胶质瘤诊断标志物circ17:47618350|47619164及应用的制作方法

本发明属于生物
技术领域：
，涉及一种用于胶质瘤诊断的血清circrna标志物circ17:47618350|47619164、以及检测该标志物的试剂用于制备胶质瘤诊断制剂的应用、还有试剂盒。
背景技术：
：脑胶质瘤起源于脑部神经胶质细胞，是常见的颅内肿瘤，约占中枢神经系统肿瘤的40％～50％，其中恶性胶质瘤(世界卫生组织分类ⅲ、ⅳ级)约占所有胶质瘤的77.5％。脑胶质瘤具有“三高一低”的特点，即高发病率、术后高复发性、高病死率及治愈率低，最大的生物学特性是肿瘤细胞呈浸润性生长，手术常无法全部切除。尽管其治疗方法已经由单一的手术治疗发展到今天的手术加放化疗等综合治疗，但是在过去的几十年里脑胶质瘤患者的预后并未得到明显改善。因此，寻找脑胶质瘤早期诊断、疗效评价及判断预后的指标至关重要。环状rna(circularrna，circrna)是一种新兴的内源性非编码rna(non-codingrna，ncrna)，在最近几年逐渐受到广泛关注，是目前rna研究的热点。circrna通过外显子环化或内含子环化将3’和5’末端连接起来形成完整的环形结构，因而比线性rna更稳定，更具有保守性，可在生物体中以多种类型大量存在。越来越多的研究者发现，circrna在基因表达调控中具有重要作用，这丰富了人们对内源性非编码rna的认识，提示circrna在临床诊断和治疗方面具有广阔的前景。近年来逐渐发现外泌体中也含有大量的circrna，可能发挥重要作用。目前，由于circrna具有丰富性、稳定性、高保守性和时空特异性等特点，在肿瘤诊断标志物方面正发挥越来越大的作用。技术实现要素：本发明的第一个目的是：提供一种用于胶质瘤诊断的血清外泌体circrna标志物。主要内容包括：一种用于胶质瘤诊断的血清外泌体circrna标志物circ17:47618350|47619164，其序列如seqno:1所示。该circrna位于人类的第17号染色体上，全长264bp。本发明的第二个目的是，提供检测所述的circrna标志物在血清外泌体中表达量的试剂在制备胶质瘤诊断制剂中的应用。本发明的第三个目的是，提供一种胶质瘤诊断试剂盒，其能够测定血清外泌体中的circ17:47618350|47619164的含量。所述的胶质瘤诊断试剂盒，含有检测circ17:47618350|47619164含量的pcr引物。优选引物的序列如seqno:2和3所示。所述的胶质瘤诊断试剂盒，除circ17:47618350|47619164的引物外，还含有从血清中提取外泌体、由外泌体中提取rna并进行逆转录及荧光定量pcr的所有试剂。包括：(1)提取血清外泌体所需试剂：totalexosomeisolationreagent(fromserum)，可由invitrogen公司购得，货号4478360；(2)提取外泌体rna所需试剂：trizol试剂、三氯甲烷、异丙醇、75％乙醇、无酶水；(3)逆转录所需试剂：随机引物(randomprimer)、无酶水、5×逆转录缓冲液、三磷酸碱基脱氧核苷酸、rna酶抑制剂、mmlv逆转录酶；(4)荧光定量pcr所需试剂：circ17:47618350|47619164上下游引物、gapdh内参上下游引物、sybr染料、无酶水。本发明的有益效果在于：首次发现胶质瘤患者的血清外泌体中circ17:47618350|47619164相比正常血清外泌体对照组显著上调(p＝0.0218)。roc曲线分析显示circ17:47618350|47619164作为生物标记物对胶质瘤具有较高诊断价值(auc＝0.875，灵敏性和特异性分别为96.3％和72.7％)。通过该环状rna在胶质瘤诊断分析中的应用，可以使得胶质瘤的诊断更加方便准确，为临床医生快速准确掌握患者病情，为提高临床治疗效果奠定基础，并为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物靶标提供帮助。附图说明图1为实时荧光定量pcr分析circ17:47618350|47619164在胶质瘤血清与正常血清外泌体中的表达差异；图2为roc曲线分析血清外泌体来源的circ17:47618350|47619164对胶质瘤早期诊断的特异性，灵敏性。具体实施方式以下结合实施方式旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。一、研究对象27例胶质瘤患者的血清样本由湘雅医院提供，11例正常血清样本为同期进行社区疾病筛查的健康个体。