)；
包含y47h置换、c124g置换且残基2-11缺失的经修饰的e1a蛋白，和e4orf6/7蛋白缺失(参见例如adsyn-co296)；
包含y47h置换、c124g置换且残基2-11缺失的经修饰的e1a蛋白、包含pdz-结合基序缺失的经修饰的e4orf1蛋白和e4orf6/7蛋白缺失(参见例如adsyn-co297)；或
包含y47h置换、c124g置换且残基2-11缺失的经修饰的e1a蛋白、e4orf1蛋白缺失和e4orf6/7蛋白缺失(参见例如adsyn-co298)。
在具体的实例中，所述重组腺病毒的基因组与seqidno:6-8、10-12、14、15、18-20、22-26、30、31和82-87中任一者至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同，或所述重组腺病毒的基因组包含seqidno:6-8、10-12、14、15、18-20、22-26、30、31、82-87和92-97中的任一者或由其中任一者组成且在正常(即，非肿瘤)细胞中相对于相同细胞类型的肿瘤细胞而言(例如，乳腺癌细胞相对于正常乳腺细胞而言)复制减少，例如通过比较正常和肿瘤细胞中的感染性颗粒数量所确定，如减少至少20％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％。
在一些实施方案中，所述重组腺病毒的基因组包含e3-ridα/ridβ和e3-14.7k编码序列的缺失。
b.肝去靶向修饰
本文中公开的所述重组腺病毒可进一步包括使病毒自肝脏去靶向的修饰。ad5六邻体可结合血液中的x因子，其可导致它被肝脏中防止全身扩散且限制炎症的kuppfer细胞吸收。为克服此问题，将重组腺病毒工程化以在e1和核心模块中包括防止在肝脏中吸收和表达的其他基因组修饰。
为了测试包括这些其他修饰的基因组模块，且为了产生ad5表达载体以供体内使用和基因递送，e1a/e1基因被缺失并以ef1α驱动的荧光素酶-gfp融合蛋白替换。当静脉内注射时，通过荧光素酶生物发光作为证据，adsyn-co199主要积聚在肝脏中(参见图22)。
为了防止肝脏中的脱靶表达，将病毒工程化以在e1a的3′utr中包括在肝脏中特异性地表达的微rna的结合位点。在特定的实施方案中，因mir122在人类和小鼠肝细胞中的表达和结合位点都是保守的，因此选择mir122作为肝特异性微rna。在一些实例中，将肝特异性mir122的两个微rna结合位点插入e1a的3′utr中以防止任何诱导病毒基因表达和细胞炎症反应的残余病毒在肝脏中摄取。与adsyn-co199相比，adsyn-co200(参见图22和下文的实施例2)不驱动肝脏中的荧光素酶表达。
为了防止病毒通过ad5六邻体结合x因子而在肝脏中被摄取和隔离，病毒通过对六邻体(e451q)中防止肝脏摄取的其他突变进行工程化。与adsyn199和adsyn200相比，adsyn-co171不在肝脏中积聚，而相反能够靶向其他器官，在该实例中，靶向脾脏和淋巴结，由于这些是不带有肿瘤的动物(图22)。
为了使在e1a、e4orf1和/或e4orf6/7中具有一种或多种突变的e2f选择性病毒能够全身递送，将重组腺病毒工程化以进一步在六邻体中包括肝脏去靶向e451q修饰(参见例如adsyn-co335和adsyn-co442；参见图20和21及实施例2)。
本文中涵盖对腺病毒六邻体基因的其他突变以防止腺病毒在肝脏中积聚。例如，可通过以来自不同血清型的高变区替换六邻体的九个高变区来使重组腺病毒自肝脏去靶向。
本文中提供重组腺病毒，其中所述重组腺病毒的基因组编码经修饰的e1a蛋白、经修饰的e4orf1蛋白或e4orf1蛋白缺失、经修饰的e4orf6/7蛋白或e4orf6/7蛋白缺失或其任意组合，且进一步编码经修饰的六邻体蛋白，其中所述重组腺病毒在正常细胞中与在肿瘤细胞中相比展现复制缺陷(参见例如adsyn-co335)。
在一些实施方案中，经修饰的六邻体蛋白包含e451q置换。在具体的实例中，所述重组腺病毒的基因组与seqidno:30、seqidno:92或seqidno:97至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同，或所述基因组包含seqidno:30、seqidno:92或seqidno:97的核苷酸序列或由seqidno:30、seqidno:92或seqidno:97的核苷酸序列组成。
本文中进一步提供重组腺病毒，其中所述重组腺病毒的基因组编码经修饰的e1a蛋白、经修饰的e4orf1蛋白或e4orf1蛋白缺失、经修饰的e4orf6/7蛋白或e4orf6/7蛋白缺失或其任意组合，且进一步包含一个或多个用于肝特异性微rna的结合位点，其中所述重组腺病毒在正常细胞中与在肿瘤细胞中相比展现复制缺陷。
在一些实施方案中，用于肝特异性微rna的一个或多个结合位点位于e1a的3′-utr中。在一些实例中，所述肝特异性微rna是mir-122、mir-30或mir-192。
c.用于可诱导型再靶向的修饰
本文中公开的所述重组腺病毒可经进一步修饰以用于体内可诱导型再靶向肿瘤细胞受体。普遍使用的ad2/5载体取决于用于感染的柯萨奇腺病毒受体(car)，其存在于上皮细胞上，但在大多数转移性癌症上不存在。“rapad”使得腺病毒感染能够通过融合蛋白，经雷帕霉素/雷帕霉素类似物可诱导地靶向任何肿瘤细胞受体(或任何细胞类型)(参见pct公布no.wo2013/138505，其以引用的方式全文纳入本文)。使用柔性衔接子系统不妨碍病毒衣壳的组装。理想的再靶向融合蛋白是对特异性癌症细胞表面分子具有强亲和力的抗体。骆驼科动物和鲨鱼编码通过单一10kda可变vhh域识别其表位的单域抗体(sdab)。使用合成生物学，可产生识别特定分子(如egfr和ceacam5，其在肺癌中高度上调)的vhh。已证实，雷帕霉素将合成性腺病毒感染再靶向其中car下调的转移性肿瘤细胞上的egfr。
也可以由生物学上正交的雷帕霉素类似物ap21967来靶向工程化的腺病毒。尽管雷帕霉素是与溶瘤腺病毒治疗的合理组合，但仍可存在希望避免雷帕霉素的细胞和生物体作用的情况。因此，作为用于再靶向腺病毒的另一种选择，可使用雷帕霉素结构同系物ap21967。ap21967能够与fkbp和突变frb*结构域(mtor突变t2098l)形成稳定的异质二聚体，但与野生型frb结构域无法形成。与雷帕霉素相比，如由p70s6激酶磷酸化(一种标准的下游底物)所证实，ap21967不使mtor信号转导失活。然而，ap21967仍能够诱导表达frb*-纤维(但并非frb-纤维)的病毒通过fkbp-vhh融合蛋白再靶向至肿瘤细胞(图18)。
当egfr-靶向的腺病毒用突变体frb结构域(frb*)修饰时，其可被雷帕霉素和ap21967诱导通过egfr感染细胞(参见图18-21和下文的实施例2)。
本文中提供重组腺病毒，其中所述重组腺病毒的基因组编码经修饰的e1a蛋白、经修饰的e4orf1蛋白或e4orf1蛋白缺失、经修饰的e4orf6/7蛋白或e4orf6/7蛋白缺失或其任意组合，且进一步编码与fkbp蛋白融合的靶向配体，以及与野生型frb蛋白或包含t2098l置换的突变frb蛋白融合的腺病毒纤维蛋白。
在一些实施方案中，所述靶向配体是单域抗体，如骆驼科vhh抗体。在一些具体的实例中，单域抗体对egfr或在肿瘤细胞上上调的另一种分子具有特异性。在一些非限制性实例中，所述重组腺病毒的基因组与seqidno:25、seqidno:26或seqidno:88至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同，或包含seqidno:25、seqidno:26或seqidno:88的核苷酸序列或由seqidno:25、seqidno:26或seqidno:88的核苷酸序列组成(参见例如adsyn-co312、adsyn-co313和adsyn-co205)。
在一些实施方案中，通过e3-ridα/ridβ和e3-14.7k编码序列缺失使fkbp-靶向配体融合蛋白容纳在所述腺病毒基因组中。然而，涵盖腺病毒基因组中的可替代的位置。例如，靶向配体-fkbp融合蛋白也可以作为e3-adp的n末端融合插入，具有自切割的p2a接头序列(参见例如adsyn-co440；seqidno:68)或作为e1b-55k的c末端融合插入，具有自切割的p2a序列。
进一步提供重组腺病毒，其中所述重组腺病毒的基因组编码经修饰的e1a蛋白、经修饰的e4orf1蛋白或e4orf1蛋白缺失、经修饰的e4orf6/7蛋白或e4orf6/7蛋白缺失或其任意组合，且进一步编码与包含t2098l置换的突变frb蛋白融合的腺病毒纤维蛋白。在一些实例中，所述基因组进一步编码包含e451q置换的经修饰的六邻体蛋白。在具体的实例中，所述重组腺病毒的基因组与seqidno:31至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同，或包含seqidno:31的核苷酸序列或由seqidno:31的核苷酸序列组成(参见例如adsyn-co336)。
上文所述的可诱导型再靶向重组腺病毒可进一步包括肝脏再靶向修饰，如突变六邻体蛋白(例如，e451q置换)。或者或另外，所述重组腺病毒的基因组可包括一个或多个肝特异性微rna的结合位点(如上文所述)。
d.用于再靶向的嵌合纤维蛋白
尽管已展示ad5和许多其他血清型的纤维蛋白结合柯萨奇腺病毒受体(car)用于细胞附着，但已展示其他血清型使用cd46、桥粒芯蛋白2(desmoglein2)、唾液酸或其他。因此，本文中提供具有编码嵌合纤维蛋白的基因组的重组腺病毒，从而将所述重组病毒靶向至不同的细胞受体(参见图23a-23e和下文的实施例3)。
本文中提供重组腺病毒，其中所述重组腺病毒的基因组编码经修饰的e1a蛋白、经修饰的e4orf1蛋白或e4orf1蛋白缺失、经修饰的e4orf6/7蛋白或e4orf6/7蛋白缺失或其任意组合，且进一步编码嵌合纤维蛋白。
在一些实施方案中，所述嵌合纤维蛋白包含来自第一腺病毒血清型的纤维轴和来自第二腺病毒血清型的纤维结节。在一些实例中，所述第一腺病毒血清型为ad5且所述第二腺病毒血清型为ad3、ad9、ad11、ad12、ad34或ad37。在一个非限制性实例中，所述第一腺病毒血清型为ad5且所述第二腺病毒血清型为ad34。
在一些具体的实例中，所述重组腺病毒的基因组包含seqidno:82、seqidno:83或seqidno:84的核苷酸序列。
表达嵌合纤维的所述重组溶瘤腺病毒可进一步包含如上文论述的可诱导型靶向和/或肝脏再靶向修饰。
e.用于逃避中和抗体的衣壳交换
本公开内容进一步涵盖利用天然的腺病毒模块性来产生能够逃避已有的中和抗体的嵌合病毒。尤其，本文中公开具有完整“衣壳”模块交换(几乎为基因组的60％)的基于ad5的病毒，这使其对于已有的抗体“不可见”且使得可重复接种。实施例4中进一步描述衣壳交换重组腺病毒(还参见图24-26)。
本文中提供重组腺病毒，其中所述重组腺病毒的基因组编码经修饰的e1a蛋白、经修饰的e4orf1蛋白或e4orf1蛋白缺失、经修饰的e4orf6/7蛋白或e4orf6/7蛋白缺失或其任意组合，且其中所述重组腺病毒的基因组编码衣壳交换嵌合腺病毒。在一些实施方案中，基因组的e1、e3和e4区域来源于第一腺病毒血清型，且基因组的e2b、l1、l2、l3、e2a和l4区域来源于第二腺病毒血清型。在一些实例中，所述第一腺病毒血清型的e1区域经修饰来编码来自所述第二腺病毒血清型的pix蛋白；和/或所述第一腺病毒血清型的e3区域经修饰来编码来自所述第二腺病毒血清型的u外显子和纤维蛋白。在一些具体的实例中，所述第一腺病毒血清型为ad5，且所述第二腺病毒血清型为ad3、ad9、ad11、ad34或ad37。
在一些具体的实例中，所述重组腺病毒的基因组包含seqidno:85或seqidno:92-97中任一者的核苷酸序列。
所述重组溶瘤衣壳交换腺病毒可进一步包含如上文所述的嵌合纤维、可诱导型靶向和/或肝脏再靶向修饰。
f.其他修饰
本文中公开的重组腺病毒也可以包括其他修饰，如用于增强肿瘤选择性、将感染导向特定的细胞类型和逃避已有的中和抗体。
在一个实施方案中，所述重组腺病毒为具有e1、e3和e4突变的egfr靶向溶瘤腺病毒以及在整合素-结合rgd基序突变为rge的衣壳蛋白五邻体(例如，adsyn-co511；seqidno:86)。已展示这种五邻体突变减少病毒在脾脏中的摄入且减弱抗病毒炎症反应。
在另一个实施方案中，所述重组溶瘤腺病毒包含e1和e4突变以及在纤维蛋白中插入rgd肽(例如，adsyn-co512；seqidno:87)。已展示在纤维蛋白中插入rgd使多种细胞类型的感染剧烈增加，包括血管内皮细胞。
g.重组报告腺病毒
本文中进一步提供重组报告腺病毒。在一些实施方案中，所述重组腺病毒的基因组包含e1a缺失且编码ef1α-荧光素酶(参见例如adsyn-co199、adsyn-co200和adsyn-co171)。
在一些实施方案中，所述重组腺病毒的基因组进一步包含一个或多个肝特异性微rna的结合位点，和/或编码经修饰的六邻体蛋白。在一些实例中，该一个或多个肝特异性微rna的结合位点位于e1a的3′-utr中。在一些具体的非限制性实例中，肝特异性微rna为mir-122。在一些实例中，经修饰的六邻体蛋白包含e451q置换。
在一些具体的非限制性实例中，所述重组腺病毒的基因组与seqidno:27(adsyn-co199)、seqidno:28(adsyn-co200)或seqidno:29(adsyn-co171)的核苷酸序列至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同，或包含seqidno:27(adsyn-co199)、seqidno:28(adsyn-co200)或seqidno:29(adsyn-co171)的核苷酸序列或由seqidno:27(adsyn-co199)、seqidno:28(adsyn-co200)或seqidno:29(adsyn-co171)的核苷酸序列组成。
iv.野生型和突变体病毒序列
本公开内容进一步提供本文中公开的所述重组腺病毒的重组腺病毒基因组。尤其，提供包含与seqidno:1-31和68-98中任一者至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核苷酸序列的重组核酸分子。在一些具体的实例中，所述重组核酸包含seqidno:1-31和68-98中任一者的核苷酸序列或由seqidno:1-31和68-98中任一者的核苷酸序列组成。
还提供包含所述重组腺病毒基因组的载体。在一些实施方案中，提供包含与seqidno:1-31和68-98中任一者至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核酸分子的载体。在一些实例中，提供包含含有与seqidno:1-31和68-98中任一者的核苷酸序列或由seqidno:1-31和68-98中任一者的核苷酸序列组成的核酸分子的载体。
下文中提供由本文中公开的所述重组腺病毒表达的野生型和突变体腺病毒蛋白序列。
e1a突变体
在下文的e1a序列中，lxcxe基序由下划线表示。此基序出现在ad5e1a(seqidno:32)的氨基酸122-126处。y47h和c124g置换以加粗显示。
ad5e1a
mrhiichggviteemaaslldqlieevladnlpppshfepptlhelydldvtapedpneeavsqifpdsvmlavqegidlltfppapgspepphlsrqpeqpeqralgpvsmpnlvpevidltcheagfppsddedeegeefvldyvehpghgcrschyhrrntgdpdimcslcymrtcgmfvyspvsepepepepepeparptrrpkmapailrrptspvsrecnsstdscdsgpsntppeihpvvplcpikpvavrvggrrqaveciedllnepgqpldlsckrprp(seqidno:32)
ad5e1aδlxcxe
mrhiichggviteemaaslldqlieevladnlpppshfepptlhelydldvtapedpneeavsqifpdsvmlavqegidlltfppapgspepphlsrqpeqpeqralgpvsmpnlvpevidagfppsddedeegeefvldyvehpghgcrschyhrrntgdpdimcslcymrtcgmfvyspvsepepepepepeparptrrpkmapailrrptspvsrecnsstdscdsgpsntppeihpvvplcpikpvavrvggrrqaveciedllnepgqpldlsckrprp(seqidno:33)
ad5e1ac124g
mrhiichggviteemaaslldqlieevladnlpppshfepptlhelydldvtapedpneeavsqifpdsvmlavqegidlltfppapgspepphlsrqpeqpeqralgpvsmpnlvpevidltgheagfppsddedeegeefvldyvehpghgcrschyhrrntgdpdimcslcymrtcgmfvyspvsepepepepepeparptrrpkmapailrrptspvsrecnsstdscdsgpsntppeihpvvplcpikpvavrvggrrqaveciedllnepgqpldlsckrprp(seqidno:34)
ad5e1aδ2-11
meemaaslldqlieevladnlpppshfepptlhelydldvtapedpneeavsqifpdsvmlavqegidlltfppapgspepphlsrqpeqpeqralgpvsmpnlvpevidltcheagfppsddedeegeefvldyvehpghgcrschyhrrntgdpdimcslcymrtcgmfvyspvsepepepepepeparptrrpkmapailrrptspvsrecnsstdscdsgpsntppeihpvvplcpikpvavrvggrrqaveciedllnepgqpldlsckrprp(seqidno:35)
ad5e1ay47hc124g
mrhiichggviteemaaslldqlieevladnlpppshfepptlhelhdldvtapedpneeavsqifpdsvmlavqegidlltfppapgspepphlsrqpeqpeqralgpvsmpnlvpevidltgheagfppsddedeegeefvldyvehpghgcrschyhrrntgdpdimcslcymrtcgmfvyspvsepepepepepeparptrrpkmapailrrptspvsrecnsstdscdsgpsntppeihpvvplcpikpvavrvggrrqaveciedllnepgqpldlsckrprp(seqidno:36)
ad5e1aδ2-11y47hc124g
meemaaslldqlieevladnlpppshfepptlhelhdldvtapedpneeavsqifpdsvmlavqegidlltfppapgspepphlsrqpeqpeqralgpvsmpnlvpevidltgheagfppsddedeegeefvldyvehpghgcrschyhrrntgdpdimcslcymrtcgmfvyspvsepepepepepeparptrrpkmapailrrptspvsrecnsstdscdsgpsntppeihpvvplcpikpvavrvggrrqaveciedllnepgqpldlsckrprp(seqidno:37)
ad5e4orf1和e4orf6/7
位于ad5e4orf1的c末端的pdz-结合基序(seqidno:38的残基126-128)加下划线。
ad5e4orf1
maaavealyvvleregailprqegfsgvyvffspinfvippmgavmlslrlrvcippgyfgrflaltdvnqpdvftesyimtpdmteelsvvlfnhgdqffyghagmavvrlmlirvvfpvvrqasnv(seqidno:38)
ad5e4orf1δpdzb
maaavealyvvleregailprqegfsgvyvffspinfvippmgavmlslrlrvcippgyfgrflaltdvnqpdvftesyimtpdmteelsvvlfnhgdqffyghagmavvrlmlirvvfpvvrqa(seqidno:39)
ad5e4orf6/7
mttsgvpfgmtlrptrsrlsrrtpysrdrlppfetetratiledhpllpecntltmhnawtspsppvkqpqvgqqpvaqqldsdmnlselpgefinitderlarqetvwnitpknmsvthdmmlfkasrgertvysvcwegggrlntrvl(seqidno:40)
本文涵盖具有编码经修饰的e4orf6/7蛋白的基因组的重组腺病毒，该经修饰的e4orf6/7蛋白消除或损伤与e2f的结合，或缺失或损伤核定位信号。在一些实例中，经修饰的e4orf6/7蛋白包含在c末端约60个、约50个、约40个、约30个、约20个或约10个氨基酸缺失以缺失/损伤e2f结合位点。在其他实例中，所述e4orf6/7蛋白在c末端包含缺失、移码或插入10个氨基酸，或在c末端三分之一处缺失33个氨基酸以破坏或损伤e2f结合。在一些实施方案中，突变包含损伤e2f相互作用的氨基酸81-91。
在其他实例中，经修饰的e4orf6/7蛋白包含n末端缺失58个氨基酸以破坏所述核定位序列，所述核定位序列为e2f4的有效易位所需要的。有八个精氨酸残基位于ad2和ad5e4orf6/7的氨基酸13和38之间，这等同于此区域的精氨酸含量大于25％。在其他腺病毒血清型中保持精氨酸残基总体聚集在e4orf6的n-末端。涵盖将精氨酸残基16、18、21、22、27和/或29置换为丙氨酸(或其他适当的残基以破坏此区的核定位)的突变。
在其他实例中，所述经修饰的e4orf6/7蛋白包含一种或多种修饰以消除或抑制e4orf6/7诱发e2f双位点占用的能力。具体的非限制性实例包括f125突变为脯氨酸、丙氨酸、赖氨酸、天冬氨酸或谷氨酸；或d121突变为p、a、k、r、g、f。
其他e4orf6/7突变包括：防止e2f单一位点占用的t133a、r101a、q105p或任何突变；中断α螺旋且防止e2f结合的m84n或p、g、k、l、h和/或e93a或k、p、g、r、l、m。涵盖的其他突变包括t133q或a、k、g、p、l、h；g141l、p、kh、f、a；或v149n、k、p、h、g、e、d。
纤维序列
在下文的重组纤维序列中，frb序列加下划线。frb*中存在的突变以加粗显示。
ad5纤维
mkrarpsedtfnpvypydtetgpptvpfltppfvspngfqesppgvlslrlseplvtsngmlalkmgnglsldeagnltsqnvttvspplkktksninleisapltvtsealtvaaaaplmvagntltmqsqapltvhdsklsiatqgpltvsegklalqtsgpltttdsstltitaspplttatgslgidlkepiytqngklglkygaplhvtddlntltvatgpgvtinntslqtkvtgalgfdsqgnmqlnvagglridsqnrrlildvsypfdaqnqlnlrlgqgplfinsahnldinynkglylftasnnskklevnlstakglmfdataiainagdglefgspnapntnplktkighglefdsnkamvpklgtglsfdstgaitvgnknndkltlwttpapspncrlnaekdakltlvltkcgsqilatvsvlavkgslapisgtvqsahliirfdengvllnnsfldpeywnfrngdltegtaytnavgfmpnlsaypkshgktaksnivsqvylngdktkpvtltitlngtqetgdttpsaysmsfswdwsghnyineifatssytfsyiaqe(seqidno:41)
ad5frb-纤维