用于研究的样本为同期收取，采样、分装、保存条件均一致。二、研究方法1.胶质瘤/正常血清外泌体中rna的抽提取血清200μl于2000g常温离心30分钟，用微量移液器抽取上层清液至新的600μl离心管，加入40μl外泌体提取试剂(totalexosomeisolationreagent(fromserum)，货号4478360，invitrogen公司)轻轻上下颠倒摇匀，4℃孵育45分钟。孵育结束后10000g常温离心10分钟，弃掉上清液，所得沉淀即为血清中的外泌体。于沉淀中加入200μltrizol(mrc公司)使沉淀重悬，将悬液移至新的1.5mltube管，补trizol至1ml。冰上裂解15min，12000rpm离心10min，上清液移至新的tube管。加氯仿200μl于tube中，用手震荡15-30s，冰上放置5min，4℃，12000rpm离心15min；小心取上层水相入新tube中，加入预冷的异丙醇0.5ml混匀，冰上静置大于20min，4℃，12000rpm离心10min；弃上清，加入75％depc水稀释的乙醇1ml混匀，4℃，7500rpm离心5min，尽量弃上清，室温干燥5-10min，加入depc水10μl溶解rna。-80℃保存，由实验员每天记录冰箱温度。2.cdna制备按照逆转录试剂盒(thermo公司)说明书进行逆转录反应。反应总体积为20μl(总rna10μl，randomprimer1μl,无酶水1μl，5×reactionbuffer4μl，ri1μl，rt1μl和10mmdntp2μl)。成分剂量/管随机逆转录引物(1μm)1μlrna样本10μl无酶水to12μl逆转录第一步条件：65℃5分钟逆转录第二步程序：25℃5分钟，42℃60分钟，70℃5分钟。3.实时荧光定量pcr采用汉恒生物科技(上海)有限公司合成的特异性引物(引物序列见seqno：2和3)进行实时定量pcr：先将逆转录产物稀释10倍，混匀。20μl反应体系如下：实时荧光定量pcr反应程序：95℃3分钟,40个循环，95℃10秒，60℃30秒。4.数据分析：采用2-δδct表示胶质瘤血清外泌体的circ17:47618350|47619164相对于正常血清外泌体的表达倍数，其中△ct＝ct样本–ct内参，δδct＝δct胶质瘤–δct正常。本实验数据采用相对定量的分析方法，gapdh作为内参基因(引物序列见seqno：4和5)，数据利用软件graphpadprism及spss17.0进行分析。三、研究结果胶质瘤患者的血清外泌体中circ17:47618350|47619164相比正常血清外泌体对照组显著上调(p＝0.0218)。具体数据如图1所示。roc曲线分析显示circ17:47618350|47619164作为生物标记物对胶质瘤具有较高诊断价值(auc＝0.875，p<0.001，灵敏性和特异性分别为96.3％和72.7％)，详细结果见图2。序列表<110>中南大学湘雅医院<120>胶质瘤诊断标志物circ17:47618350|47619164及应用<160>5<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>264<212>rna<213>智人(homosapiens)<400>1cuucauaaacaagcagauaugcaagaagagaaaaaccgaaucgaaagaguccuuggcgcu60acucuuuugccugaccugauucaaaaaguccucacguuugcacuuucagaagagguacgu120ccacaggacacuguaucgguaauugguggaguagcuggaggcagcaagcaugguaggaaa180gcugcuuggaaauucauaaaggacaacugggaagaacuuuauaaccgauaccagggagga240uucuuaauauccagacuaauaaag264<210>2<211>19<212>dna<213>未知(unknown)<400>2cagcaagcatggtaggaaa19<210>3<211>19<212>dna<213>未知(unknown)<400>3tagcgccaaggactctttc19<210>4<211>19<212>dna<213>未知(unknown)<400>4atcatcagcaatgcctcct19<210>5<211>18<212>dna<213>未知(unknown)<400>5catcacgccacagtttcc18当前第1页12