mkrarpsedtfnpvypydtetgpptvpfltppfvspngfqesppgvlslrlseplvtsngmlalkmgnglsldeagnltsqnvttvspplkktksninleisapltvtsealtvaaaaplmvagntltmqsqapltvhdsklsiatqgpltvsegklalqtsgpltttdsstltitaspplttatgslgidlkepiytqngklglkygaplhvtddlntltvatgpgvtinntslqtkvtgalgfdsqgnmqlnvagglridsqnrrlildvsypfdaqnqlnlrlgqgplfinsahnldinynkglylftasnnskklevnlstakglmfdataiainagdglefgspnapntnplktkighglefdsnkamvpklgtglsfdstgaitvgnknndkltlwttpapspncrlnaekdakltlvltkcgsqilatvsvlavkgslapisgtvqsahliirfdengvllnnsfldpeywnfrngdltegtaytnavgfmpnlsaypkshgktaksnivsqvylngdktkpvtltitlngtqetgdttemwhegleeasrlyfgernvkgmfevleplhammergpqtlketsfnqaygrdlmeaqewcrkymksgnvkdltqawdlyyhvfrriskqpsaysmsfswdwsghnyineifatssytfsyiaqe(seqidno:42)
ad5frb*-纤维
mkrarpsedtfnpvypydtetgpptvpfltppfvspngfqesppgvlslrlseplvtsngmlalkmgnglsldeagnltsqnvttvspplkktksninleisapltvtsealtvaaaaplmvagntltmqsqapltvhdsklsiatqgpltvsegklalqtsgpltttdsstltitaspplttatgslgidlkepiytqngklglkygaplhvtddlntltvatgpgvtinntslqtkvtgalgfdsqgnmqlnvagglridsqnrrlildvsypfdaqnqlnlrlgqgplfinsahnldinynkglylftasnnskklevnlstakglmfdataiainagdglefgspnapntnplktkighglefdsnkamvpklgtglsfdstgaitvgnknndkltlwttpapspncrlnaekdakltlvltkcgsqilatvsvlavkgslapisgtvqsahliirfdengvllnnsfldpeywnfrngdltegtaytnavgfmpnlsaypkshgktaksnivsqvylngdktkpvtltitlngtqetgdttemwhegleeasrlyfgernvkgmfevleplhammergpqtlketsfnqaygrdlmeaqewcrkymksgnvkdllqawdlyyhvfrriskqpsaysmsfswdwsghnyineifatssytfsyiaqe(seqidno:43)
靶向配体序列
egfrvhh-gs-fkbp
mavqlvesgggsvqaggslrltcaasgrtsrsygmgwfrqapgkerefvsgiswrgdstgyadsvkgrftisrdnakntvdlqmnslrpedtaiyycaaaagstwygtlyeydywgqgtqvtvssgsgsgstgvqvetispgdgrtfpkrgqtcvvhytgmledgkkfdssrdrnkpfkfmlgkqevirgweegvaqmsvgqrakltispdyaygatghpgiipphatlvfdvellkl(seqidno:44；fkbp12序列加下划线)
六邻体序列
ad5六邻体
matpsmmpqwsymhisgqdaseylspglvqfaratetyfslnnkfrnptvapthdvttdrsqrltlrfipvdredtaysykarftlavgdnrvldmastyfdirgvldrgptfkpysgtaynalapkgapnpcewdeaataleinleeedddnedevdeqaeqqkthvfgqapysginitkegiqigvegqtpkyadktfqpepqigesqwyeteinhaagrvlkkttpmkpcygsyakptnenggqgilvkqqngklesqvemqffstteatagngdnltpkvvlysedvdietpdthisymptikegnsrelmgqqsmpnrpnyiafrdnfiglmyynstgnmgvlagqasqlnavvdlqdrntelsyqllldsigdrtryfsmwnqavdsydpdvriienhgtedelpnycfplggvintetltkvkpktgqengwekdatefsdkneirvgnnfameinlnanlwrnflysnialylpdklkyspsnvkisdnpntydymnkrvvapglvdcyinlgarwsldymdnvnpfnhhrnaglryrsmllgngryvpfhiqvpqkffaiknllllpgsytyewnfrkdvnmvlqsslgndlrvdgasikfdsiclyatffpmahntastleamlrndtndqsfndylsaanmlypipanatnvpisipsrnwaafrgwaftrlktketpslgsgydpyytysgsipyldgtfylnhtfkkvaitfdssvswpgndrlltpnefeikrsvdgegynvaqcnmtkdwflvqmlanynigyqgfyipesykdrmysffrnfqpmsrqvvddtkykdyqqvgilhqhnnsgfvgylaptmregqaypanfpypligktavdsitqkkflcdrtlwripfssnfmsmgaltdlgqnllyansahaldmtfevdpmdeptllyvlfevfdvvrvhrphrgvietvylrtpfsagnatt(seqidno:45)
ad5六邻体e451q
matpsmmpqwsymhisgqdaseylspglvqfaratetyfslnnkfrnptvapthdvttdrsqrltlrfipvdredtaysykarftlavgdnrvldmastyfdirgvldrgptfkpysgtaynalapkgapnpcewdeaataleinleeedddnedevdeqaeqqkthvfgqapysginitkegiqigvegqtpkyadktfqpepqigesqwyeteinhaagrvlkkttpmkpcygsyakptnenggqgilvkqqngklesqvemqffstteatagngdnltpkvvlysedvdietpdthisymptikegnsrelmgqqsmpnrpnyiafrdnfiglmyynstgnmgvlagqasqlnavvdlqdrntelsyqllldsigdrtryfsmwnqavdsydpdvriienhgtedelpnycfplggvintetltkvkpktgqengwekdatefsdknqirvgnnfameinlnanlwrnflysnialylpdklkyspsnvkisdnpntydymnkrvvapglvdcyinlgarwsldymdnvnpfnhhrnaglryrsmllgngryvpfhiqvpqkffaiknllllpgsytyewnfrkdvnmvlqsslgndlrvdgasikfdsiclyatffpmahntastleamlrndtndqsfndylsaanmlypipanatnvpisipsrnwaafrgwaftrlktketpslgsgydpyytysgsipyldgtfylnhtfkkvaitfdssvswpgndrlltpnefeikrsvdgegynvaqcnmtkdwflvqmlanynigyqgfyipesykdrmysffrnfqpmsrqvvddtkykdyqqvgilhqhnnsgfvgylaptmregqaypanfpypligktavdsitqkkflcdrtlwripfssnfmsmgaltdlgqnllyansahaldmtfevdpmdeptllyvlfevfdvvrvhrphrgvietvylrtpfsagnatt(seqidno:46；e451q置换以加粗下划线显示)
e3序列
ad5e3-rid
miprvfilltlvalfcacstlaavshievdcipaftvyllygfvtltlicslitvviafiqcidwvcvrfaylrhhpqyrdrtiaellril(seqidno:65)
ad5e3-rid
mkftvtflliictlsafcsptskpqrhiscrftriwnipscyneksdlseawlyaiisvmvfcstilalaiypyldigwnaidamnhptfpapamlplqqvvaggfvpanqprppsptpteisyfnltggdd(seqidno:66)
ad5e3-14.7k
mtdtldlemdgiiteqrllerrraaaeqqrmnqelqdmvnlhqckrgifclvkqakvtydsnttghrlsyklptkrqklvvmvgekpititqhsvetegcihspcqgpedlctliktlcglkdlipfn(seqidno:67)
v.药物组合物
本文中提供包含重组腺病毒(或一种或多种编码所述重组腺病毒的核酸或载体)的组合物。组合物任选地适合体外或体内配制和施用。所述组合物任选地包含一种或多种所提供的药剂和药学可接受的载体。合适的载体及其配制物记载在remington:thescienceandpracticeofpharmacy,第22版,loydv.allen等人编,pharmaceuticalpress(2012)。药学可接受的载体包括在生物学或其他方面并无不利的材料，即向对象施用所述材料并不引起不利的生物学作用或并不以有害的方式与含有其的药物组合物中的其他组分相互作用。如果向对象施用，所述载体任选地经选择以使活性成分的降解最小化且使对所述对象的不利副作用最小化。
所述重组病毒(或一种或多种编码这些所述重组腺病毒的核酸或载体)根据已知的方法来施用，如静脉内施用，例如以大丸剂的形式或经过一段时间连续输液，通过肌内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、局部、瘤内或吸入途径。所述施用可以是局部或全身性的。所述组合物可以通过数种给药途径来施用，包括局部、口服、肠胃外、静脉内、关节内、腹膜内、肌内、皮下、腔内、经皮、肝内、颅内、雾化/吸入或通过支气管镜检注入。因此，取决于期望局部或全身治疗以及待治疗的区域，以多种方式施用组合物。
在一些实施方案中，用于施用的组合物将包括溶解在药学可接受的载体(优选为含水载体)中的如本文中所述的重组腺病毒(或重组基因组)。可使用多种含水载体，例如缓冲盐水等。这些溶液都是无菌的且一般不含不期待的物质。这些组合物可以通过常规的公知的灭菌技术来灭菌。所述组合物可含有接近生理学条件所需的药学可接受的辅助物质，如ph调节剂和缓冲剂、毒性调节剂等，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。这些配制物中的活性剂浓度可广泛变化，且可根据选择的特定施用方式和对象的需要，主要基于流体体积、粘度、体重等来选择。
尤其所述重组病毒的药物配制物可以通过将具有所需纯度水平的所述重组腺病毒(或一种或多种编码所述重组腺病毒的核酸)与可选的药学可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合来制备。这类配制物可以是冻干配制物或水溶液。
可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所使用的剂量和浓度下对接受者无毒。可接受的载体、赋形剂或稳定剂可以是乙酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂(例如，抗坏血酸)防腐剂、低分子量多肽；蛋白质，如血清白蛋白或明胶，或亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyllolidone)；和氨基酸、单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂；和离子性与非离子性表面活性剂(例如，聚山梨醇酯)；成盐抗衡离子，如钠；金属络合物(例如，zn-蛋白络合物)；和/或非离子性表面活性剂。所述重组腺病毒(或一种或多种编码所述重组腺病毒的核酸)可按感染单位的任何适当浓度来配制。
适合口服施用的配制物可由以下组成：(a)液体溶液，如悬浮在稀释剂(如水、盐水或peg400)中的有效量的所述重组腺病毒；(b)胶囊、药囊或片剂，其各自含有预定量的活性成分，呈液体、固体、颗粒或明胶形式；(c)在适当液体中的悬浮液；和(d)合适的乳液。片剂形式可包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇、磷酸钙、玉米淀粉、马铃薯淀粉、微晶纤维素、明胶、胶体二氧化硅、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸和其他赋形剂、着色剂、填充剂、粘合剂、稀释剂、缓冲剂、润湿剂、防腐剂、调味剂、染料、崩解剂和药学相容的载体中的一种或多种。锭剂形式可包含香味剂中的活性成分(例如蔗糖)以及在惰性基质中包含活性成分的软锭剂，如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯乳液、凝胶等，其除了活性成分以外，还含有本领域中已知的载体。
所述重组腺病毒(或一种或多种编码所述重组腺病毒的核酸)单独或与其他合适组分组合可制成气溶胶配制物(即，其可“雾化”)以供通过吸入施用。气溶胶配制物可被放置在加压可接受的推进剂中，如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气等。
适合肠胃外施用(例如，通过关节内(在关节中)、静脉内、肌内、瘤内、真皮内、腹膜内和皮下途径)的配制物包括可含有使配制物与预期接受者的血液等张的抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和溶质的含水和不含水的等张无菌注射溶液，及可包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂的含水和不含水的无菌悬浮液。在所提供的方法中，组合物例如可通过静脉内输液、口服、局部、腹膜内、膀胱内、瘤内或囊内施用。肠胃外施用、瘤内施用和静脉内施用是优选的施用方法。化合物配制物可呈现在单位剂量或多剂量的密封容器中，如安瓿和小瓶。
注射溶液和悬浮液可由前文所述种类的无菌粉末、颗粒和片剂来制备。受腺病毒转导或感染或受核酸转染以供离体治疗的细胞也可以如上所述经静脉内或肠胃外施用。
药物制剂优选为单位剂型。以此形式，将所述制剂再分为含有适当量活性组分的单位剂量。因此，视施用方法而定，所述药物组合物可由各种单位剂型施用。例如，适合口服施用的单位剂型包括但不限于粉末、片剂、丸剂、胶囊和锭剂。
在一些实施方案中，所述组合物包括至少两种不同的重组腺病毒，如结合不同细胞受体的重组腺病毒。例如，所述组合物中的至少一种所述重组腺病毒可表达嵌合纤维蛋白。或者，所述重组腺病毒可通过编码靶向配体-fkbp融合蛋白来靶向不同的细胞受体，其中所述组合物中各病毒之间的靶向配体不同。在一些实例中，所述组合物包括两种、三种、四种、五种或六种不同的重组腺病毒。
vi.治疗方法
可施用本文公开的所述重组腺病毒组合物用于治疗性或预防性处理。尤其，提供抑制对象的肿瘤细胞活力、抑制对象的肿瘤发展、减小对象的肿瘤体积和/或治疗对象癌症的方法。所述方法包括向所述对象施用治疗有效量的重组腺病毒(或其组合物)。如通篇所述，所述腺病毒或药物组合物通过任何多种方式来施用，包括但不限于静脉内、血管内、囊内、肌内、皮下、腹膜内或口服。所述方法任选地进一步包括向所述对象施用一种或多种其他治疗剂。在一些实施方案中，所述治疗剂为化疗剂。在其他实施方案中，所述治疗剂为免疫调节剂。又在其他实施方案中，所述治疗剂为cdk抑制剂，如cdk4抑制剂。
在一些实施方案中，所述癌症或肿瘤为肺癌、前列腺、结肠直肠癌、乳腺癌、甲状腺癌、肾癌或肝癌或肿瘤，或为一种类型的白血病。在一些情况下，所述癌症是转移性的。在一些实例中，所述肿瘤为乳腺、脑垂腺、甲状腺或前列腺肿瘤；脑、肝、脑膜、骨、卵巢、子宫或子宫颈肿瘤；单核细胞或髓性白血病；腺癌、腺瘤、星形细胞瘤、膀胱肿瘤、脑瘤、伯基特淋巴瘤(burkitt’slymphoma)、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、肾癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、直肠癌、皮肤癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、软骨肉瘤、绒毛膜癌、纤维瘤、纤维肉瘤、成胶质细胞瘤、神经胶质瘤、肝癌、组织细胞瘤、成平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、淋巴瘤、脂肪肉瘤细胞、乳房肿瘤、成神经管细胞瘤、骨髓瘤、浆细胞瘤、成神经细胞瘤、神经胶质瘤、骨肉瘤、胰腺肿瘤、垂体肿瘤、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、睾丸肿瘤、胸腺瘤或威尔姆氏肿瘤。肿瘤包括原发性和转移性实体肿瘤，包括乳腺、结肠、直肠、肺、口咽、下咽部、食道、胃、胰腺、肝、胆囊和胆管、小肠、泌尿道(包括肾、膀胱和尿路上皮)、女性生殖道(包括子宫颈、子宫和卵巢以及绒毛膜癌和妊娠滋养细胞疾病)、男性生殖道(包括前列腺、精囊、睾丸和生殖细胞肿瘤)、内分泌腺(包括甲状腺、肾上腺和脑垂腺)和皮肤的癌瘤，以及血管瘤、黑素瘤、肉瘤(包括由骨和软组织引起的那些肉瘤以及卡波希氏肉瘤(kaposi'ssarcoma))和脑、神经、眼睛和脑膜的癌(包括星形细胞瘤、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、成视网膜细胞瘤、神经瘤、成神经细胞瘤、神经鞘瘤和脑膜瘤)。在一些方面，可治疗由恶性血液病(如白血病)引起的实体肿瘤(即，绿色瘤、浆细胞瘤和蕈状霉菌病的斑块和肿瘤以及皮肤t-细胞淋巴瘤/白血病)以及在淋巴瘤(霍奇金氏和非霍奇金氏淋巴瘤)的治疗中。另外，治疗可适用于预防本文所述的肿瘤转移。
在治疗应用中，向对象施用治疗有效量或剂量的重组腺病毒或其组合物。对此用途有效的量将取决于疾病的严重性和患者的总体健康状态。视患者需要和能承受的剂量和频率而定来单次或多次施用所述组合物。“患者”或“对象”包括人类和其他动物，尤其是哺乳动物。因此，所述方法适用于人类治疗和兽医应用。
具有修饰序列的腺病毒的有效量基于个人且至少部分地基于所使用的特定重组腺病毒；个体的大小、年龄、性别；及增殖细胞的大小和其他特征来确定。例如，对于治疗人类而言，使用至少103空斑形成单位(pfu)的重组病毒，如至少104、至少105、至少106、至少107、至少108、至少109、至少1010、至少1011或至少1012pfu，例如视存在的增殖细胞或新生物的类型、大小和数量而定，使用约103至1012pfu的重组病毒。所述有效量可为约1.0pfu/kg体重至约1015pfu/kg体重(例如，约102pfu/kg体重至约1013pfu/kg体重)。分单次剂量或多次剂量(例如，两次、三次、四次、六次或更多次给药)施用重组腺病毒。多次剂量可同时或连续(例如，经数天或数周时间)施用。
在一些实施方案中，提供的所述方法包括向对象施用一种或多种其他治疗剂，如抗癌剂或其他治疗性处理(如手术切除肿瘤)。示例性的抗癌剂包括但不限于化疗剂，例如有丝分裂抑制剂、烷化剂、抗代谢物、插入抗生素、生长因子抑制剂、细胞周期抑制剂、酶、拓扑异构酶抑制剂、抗存活剂、生物反应调节剂、抗激素(例如，抗雄激素)、抗血管生成剂和cdk抑制剂。其他抗癌处理包括放射疗法和特异性地靶向癌症细胞的其他抗体。
烷化剂的非限制性实例包括氮芥(nitragenmustards)(如二氯甲基二乙胺、环磷酰胺、美法仑(melphalan)、尿嘧啶氮芥或苯丁酸氮芥)、烷基磺酸酯(如白消安(busulfan))、亚硝基脲(如卡莫司汀(carmustine)、洛莫司汀(lomustine)、司莫司汀(semustine)、链脲霉素(streptozocin)或达卡巴嗪(dacarbazine))。
抗代谢物的非限制性实例包括叶酸类似物(如甲胺蝶呤(methotrexate))、嘧啶类似物(如5-fu或阿糖胞苷)和嘌呤类似物，如巯嘌呤或硫鸟嘌呤。
天然产物的非限制性实例包括长春花生物碱(如长春花碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)或长春地辛(vindesine))、表鬼臼毒素(如依托泊苷(etoposide)或替尼泊苷(teniposide))、抗生素(如放线菌素d(dactinomycin)、道诺霉素(daunorubicin)、多柔比星(doxorubicin)、博来霉素(bleomycin)、普卡霉素(plicamycin)或丝裂霉素c)和酶(如l-天冬酰胺酶)。
其他药剂的非限制性实例包括铂配位络合物(platinumcoordinationcomplexes)(如顺-二胺-二氯铂ii，也称为顺铂)、经取代的脲(如羟基脲)、甲基肼衍生物(如丙卡巴肼(procarbazine))和肾上腺皮质抑制剂(如米托坦(mitotane)和氨鲁米特(aminoglutethimide))。
激素和拮抗剂的非限制性实例包括肾上腺皮质类固醇(如强的松(prednisone))、孕酮(如己酸羟孕酮、醋酸甲羟孕酮和醋酸甲地孕酮)、雌激素(如己烯雌酚和炔雌醇)、抗雌激素(如他莫昔芬(tamoxifen))和雄激素(如丙酸睾酮和氟甲睾酮)。
最常用的化疗药物的实例包括阿霉素(adriamycin)、爱克兰(alkeran)、ara-c、bicnu、白消安、ccnu、卡铂(carboplatinum)、顺铂、环磷酰胺(cytoxan)、道诺霉素、dtic、5-fu、氟达拉滨(fludarabine)、hydrea、伊达比星(idarubicin)、异环磷酰胺(ifosfamide)、甲氨蝶呤(methotrexate)、光神霉素(mithramycin)、丝裂霉素、米托蒽醌(mitoxantrone)、氮芥、泰素(taxol)(或其他紫杉烷，如多烯紫杉醇)、长春花碱(velban)、长春新碱、vp-16，而一些更新的药物包括吉西他滨(gemcitabine)(健泽(gemzar))、赫赛汀(herceptin)、伊立替康(irinotecan)(开普拓(camptosar)，cpt-11)、克拉屈滨(leustatin)、长春瑞滨(navelbine)、利妥昔单抗(rituxan)sti-571、泰索帝(taxotere)、拓扑替康(topotecan)(hycamtin)、希罗达(xeloda)(卡培他滨(capecitabine))、泽娃灵(zevelin)和骨化三醇(calcitriol)。
可使用的免疫调节剂的非限制性实例包括as-101(任惠氏实验室，wyeth-ayerstlabs.)、溴匹立明(bropirimine)(upjohn)、γ干扰素(genentech)、gm-csf(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子；geneticsinstitute)、il-2(cetus或hoffman-laroche)、人类免疫球蛋白(cutterbiological)、imreg(来自neworleans,la.的imreg)、sk&f106528和tnf(肿瘤坏死因子；genentech)。
对于一些癌症类型的另一种常见的治疗是手术治疗，例如手术切除癌症或其一部分。治疗的另一种实例是放射治疗，例如对肿瘤位点施用放射性物质或能量(如，外射束治疗)以帮助在手术切除之前根除肿瘤或使其萎缩。
cdk(细胞周期蛋白-依赖性激酶)抑制剂是抑制cdk功能的药剂。用于所提供方法中的cdk抑制剂的非限制性实例包括ag-024322、at7519、azd5438、夫拉平度(flavopiridol)、吲地磺胺(indisulam)、p1446a-05、pd-0332991和p276-00(参见例如lapenna等人,naturereviews,8:547-566,2009)。其他cdk抑制剂包括ly2835219、帕博西尼(palbociclib)、lee011(novartis)、pan-cdk抑制剂at7519、塞利西尼(seliciclib)、cyc065、丁内酯i、己炔二醇(hymenialdisine)、su9516、cink4、pd0183812或伐卡拉星(fascaplysin)。
在一些实例中，所述cdk抑制剂是广谱抑制剂(如夫拉平度、奥罗莫星(olomoucine)、罗司维汀(roscovitine)、肯帕罗酮(kenpaullone)、sns-032、at7519、ag-024322、(s)-罗司维汀((s)-roscovitine)或r547)。在其他实例中，所述cdk抑制剂为特异性抑制剂(如伐卡拉星(fascaplysin)、利维啶(ryuvidine)、普维拉醇a(purvalanola)、nu2058、bml-259、su9516、pd0332991或p-276-00)。
药剂和剂量的选择可容易地由本领域技术人员基于治疗的给定疾病来确定。药剂或组合物的组合可同时施用(例如，以混合物的形式)、分开但同时施用(例如，通过单独的静脉置管)或相继施用(例如，首先施用一种药剂，接着施用第二种药剂)。因此，使用术语组合是指共同、同时或相继施用两种或更多种药剂或组合物。
根据本文中公开的所述方法，向所述对象施用有效量的本文提供的一种或多种所述药剂。所述有效量定义为产生所期待的生理学反应(例如，杀死癌细胞)所必需的任何量。典型以每天约0.001mg/kg至约1000mg/kg的初始剂量施用治疗剂。可使用约0.01mg/kg至约500mg/kg、或约0.1mg/kg至约200mg/kg、或约1mg/kg至约100mg/kg、或约10mg/kg至约50mg/kg的剂量范围。然而，视所述对象的需求、所治疗病况的严重性和所采用的化合物而定，所述剂量可变化。例如，可考虑在特定对象中诊断的癌症类型和阶段，凭经验确定剂量。在所提供方法的情形中，对对象施用的剂量随时间推移应足以在患者体内实现有益的治疗反应。确定特定情形的适当剂量在医师的技术范围以内。因此，可由本领域技术人员凭经验确定施用药剂的有效量和时间安排。所述剂量不应太大而导致实质上不利的副作用，如不需要的交叉反应、过敏反应等。在任何禁忌症的情形下，可由个别医生来调整剂量。文献中可见关于给定种类药物适当剂量的指导。
本文中提供一种通过使肿瘤细胞与如本文所公开的重组腺病毒或其组合物接触来抑制肿瘤细胞活力的方法。在一些实施方案中，所述方法为体外方法。在其他实施方案中，所述方法为体内方法且接触肿瘤细胞包括向具有肿瘤的对象施用所述重组腺病毒或组合物。
进一步提供一种通过向对象施用治疗有效量的本文所公开的重组腺病毒(或其组合物)来抑制所述对象的肿瘤发展或减小肿瘤体积的方法。
还提供一种通过向对象施用治疗有效量的本文所公开的重组腺病毒(或其组合物)来治疗所述对象癌症的方法。
进一步提供一种通过向对象施用(i)治疗有效量的雷帕霉素/雷帕霉素类似物可诱导型再靶向重组腺病毒；和(ii)雷帕霉素或其类似物来减小所述对象的肿瘤体积的方法。还提供一种通过向对象施用(i)治疗有效量的雷帕霉素/雷帕霉素类似物可诱导型再靶向重组腺病毒；和(ii)雷帕霉素或其类似物来治疗所述对象癌症的方法。
在一些实施方案中，以约0.1mg/kg至约2.0mg/kg的剂量施用所述雷帕霉素或雷帕霉素类似物。在其他实施方案中，以约0.1mg/kg至约0.5mg/kg的剂量施用所述雷帕霉素。在一些实例中，以约0.1mg/kg、0.5mg/kg、1.0mg/kg、1.5mg/kg或2.0mg/kg的剂量施用所述雷帕霉素。
在一些实施方案中，以约1至15mg/m2，如约3至12mg/m2或约5至10mg/m2的剂量施用所述雷帕霉素或雷帕霉素类似物。在一些实例中，以约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14或约15mg/m2的剂量施用所述雷帕霉素或雷帕霉素类似物。
在一些实施方案中，以不引起所述对象实质性免疫抑制的剂量施用所述雷帕霉素或雷帕霉素类似物。“以不引起实质性免疫抑制的剂量”施用雷帕霉素或其类似物是指对于特定对象而言小于或等于有效浓度25(ec25)的剂量。本领域技术人员能够确定不引起对象实质性免疫抑制的雷帕霉素或其类似物的剂量(参见例如schubert等人,amjtransplant4:767-773,2004)。在一些实例中，所述ec25为约1ng/ml至约15ng/ml，如约3ng/ml至约10ng/ml。在非限制性实例中，ec25为约1ng/ml、约2ng/ml、约3ng/ml、约4ng/ml、约5ng/ml、约6ng/ml、约7ng/ml、约8ng/ml、约9ng/ml、约10ng/ml、约11ng/ml、约12ng/ml、约13ng/ml、约14ng/ml或约15ng/ml。
在一些实施方案中，所述再靶向腺病毒的基因组编码与fkbp融合的靶向配体以及与野生型fkbp-雷帕霉素结合(frb)蛋白或包含t2098l置换的突变frb蛋白融合的腺病毒纤维蛋白。在一些实例中，所述靶向配体为单域抗体，如对egfr具有特异性的单域抗体。在具体的非限制性实例中，所述重组腺病毒的基因组包含adsyn-co335(seqidno:30)、adsyn-co335b-k(seqidno:92)或adsyn-co335b-tk(seqidno:97)的核苷酸序列。
在所述方法的一些实施方案中，所述肿瘤或癌症的特征在于e2f途径失调。在一些实施方案中，所述肿瘤或癌症是肺、前列腺、结肠直肠、乳腺、甲状腺、肾或肝肿瘤或癌症，或白血病。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括用另一种治疗剂来治疗所述对象，如化疗剂、免疫调节剂或cdk抑制剂，例如cdk4抑制剂。
提供以下实施例以举例说明某些具体特征和/或实施方案。这些实施例不应被解释为将本公开内容限制在所描述的具体特征或实施方案中。
实施例
实施例1：在e2f活性失调的肿瘤细胞中选择性地复制的溶瘤腺病毒
根据以引用的方式纳入本文的pct公布no.wo2012/024351中所述的方法，由下文提到的组分来制备经修饰的腺病毒。采用gatewaypdonr载体。通过pcr由人类ad5dna获得e1模块并使用slic将其插入载体pdonrp1p4中。使用pcr扩增包括attl1和attl4重组位点的pdonrp1p4载体骨架并使用slic与ad5e1模块组合。通过pcr获得e3模块以产生两侧有attb5和attb3r重组位点的产物。通过gatewaybp反应将所述产物插入pdonrp5p3r载体中。通过pcr获得e4模块以产生两侧有attb3和attb2重组位点的产物。通过gatewaybp反应将所述产物插入pdonrp3p2载体中。通过pcr扩增来自pdonrp5p2载体的attr5-ccdb-cm(r)-attr2片段并将其插入adsemblydest载体中(参见“multisite
adsemblydest载体的载体骨架由来自三种不同来源的部分组成。从质粒puc19上扩增amp(r)盒和lacz基因。将此与由作为biobricksigem2007组件分发的一部分的质粒psb3k5-i52002获得的p15a复制原点组合。将质粒维持在较低(10-12)拷贝数的p15aori对于减小e1毒性而言是必要的。最后，为了产生自切除病毒，自质粒padz5-cv5-e3+经pcr扩增酶iscei的哺乳动物表达盒。将所述盒克隆到载体骨架中以产生称为p15a-scei的载体。此为用于开始基因组组装的载体。基因模块全部由野生型ad5病毒纯化的dna或质粒pad/cmv/v5/dest(invitrogen)获得。
关于人类ad5的dest载体，通过3片段slic(3-fragmentslic)将e2和l3模块插入质粒p15a-scei中。通过pcr从质粒pdonrp5p2获得两侧有attr5和attr2位点的表达ccdb和chlor(r)的反选择标记。通过pcr从载体pdonrp1p4获得第二反选择标记。用独特限制酶切割后，通过slic将两个反向选择标记插在p15a-sceie2-l4的右侧和左侧上，工程化至e2和l4模块的末端以产生dest载体。
关于amp(r)盒:质粒puc19，p15aori:质粒psb3k5-i52002是biobricksigem2007组件分发的一部分。关于腺病毒基因模块，自ad5颗粒或质粒pad/cmv/v5/dest(invitrogen)纯化dna。donr载体pdonrp1p4、p5p2、p5p3r、p3p2自invitrogen获得。
所有pcr测定都使用phusion酶(neb)来进行。由1×hf缓冲剂、各200μm的dntp、各0.5μm引物和10ng模板进行pcr分析以由ad5获得腺病毒基因模块。对于e2-l2模块，还添加3％dmso。模板为质粒pad/pl-dest(invitrogen；对于e2-l2、l3-l4和e4模块)或ad5基因组dna(对于e1和e3模块)。pcr条件如下：
e2-l2和l3-l4：98℃30sec-10个循环98℃10sec、65℃30sec(每2个循环温度减少1℃)、72℃7min-29个循环98℃10sec、60℃30sec、72℃8min-72℃10min-4℃保持。
e3：98℃30sec-10个循环98℃10sec、70℃30sec(每个循环温度减少0.5℃)、72℃2min30sec-25个循环98℃10sec、68℃30sec、72℃2min30sec-72℃10min-4℃保持。
e4：98℃30sec-6个循环98℃10sec、63℃30sec(每个循环温度减少0.5℃)、72℃2min-29个循环98℃10sec、60℃30sec、72℃2min-72℃5min-4℃保持。
为由纯化病毒获得病毒基因组dna，向300μl含有10mmtrisph8、5mmedta、200mmnacl和0.2％sds的溶解缓冲液中添加多达100μl纯化病毒。将混合物在60℃下培育5min，接着添加5μl蛋白酶k储备液(约20mg/ml)且进一步在60℃下培育1小时。然后将样本放置在冰上5min，接着以15k×g旋转15min。除去上清液并添加等体积的异丙醇，充分混合且在4℃下以15k×g旋转15min。将颗粒物以70％乙醇洗涤且在4℃下再旋转15min。将颗粒物干燥且再悬浮以供使用。
关于slic，在以下20μl反应：50mmtrisph8、10mmmgcl2、50μg/mlbsa、200mm尿素、5mmdtt和0.5μlt4dna聚合酶中，在室温下将线性片段以核酸外切酶处理20min。通过添加1μl0.5medta终止反应，接着在75℃下培育20min。然后在一个新的管中混合等量的经t4处理的dna至体积约为20μl。对于slic合并2个片段，每次反应使用10μl。对于slic合并3个片段而言，每次反应使用7μl。通过加热至65℃持续10min，接着缓慢冷却，每5秒钟使温度降低0.5℃直至25℃来使片段退火。退火后，转化5μl反应并筛选克隆体。
关于adslicr，使用100ng经t4处理的p15a-scei(通过pcr线性化)和各300nge2和l3模块(通过pcr从其各自的入门载体获得)进行3片段slic反应。这产生载体p15a-sceie2-l4。swai切割5μgp15a-sceie2-l4并使用qiagenqiaexii凝胶纯化。通过pcr从其各自的入门载体获得e3和e4模块。以t4dna聚合酶处理每个线性化的载体(450ng)和pcr产物(200ng)且使用150-200ng载体和约100ng每种模块pcr，照常进行slic。分离阳性克隆体后，将5μg新的载体用paci切割并凝胶纯化，然后在新的slic反应中与e1pcr产物(100ng经t4处理的)合并。这完成了基因组组装，且质粒准备用于转染以重建病毒。
为了构建e1和e4突变区，在单个模块入门(entry)载体上进行操作。用引物对具有载体骨架的e1模块进行pcr扩增以产生缺少ltche序列(seqidno:32的残基122-126)的产物，然后使用slic使其环化以产生pentr-e1-e1a-δlxcxe。
或者，用引物对具有载体骨架的e1模块进行pcr扩增以产生具有e1a密码子改变的产物，y47突变为h、c124突变为g或缺失残基2-11以分别产生pentr-e1-e1a-y47h、pentr-e1-e1a-c124g或pentr-e1-e1a-δ2-11。这些产物用作进一步pcr突变的模板以产生这些突变的组合：pentr-e1-e1a-y47h-c124g和pentr-e1-e1a-y47h-c124g-δ2-11。用引物对具有载体骨架的e4模块进行pcr扩增以产生在e4orf6终止密码子下游缺少e4orf6/7-特异性外显子序列(297bp)的产物，从而产生pentr-e4-δe4orf6/7。此产物也用作用引物进行pcr的模板以产生缺少pdz-结合基序的e4orf1或缺少整个e4orf1序列的产物(分别为pentr-e4-δe4orf6/7-e4orf1δpdzb和pentr-e4-δe4orf6/7-δe4orf1)。
为了产生具有突变的完整病毒基因组，使用p15a-sceie2-l4与野生型e3模块和野生型e4或突变e4模块、然后与野生型e1或突变e1组合来进行adslicr。野生型adslicr腺病毒在下文所示的表1中指定。
表1.在e1和e4中具有修饰的腺病毒
关于病毒产生、浓缩及纯化，以感染性颗粒感染293e4细胞，且在感染后约48小时，当cpe明显时，收集细胞且以500×g离心5分钟进行分离。通过3次冻溶将细胞溶解于tmn缓冲液(10mmtrisclph7.5、1mmmgcl2、150mmnacl)中，且通过以3,000×g和3,500×g两轮离心15分钟除去细胞碎片。使用氯化铯梯度(0.5g/ml)通过以37,000×g超速离心18-24小时来产生病毒颗粒带。收集带且在4℃下在具有10％甘油的tmn中的10,000mwcoslide-a-
为评估在原代人类小气道上皮细胞(saec)感染期间的腺病毒蛋白表达，以moi30腺病毒感染12孔培养板中的静止saec，且在感染后4小时更换细胞上的培养基。在感染后24、36和48小时，将细胞以冷的pbs洗涤，收集在500μl的冷pbs中，在4℃下以5,000rpm粒化5min，快速冷冻且储存在-80℃下。将细胞颗粒物在4℃下在ripa缓冲液(100mmtrisph7.4，300mmnacl，2mmedta，2％tritonx，2％脱氧胆酸盐，2mmnaf，0.2mmnavo4，2mmdtt)中溶解1小时，包括在杯式超声发生器中进行超声处理(2×60s脉冲，以60的幅度，在4℃下)。通过在4℃下以13,000rpm离心20min来粒化细胞碎片。使用bio-rad的dctm蛋白分析确定蛋白浓度，且将样本的蛋白浓度标准化。根据制造商的实验方案，使用lifetechnologies
为进行细胞周期分析，以与用于蛋白表达相同的moi感染细胞。感染后48小时，将细胞胰蛋白酶化脱离培养板并用冷的pbs洗涤。将细胞再悬浮于500μl冷的pbs中，并用3ml冷的70％etoh/15mm甘氨酸(ph2.8)固定。将样本保持在4℃下，且在facs之前，将细胞粒化、在冷的pbs中洗涤且再悬浮于碘化丙啶(pi)/核糖核酸酶a溶液中，然后在37℃下培育1h。对于每个样本，通过facs收集至少10,000次事件(events)。
为评估来自感染的腺病毒爆发，以moi1或moi10腺病毒感染12孔培养板中的静止细胞，且在感染后4小时更换细胞上的培养基。在感染后48和72小时收集来自各孔的培养基，快速冻溶一次，且在4℃下以7,000rpm离心5min使细胞碎片粒化。测量培养基的体积，且快速冷冻并储存在-80℃下。使用具有抗-腺病毒5型一抗(ab6982，abcam)和immunopure抗兔碱性磷酸酶二抗(thermoscientific)通过基于细胞的连续稀释液感染elisa来确定培养基中的病毒相对于经效价的野生型标准物的效价。
关于细胞活力分析，将细胞接种在96孔培养板中，并在连续稀释下以moi30一式三份进行感染。在感染后7-10天当moi10感染的孔中存在完全cpe时，根据制造商的说明，使用细胞增殖试剂wst-1(roche)来测量代谢活性。
如上文论述，癌症仍然是一种需要其他治疗性治疗的问题疾病。一类治疗包括溶瘤病毒。腺病毒是被作为溶瘤病毒所采用的病毒之一。通过rb的直接突变、通过丧失cdk-抑制剂p16功能(例如，由于突变/甲基化作用)或通过扩增cdk/细胞周期蛋白，在几乎每种人类癌症中都丧失了成视网膜细胞瘤(rb)肿瘤抑制途径功能。在正常的非分裂细胞中，rb保持次磷酸化且在其靶启动子处结合至转录因子e2f，通过掩蔽e2f反式激活结构域以及招募染色质改构复合物和组蛋白修饰活性从而抑制转录。在细胞周期的g1-s转变期间，cdk使rb磷酸化，这缓解了e2f抑制作用。腺病毒表达使rb肿瘤抑制途径失活的早期病毒癌蛋白，从而迫使细胞复制且同时复制病毒基因组。腺病毒e1a部分地通过lxcxe基序来结合rb，从而使其肿瘤抑制活性失调。因此建议缺失e1a中的lxcxe基序将消除rb失活，且产生一种选择性复制的病毒(onyx-838)。然而，johnson等人(cancercell,1(4):325-337,2002)提供证据证明ade1alxcxe突变不足以防止s期进入、病毒dna复制和晚期蛋白表达，这与本文中所述的实验结果一致。即使e1突变的rb选择性是有争议的，但仍继续进行此突变以作为进入恶性大脑肿瘤的ii期临床试验的溶瘤病毒(dnx-2401)的基础。在尝试实现更高rb选择性的过程中，产生腺病毒，其以e2f启动子替换腺病毒e1和e4区域的启动子并使其与e1aδlxcxe基序组合而产生onyx-411(johnson等人,cancercell,1(4):325-337,2002；和dubensky等人,cancercell,1(4):307-309,2002)。为测试这些病毒，将肿瘤和原代人类细胞以野生型病毒、onyx-838(e1aδlxcxe)或onyx-411感染且在感染后的各个时间点收集。onyx-838在肿瘤和原代肺上皮细胞中不加选择地复制。将e1aδlxcxe与腺病毒e1a、e1b和e4区域的细胞e2f对照物组合的onyx-411证实在肿瘤细胞中相对于正常细胞而言的选择性复制(johnson等人,cancercell1(4):325-337,2002)。然而，e2f启动子导致重组以及在肿瘤细胞中有限地复制至野生型病毒水平。
如本文中所述，与通过e1a自rb抑制释放e2f无关，存在另一种ad蛋白e4orf6/7，其进一步在细胞和ad启动子处稳定e2f蛋白。e1a和e4orf6/7共同驱动e2f介导的转录，导致s期开始，同时繁殖病毒dna基因组。因此，本文中提供具有e1a修饰、e4orf1修饰和/或e4orf6/7修饰的重组腺病毒，其为对缺少功能性rb的肿瘤细胞的一种选择性溶瘤病毒疗法。具体来说，工程化e1a/e4orf1/e4orf6/7中的化合物突变来确定它们在肿瘤细胞(而非原代细胞)中是否选择性地复制。建议这些突变的组合导致一种对癌症的有效自扩增疗法。
为测试正常(非肿瘤)细胞和肿瘤细胞中的这些病毒，将细胞以空白感染或以adsyn-co102(野生型)、adsyn-co181(e1aδlxcxe/δe4orf6/7)、adsyn-co189(e1aδlxcxe)或onyx-838(e1aδcr2)感染。onyx-838也缺少e1a的cr2结构域中的δlxcxe。以moi10感染静止人类原代小气道上皮细胞(saec)(非肿瘤细胞)。在感染后期，adsyn-co102展现预期的e1a水平降低(图1a)。类似地，在受adsyn-co189或onyx-838感染的细胞中，e1a水平在感染后期降低；然而在较早的时间点，e1a的表达大于adsyn-co102-感染细胞中的e1a表达。相反，adsyn-co181在整个感染期间展现较强且持续的e1a表达，这表明无法在腺病毒生命周期中发展。以moi30感染铺满的肺腺癌(a549)细胞(肿瘤细胞)。所有感染在感染后期都导致预期的e1a水平降低，这表明典型的腺病毒生命周期发展(图1b)。
图2a(saec)和图2b(a549细胞)中展示saec或a549细胞感染突变体腺病毒后的晚期腺病毒蛋白和细胞周期蛋白表达。与野生型病毒和仅具有e1a突变的病毒相比，adsyn-co181在saec中无法活化e2f依赖性细胞周期靶、s期、细胞周期蛋白a和细胞周期蛋白b。此外，具有e4orf6/7突变的adsyn-co181和adsyn-co210在晚期蛋白表达和saec中的复制方面存在缺陷。两种这些缺陷对于adsyn-co210而言明显程度较小。与受感染的原代细胞相比，a549细胞中的晚期结构蛋白表达无明显的缺陷，且所有受感染的a549样本中仍存在细胞周期蛋白a和细胞周期蛋白b。
图3a和3b中示出了受感染的saec和a549细胞的dna复制。adsyn-co181感染展现在saec中相对于adsyn-co102强烈的dna复制缺陷，这与病毒复制减少有关。在此时间点，受adsyn-co210感染的saec中也有明显的适度缺陷。在a549细胞中，任何突变体病毒感染无明显的dna复制缺陷。
图4a-4b示出了来自受感染saec和a549细胞的腺病毒爆发。adsyn-co181和adsyn-co210感染表明saec中相对于adsyn-co102强烈的复制缺陷(图4a)。除了adsyn-co210以外，a549细胞中的病毒复制不存在缺陷(图4b)。
图5a-5b示出了受感染的saec和a549在感染7天后的细胞活力。与adsyn-co102相比，adsyn-co181展现在saec中的细胞杀死能力降低。如图5b中所示，所测试的突变体病毒的细胞杀死相对于a549细胞中的野生型病毒无缺陷。
也在正常人类星形胶质细胞(nha)(图6a-6c)、成胶质细胞瘤u87细胞(图7a-7c)、成胶质细胞瘤u118细胞(图8a-8c)和imr90细胞(图9a-9c)中测试重组病毒。在nha中，adsyn-co181不诱发细胞周期蛋白a，且证实相对于adsyn-co102延迟且减少的晚期病毒蛋白表达，这表示复制缺陷(图6a)。另外，如由感染性颗粒数量(图6b)和dna含量(图6c)所测量，adsyn-co181展现与野生型adsyn-co102相比，nha中的感染减弱。与nha细胞相比，突变体腺病毒在成胶质细胞瘤u87细胞(图7a-7c)或成胶质细胞瘤u118细胞(图8a-8c)中未展示复制缺陷。adsyn-co181在imr90细胞(图9a-9c)中展现适度的复制缺陷。
因此，上述数据表明与野生型和e1aδcr2病毒相比，e1aδcr2/δe4orf6/7以及δe4orf6/7病毒在原代细胞中复制不佳，如缺少衣壳蛋白表达所证实，无法诱发e2f靶基因(细胞周期蛋白a和b)，无法引发s期进入和病毒复制。相反，这些病毒在a549细胞和一组肿瘤细胞系中复制至野生型病毒水平。因此，本文中公开的重组腺病毒是选择性的癌症治疗剂。
更大一组包括e4orf1中的突变的突变体腺病毒的复制特异性结果(参见表1)在图10-15中示出且在图16中总结。图10是示出了受感染的原代正常人类星形胶质细胞(nha)在感染10天后的细胞活力的图表。图11是示出了受感染的静止正常小气道上皮细胞(saec-htert)在感染9天后的细胞活力的图表。图12是示出了受感染的增殖saec-htert细胞在感染9天后的细胞活力的图表。图13是示出了受感染的人类肺腺癌细胞(a549)在感染7天后的细胞活力的图表。图14是示出了受感染的人类乳腺癌细胞(mdamb231)在感染7天后的细胞活力的图表。图15是示出了受感染的成胶质细胞瘤细胞(u87)在感染7天后的细胞活力的图表。图16是示出了受感染的原代nha、saec-htert(静止)、saec-htert(增殖)、a549、mdamb231和u87细胞在感染7天后的细胞活力分析定量的热图表。另外，图17提供示出了受感染的u2os和saos2细胞的细胞活力分析定量的表格。u2os和saos2细胞都是骨癌细胞；然而，p53和rb在u2os细胞中是功能性的且在saos2细胞中突变。结果证实突变体病毒在rb缺陷型肿瘤细胞中选择性地复制。
这些数据证实，e1a、e4orf1和/或e4orf6/7的各种修饰的组合导致在具有缺陷型rb肿瘤抑制途径的癌细胞中特异性地复制的选择性溶瘤腺病毒。
实施例2：在e1、l3、e3和/或e4中具有修饰的溶瘤腺病毒
此实施例描述具有肿瘤选择性的其他重组腺病毒。示例性的重组病毒列举在表2中且这些病毒的基因组序列如seqidno:25-31所示。
表2.在e1、l3、e3和/或e4中具有修饰的腺病毒
adsyn-co312、adsyn-co313和adsyn-co335是雷帕霉素-和/或雷帕霉素类似物(ap21967)-依赖性efgr靶向病毒(参见pct公布no.wo2013/138505，为此靶向方法的描述将其以引用的方式全文纳入本文)。这些重组病毒各自包括e3-ridα/β和e3-14.7k编码序列的缺失，以及egfrvhh-fkbp融合蛋白和frb*-纤维(与突变frb融合的ad5纤维，其可结合雷帕霉素或雷帕霉素类似物)或frb-纤维(与野生型frb融合的ad5纤维，其只可结合雷帕霉素)的插入。adsyn-co442因其表达frb*-纤维而非fkbp融合蛋白而可用作实验对照病毒，fkbp融合蛋白将为雷帕霉素/雷帕霉素类似物-依赖性靶向所必须。adsyn-co335和adsyn-co442也包括六邻体蛋白中的e451q突变。此突变使重组病毒自肝脏去靶向。
图18a示出了frb结构域与雷帕霉素和fkbp12的结合界面。图18b是图表，其示出了具有frb-纤维的egfr靶向病毒(adsyn-co205；seqidno:88)在存在雷帕霉素，但无ap21967的情形下改善mdamb453乳腺癌细胞转导，而具有frb*-纤维的egfr靶向病毒(adsyn-co220；seqidno:98)在雷帕霉素或ap21967存在下改善mdamb453乳腺癌细胞转导。图18c是示出了mtor抑制剂雷帕霉素阻断其靶蛋白p70s6k磷酸化的活性的免疫印迹。雷帕霉素同系物ap21967在靶向浓度下不抑制mtor。
在hs578t转移性乳腺癌细胞中测试adsyn-co312。在感染后24、48、72和96小时，添加新鲜雷帕霉素或ap21967至50nm。通过wst-1测定定量代谢活性，且由匹配的药物处理标准化为未感染的细胞。如图18d中所示，以adsyn-co312感染导致与不存在靶向相比，接受雷帕霉素或ap21967的egfr靶向溶瘤病毒感染的细胞的细胞杀死增强。图18e中示出了受adsyn-co313感染的hs578t转移性乳腺癌细胞在感染9天后的细胞活力。细胞受adsyn-co313的连续稀释液感染。在感染后24、48、72和96小时，添加新鲜雷帕霉素至50nm。通过wst-1测定定量代谢活性，且由匹配的药物处理标准化为未感染的细胞。adsyn-co313具备e1aδlxcxe、δe4orf6/7、δe3-ridα/β、δe3-14.7k的溶瘤突变，且表达雷帕霉素依赖性egfr-靶向基因egfrvhh-fkbp和frb-纤维。与无靶向相比，接受雷帕霉素的egfr靶向溶瘤病毒感染的细胞的杀死增强。
在具有hs578t皮下异种移植物的小鼠中评估adsyn-co313。确定患有肿瘤的小鼠接受瘤内注射adsyn-co313，接着随后定期接受腹膜内注射8mg/kg雷帕霉素(n＝5)或媒介物对照物(n＝4)，或其接受瘤内媒介物对照物，接着随后接受定期腹膜内注射8mg/kg雷帕霉素(n＝5)或媒介物对照物(n＝4)。相同组中自首次感染后19天开始，每4天再重复三次感染。如图19中所示，接受egfr靶向溶瘤病毒与雷帕霉素的小鼠的肿瘤展示最佳的反应。
adsyn-co335是一种以通过六邻体e451q突变避免肝脏摄取的衣壳为特征，且可通过egfr在雷帕霉素或雷帕霉素类似物ap21967的存在下靶向感染细胞的溶瘤病毒。体外和体内测试adsyn-co335的溶瘤活性。以adsyn-co335的连续稀释液感染hs578t细胞。在感染后24、48、72和96小时，添加新鲜雷帕霉素或ap21967至50nm。通过wst-1测定定量代谢活性，且由匹配的药物处理标准化为未感染的细胞。如图20中所示，与无靶向的受感染细胞相比，接受雷帕霉素或ap21967的egfr靶向溶瘤病毒感染的细胞的杀死增强。为体内评估adsyn-co335，在小鼠中设置hs578t皮下异种移植物。具有已经建立的肿瘤的小鼠每4天接受三次瘤内注射adsyn-co335，接着随后在之后每隔一天接受腹膜内注射2或8mg/kg雷帕霉素(分别为n＝8和n＝8)或在之后每隔一天接受媒介物对照物(n＝6)；或其每4天接受三次瘤内注射adsyn-co442，接着随后在之后每隔一天接受腹膜内注射2或8mg/kg雷帕霉素(分别为n＝6和n＝6)；或其每4天接受三次瘤内注射媒介物对照物，接着随后在之后每隔一天接受腹膜内注射2或8mg/kg雷帕霉素(分别为n＝6和n＝6)。如图21a-21d中所示，接受egfr靶向溶瘤病毒与8mg/kg雷帕霉素的小鼠中的肿瘤展示最显著的反应。
adsyn-co199、adsyn-co200和adsyn-co171是e1a缺失且由ef1α启动子驱动编码荧光素酶(ef1α-荧光素酶)的重组受体病毒。adsyn-co200和adsyn-co171在e1a的3′-utr中还包括两个用于mir-122(一种肝特异性微rna)的结合位点，从而抑制肝脏中的病毒基因表达。adsyn-co171进一步编码六邻体蛋白中的肝去靶向e451q突变。
图22a-22c示出了肝脏中消除腺病毒介导的基因表达，且腺病毒感染去靶向至肝脏。在全身感染后，adsyn-co199仅在肝脏中高水平表达荧光素酶(图22a)。如图22b中所示，除了肝特异性微rnamir122消除荧光素酶表达以外，当小鼠被adsyn-co200(一种匹配adsyn-co199的病毒)全身性感染时，荧光素酶信号丢失。如图22c中所示，除了腺病毒六邻体蛋白具备使其自肝脏去靶向的突变e451q以外，当小鼠被adsyn-co171(一种匹配adsyn-co200的病毒)全身性感染时，在脾脏中可检测到荧光素酶的表达。这些数据证实使用此基因组模块修饰来防止ade1基因在肝脏中表达和在肝细胞中的明显复制。
实施例3：表达嵌合纤维蛋白的重组腺病毒
此实施例描述表达嵌合纤维蛋白来导向感染特定细胞类型的重组腺病毒。
尽管已证实ad5和许多其他血清型的纤维蛋白结合至柯萨奇腺病毒受体(car)用于细胞连接，但已证实其他血清型使用cd46、桥粒芯蛋白2、唾液酸或其他。由于adsembly/adslic(参见pct公布no.wo2012/024351，以引用的方式纳入本文)允许快速产生嵌合病毒，因此产生一组初始六种纤维嵌合病毒以检查各种血清型的交替细胞靶向能力。由于纤维蛋白c末端的球形结节一般负责受体结合，因此通过由来自ad3、ad9、ad11、ad12或ad34的纤维结节替换ad5纤维结节而产生嵌合体(图23a23c；表3)。产生的每种病毒都具有含有e1a/e1b缺失和由ef1α启动子驱动的荧光素酶-gfp融合蛋白的相同e1模块。这组被用于转导17种不同的肿瘤细胞系、原代气道细胞和h9干细胞系，且测量每种细胞类型中的荧光素酶表达(图23d)。与ad5纤维相比，当使用具有ad3、ad11或ad34的嵌合体时，几乎在所有细胞中都观察到显著较高的荧光素酶-gfp表达(图23d和23e)。相反，在用ad9或ad12纤维嵌合体转导的细胞中，荧光素酶-gfp表达几乎普遍较低。这些数据证实能够组合来自其他血清型的经修饰部分有力地用来改善基于ad5的载体并优化重组病毒以供进入特定的细胞类型。
表3.具有嵌合纤维蛋白的重组腺病毒
实施例4：衣壳交换重组腺病毒
此实施例描述模块修饰以产生衣壳交换嵌合腺病毒。此实施例中所述的重组腺病毒被设计成用来逃避现有的中和抗体。
具有完整“衣壳”模块交换(几乎为基因组的60％)的基于ad5的病毒(这使其对于人类群体中已有的抗体“不可见”且使得可重复接种adsembly/adslic)设计成利用腺病毒基因组中存在的模块性。此模块性的最强大的测试是组合一种血清型的完整模块与另一种血清型的完整模块。通过将ad5的e1、e3和e4模块与其他血清型的核模块(即，e2b、l1、l2、l3、e2a和l4；参见图24a)组合来检查这种可能性。这产生可逃避中和ad5抗体，但仍保持ad5在产生溶瘤病毒中常发生突变的充分表征的非结构基因的病毒。使用adslic产生含有带有ad5的e1、e3和e4模块的ad3、ad9、ad11、ad12、ad34或小鼠腺病毒1(mav-1)的核模块的病毒(图24b和表4)。另外，改变ad5e1模块从而以来自匹配核血清型的编码区替换ad5的pix编码区；且改变ad5e3模块从而以来自匹配核血清型的编码区替换u外显子和纤维编码区。因此，所有衣壳组分都来自一种血清型，而基因组的e1、e3和e4区域来自ad5。所产生的六种嵌合体中的四种能够在293-e4细胞中产生活的病毒。ad5与ad3、ad9、ad11或ad34之间的嵌合体全部复制，而ad5/ad12或ad5/mav-1嵌合体即使在经过进一步修饰以包括核心血清型的itr和包装序列(ψ)后仍不复制(图24b)。因此，产生这些“衣壳交换”腺病毒嵌合体的能力依赖于血清型。
表4.具有衣壳交换的重组腺病毒
随后分析活衣壳交换嵌合病毒的复制和基因表达。纯化的衣壳交换颗粒展示与具有匹配核模块的野生型腺病毒血清型相同的总蛋白含量(图25a)。通过针对ad5颗粒产生的多克隆兔抗血清，六邻体蛋白(大部分中和抗体的靶)在其他血清型或衣壳交换病毒中未被识别(图25a)。在衣壳(如v和vi)内部发现的其他结构蛋白展示一些交叉反应(图25a)。受感染细胞的蛋白质印迹法(westernblot)分析展示对于ad5/ad3、ad5/ad11和ad5/ad34嵌合体，交叉反应的晚期蛋白和100k的表达等同于a549细胞中的野生型ad3、ad11和ad34，而在u2os细胞中略微较高(图25b、25d和25e)。来源于所有病毒中的ad5的e1a的表达显著高于这三种嵌合体中的野生型ad5，可能是由于对ad5改善的细胞进入(图25b、25d和25e和图23d)。相反，ad5/ad9衣壳交换嵌合体在此moi下展示不佳的基因表达，略差于野生型ad9(对于晚期蛋白)且差于野生型ad5(对于e1a)(图25c)。
接下来测试衣壳交换嵌合病毒在含有ad5中和抗体的人类血清样本中是否可避免抗体中和。如使用wst-1细胞活力分析所量测，识别能够中和a549细胞的ad5杀死的人类血清样本。通过用ad5或衣壳交换嵌合体培育这些血清样本，抑制ad5杀死细胞，同时不影响衣壳交换病毒杀死(图26a-26c)。这些数据证实，衣壳交换嵌合病毒能够逃避在人类样本中常见的已有ad5抗体，且能够由表达ad5非结构组分和非ad5结构组分来复制。因此，可使用adsembly/adslic开发在腺病毒基因组内观察到的天然模块性以产生具有实用性质的新颖病毒。
如上文论述，相当比例的人类群体具有针对ad5的已有抗体和一些其他的常见腺病毒血清型。对16个人类血清样本的分析证实，16个样本中有9个含有针对ad5的中和抗体。因此，研发具有衣壳交换从而使得可逃避已有的中和抗体的溶瘤病毒。产生四种重组衣壳交换腺病毒，其在e1a(δlxcxe)和e4(δe4orf6/7)中包括溶瘤突变。这些突变是adsyn-co181中存在的相同溶瘤突变。adsyn-co159x(seqidno:93)、adsyn-co-167x(seqidno:94)、adsyn-co201x(seqidno:95)和adsyn-co202x(seqidno:96)含有分别来自ad11、ad9、ad3和ad34的结构蛋白。
实施例5：合并经修饰的或嵌合纤维蛋白，或衣壳突变或血清型交换的重组溶瘤腺病毒
此实施例描述具有肿瘤选择性的其他重组腺病毒，和/或表达突变体或嵌合纤维蛋白以引导感染特定的细胞类型，和/或设计成逃避现有中和抗体的衣壳-修饰或交换嵌合腺病毒。示例性的重组病毒列举在表5中且这些病毒的基因组序列由seqidno:82-87所示。
表5.合并经修饰的或嵌合纤维蛋白，或衣壳突变或血清型交换的重组溶瘤腺病毒
本文中公开的重组腺病毒(参见表1-4)每个具有可有利于引导感染特定细胞类型且逃避现有中和抗体的修饰。实施例1中所述的e1和e4突变可与其他模块组合来增强溶瘤病毒疗法的功效。
具有e1、核和e4突变以及嵌合纤维的重组溶瘤腺病毒的实例为adsyn-co507、adsyn-co508和adsyn-co509，其分别使用ad34、ad11和ad37纤维蛋白的结节结构域。
具有e1和e4突变以及ad34衣壳交换的重组溶瘤腺病毒的一种实例为adsyn-co510。
具有e1、e3和e4突变以及在整合素-结合rgd基序中突变为rge的衣壳蛋白五邻体的雷帕霉素/雷帕霉素类似物诱导型egfr靶向溶瘤腺病毒的一种实例为adsyn-co511。此五邻体突变已被证实减少病毒在脾脏中的摄入且减弱抗病毒炎症反应。
具有e1和e4突变以及在纤维蛋白中插入有rgd肽的重组溶瘤腺病毒的一种实例为adsyn-co512。纤维蛋白中掺入rgd已被证实剧烈增加对更多种细胞类型的感染，包括血管内皮细胞。
实施例6：来源于ad5和其他腺病毒血清型的溶瘤腺病毒
使用ad5载体研发本文中公开的溶瘤腺病毒(参见表1-5)。然而，对于腺病毒复制重要的许多基因组区域(和由这些区域编码的蛋白)在腺病毒血清型之间是高度保守的。因此，本文中公开的重组腺病毒可使用来自任何所需的腺病毒血清型的基因组序列产生。尤其说来，e1a和e4orf6/7蛋白在所有人类物种的腺病毒之间是保守的。图27示出了来自物种a(ad12)、物种b(ad7)、物种c(ad2和ad5)、物种d(ad9)、物种e(ad4)、物种f(ad40)和物种g(ad52)腺病毒的e1a蛋白的比对。类似地，图28示出了来自物种a(ad12)、物种b(ad7)、物种c(ad2和ad5)、物种d(ad9)、物种e(ad4)和物种g(ad52)腺病毒的e4orf6/7蛋白的比对。使用图27和28中示出的序列或在公共数据库可得的任何其他腺病毒序列，人们可以容易地使用来自任何腺病毒血清型的e1a和/或e4orf6/7序列来产生溶瘤腺病毒。
实施例7：表征具有egfr-靶向组分的重组腺病毒
此实施例描述一种靶向表达egfr的细胞的合成性腺病毒且证实由于修饰，所述重组病毒在293-e4细胞中无复制损伤。在此研究中产生且使用以下合成性腺病毒：
adsyn-co170(seqidno:91)
使用“adsembly”(一种多位点
adsyn-co205(seqidno:88)
通过adsembly产生对应于adsyn-co170的重组腺病毒，但具有其他特征使得可雷帕霉素-依赖性地靶向以感染表达egfr的细胞。将编码来自mtor的frb结构域的序列插入腺病毒纤维的结节结构域中的hi环中。e3-ridα、e3-ridβ和e3-14.7k基因被缺失且以编码与fkbp12融合的egfr-结合单域抗体(egfrvhh)的基因替换。在雷帕霉素存在下，可溶性egfrvhh-fkbp融合蛋白与纤维中的frb结构域形成异质二聚体，且使得成熟的腺病毒颗粒可结合到新细胞上的egfr并通过此新受体感染。
adsyn-co206(seqidno:89)
此重组腺病毒与adsyn-co205相同，除了其具有野生型纤维且因此缺少frb结构域以外。如关于adsyn-co205所述，此病毒的特征在于e3-ridα、e3-ridβ和e3-14.7k基因被缺失且以编码与fkbp12融合的egfr-结合单域抗体(egfrvhh)的基因替换。
adsyn-co207(seqidno:90)
除了其具有野生型e3区，且因此缺少egfrvhh-fkbp融合以外，此重组腺病毒与adsyn-co205相同。如关于adsyn-co205所述，其特征在于纤维中插入有frb。
adsyn-co220(seqidno:98)
除了其在frb结构域中具有t2098l突变(frb*)以外，此重组腺病毒与adsyn-co205相同，，这使得可用雷帕霉素或ap21967来进行egfr-靶向。
雷帕霉素控制的egfr靶向病毒adsyn-co205含有与e1a融合的gfp受体作为感染的标记。e3b转录体通过缺失ridα、ridβ和14.7k被修饰，且用于表达egfrvhh-fkbp。adsyn-co206具有adsyn-co205的所有修饰，但保留野生型纤维，且因此不具有frb结构域。adsyn-co207具有adsyn-co206的所有修饰，但保留野生型e3区，且因此不具有fkbp-融合基因。
为评估重组病毒对ad5晚期蛋白的表达，以10的moi，以“野生型”对照病毒adsyn-co170、雷帕霉素-依赖性egfr-靶向修饰病毒adsyn-co205或对照病毒adsyn-co206或adsyn-co207来感染293-e4细胞。图29示出了来自受感染的293-e4细胞的裂解物的蛋白表达的免疫印迹。纤维的迁移变化示出了在adsyn-co207和adsyn-co205中插入的90个氨基酸frb结构域。通过探测fkbp12检测egfrvhh-fkbp融合蛋白的表达。晚期蛋白表达的时间进程显示与adsembly野生型adsyn-co170相比，衣壳突变体或表达egfrvhh-fkbp的具有gfp-e1a报告体的病毒复制无显著缺陷。
实施例8：雷帕霉素可诱导型egfr-靶向的adsyn-co335增加小鼠中hs578t异种移植物的溶瘤疗法的功效
此实施例描述以下发现：雷帕霉素-依赖性egfr再靶向的重组腺病毒显著减小表达egfr的肿瘤异种移植物的肿瘤体积。
小鼠和肿瘤
如供应商所推荐，培养hs578t(atcc-htb-126；americantypeculturecollection,manassas,ca)乳腺癌细胞。将雌性的5周大无胸腺小鼠(j:nu#007850；thejacksonlaboratory,barharbor,me)按批准的实验方案圈养。通过在麻醉(异氟烷)下向左右侧腹皮下注射hs578t细胞(5e6细胞，悬浮在0.2ml的bd基质胶(matrigelmatrix)中；bdbiosciences,bedford,ma)来开始异种移植。
每周测量两个垂直的肿瘤直径(l和w)来追踪肿瘤发展。通过使用经修改的椭球公式来计算肿瘤体积，其中体积＝1/2(l*w2)(euhus等人,jsurgoncol31(4):229-2341986；tomayko等人,cancerchemotherpharmacol24(3):148-154,1989)。
移植后两个月，此研究中包括48只小鼠，其具有86个肿瘤，体积270±17mm3(平均值±sem)，且随机分为具有相似平均尺寸肿瘤的处理组(n＝6至8)。并非所有注射hs578t都成功地建立肿瘤。在第0天、第3天和第6天，对小鼠瘤内注射2×108pfu的稀释在50μlpbs中的腺病毒。adsyn-co335是表达具有插入frb序列的纤维蛋白且表达与识别egfr的纳米抗体(egfrvhh)融合的fkbp的溶瘤腺病毒。adsyn-co442具有adsyn-co335的所有特征，但不表达egfrvhh。在第1天、第4天、第7天且之后每隔一天，通过腹膜内注射以2或8mg/kg的剂量施用在100μl5％tween80/5％peg400中稀释的雷帕霉素(lotasc-127；lclaboratories,woburn,ma)。对于毒性监控体重，盲选处理组测量肿瘤大小。如果肿瘤在任何维度上大于20mm或显示出显著肿瘤负荷的其他迹象，即处死小鼠。
统计学分析
使用r统计学软件3.2.0(therfoundation,vienna,austria)，根据statisticalmethods的nist/sematech电子手册的指导来进行统计学分析。假定通过q-q图表直观确认的正常分布，使用具有95％置信区间的极端学生化偏离程序(extremestudentizeddeviateprocedure)来识别异常值。使用方差分析(anova)来测试在每个时间点收集数据的各处理组的平均肿瘤体积之间的显著差异。
结果
为测试通过egfr靶向递送腺病毒后代在体内治疗肿瘤的功效，在nu/nu小鼠的两侧腹上建立皮下hs578t异种移植物。当肿瘤达到264±16mm3(平均值±sem)时，将小鼠随机分成具有相似平均尺寸肿瘤的处理组。小鼠接受瘤内注射模拟物(仅媒介物)、adsyn-co335或adsyn-co442。adsyn-co442是具有adsyn-co335的特征，但不表达egfrvhh-fkbp的一种对照病毒。雷帕霉素(rap)在治疗过程期间每隔一天共同施用以激活病毒后代的egfr可靶向。结果在图30中示出。
通过空白处理(n＝8种肿瘤)且无雷帕霉素，肿瘤不受约束地生长，在空白处理开始后第28天，平均肿瘤体积为1300±448mm3，此后因肿瘤尺寸大而处死小鼠。为了比较，下文所述的数据来自处理中的此时间点。
首先测试以8mg/kg的剂量的雷帕霉素每隔一天与腺病毒组合施用，但高的雷帕霉素浓度掩盖了病毒感染的作用。与无处理相比(p＝4.50×10-2)，仅8mg/kg的雷帕霉素施用(无病毒感染)即足以减缓肿瘤生长，导致平均肿瘤体积为229±49mm3。仅施用2mg/kg雷帕霉素(n＝8)不足以阻断肿瘤生长(p＝0.144)。
与无处理相比，仅溶瘤adsyn-co335(n＝11)无法显著影响肿瘤生长的速率，导致平均肿瘤体积为948±207mm3。这可能是由于未经靶向的adsyn-co335后代对hs578t感染的限制。当adsyn-co335和2mg/kg雷帕霉素共同施用时(n＝11)，与仅有病毒(p＝8.54×10-4)或仅有2mg/kg雷帕霉素(p＝1.49×10-2)处理相比，肿瘤体积剧烈且显著减小，导致平均肿瘤体积减小为133±22mm3。这些数据表明，此肿瘤体积减小取决于雷帕霉素诱导的egfr-靶向的病毒后代，因为以2mg/kg雷帕霉素和对照病毒adsyn-co442处理(n＝9)导致平均肿瘤体积为401±89mm3，其与仅有2mg/kg雷帕霉素处理相比，平均肿瘤体积不具有显著(p＝0.449)差异，且与共同施用2mg/kg雷帕霉素和adsyn-co335相比导致显著(p＝4.92×10-3)更大的肿瘤。
早在治疗开始后14天测量2mg/kg雷帕霉素处理与共同施用2mg/kg雷帕霉素和adsyn-co335之间的显著差异(p＝2.25×10-2)。在此时间点，经雷帕霉素处理的受adsyn-co442感染的肿瘤的长势可测量地超过受adsyn-co335-感染的肿瘤(p＝1.54×10-2)。
进行研究来评估对于腺病毒再靶向而言足够的雷帕霉素剂量是否也具有免疫抑制性。通过腹膜内注射100μl媒介物、2mg/kg雷帕霉素或8mg/kg雷帕霉素来处理患有皮下hs578t异种移植物肿瘤的小鼠。注射后一小时，收集异种移植物组织，固定在10％的福尔马林中并切片以供通过识别磷-t378形式的p70s6k的抗体进行ihc染色。图31中示出了对于在苏氨酸389处磷酸化的p70s6k(p70s6kp-t389)进行染色的hs578t异种移植物组织切片的显微图像。在t389处磷酸化p70s6k是mtor活性的标志。在无处理或具有低腺病毒egfr-靶向有效剂量(2mg/kg)的组织中，如p70s6kp-t389的染色所证实，mtor活性未受到抑制。在较高的腺病毒egfr-靶向有效剂量(8mg/kg)下，mtor活性受到抑制，标志为p70s6kp-t389染色受损。这些结果证实在体内足以egfr-靶向重组腺病毒的雷帕霉素剂量不抑制mtor(且因此实质上不具有免疫抑制性)。
实施例9：具有ad34衣壳的重组溶瘤腺病毒
adsyn-co335b-k(seqidno:92)(由adslic构建的一种腺病毒)与adsyn-co335(seqidno:30)相同，除了ad5的所有结构蛋白被ad34结构蛋白替换以外。此病毒具有与adsyn-co202相同的衣壳交换。这使得病毒可保持adsyn-co335的溶瘤选择性，但避免了ad5中和抗体。ad34纤维结节结构域已由ad5纤维结节替换，且具有编码来自插入hi环中的结节结构域中的mtor的frb结构域的序列。e3-ridα、e3-ridβ和e3-14.7k基因被缺失且以编码与fkbp12融合的egfr-结合单域抗体(egfrvhh)的基因替换。在雷帕霉素存在下，可溶性egfrvhh-fkbp融合蛋白与纤维中的frb结构域形成异质二聚体，且使得成熟的腺病毒颗粒可结合到新细胞上的egfr并通过此新受体感染。adsyn-co335b-tk(seqidno:97)是与adsyn-co335b-k相同的重组腺病毒，除了ad34纤维的轴结构域被ad5轴替换以外。
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