一种高产木聚糖酶的突变菌株及其应用的制作方法

本发明属于有益微生物改造筛选技术领域，具体涉及一种高产木聚糖酶的里氏木霉突变菌株及其应用。

背景技术：

木聚糖是半纤维素的主要成分，是植物细胞的主要多糖结构，占所有可再生有机碳的1/3。木聚糖通常存在于植物次生壁，大量存在于被子植物中的硬木(15-30％的细胞壁成分)、裸子植物中的软木(7-10％的细胞壁成分)以及一年生植物(<30％的细胞壁成分)。在细胞壁中，木聚糖存在于纤维素和木质素的交界处，这对于植物细胞壁的纤维聚合力及完整性十分重要。

木聚糖酶是一类可以将木聚糖降解成低聚木糖或木糖的复合酶系，主要包括内切β-l,4-d-木聚糖酶、β-d-木糖苷酶、α-l-呋喃阿拉伯糖苷酶、α-d-葡糖苷酸酶、α-d-葡萄糖醛酸苷酶、乙酰木聚糖酯酶和酚酸酯酶。不同来源的木聚糖酶在主链的聚合度，支链的数量、种类、长度及其结合位点都有所不同。降解木聚糖的过程中，外切酶与内切酶相互促进，加速了木聚糖的降解过程。

目前木聚糖酶的生产主要有3个途径：1)筛选可以分泌新型水解酶的微生物；2)通过酶工程手段改造当前的工业菌株；3)在生产过程中优化一些影响因子，如底物类型、培养条件、酶制剂的循环利用及生产流程的重新设计。

可应用于生产的可以分泌木聚糖酶的微生物主要是真菌和细菌，其中真菌主要包括曲霉、青霉等，细菌主要包括链霉菌和芽孢杆菌等。例如，青霉pol6的特色之处在于所分泌的胞外木聚糖酶的最适反应条件为酸性，可以应用较极端环境，如饲料和食品领域。米曲霉hml366所产生的木聚糖酶具有较好的热稳定性和ph耐受性，可以应用于造纸和生物能源领域。链霉菌cs624和短小芽孢杆菌ss1所分泌的木聚糖酶都可以高效酶解麦麸生成低聚木糖。异硫链霉菌lmzm以玉米芯为底物进行液体发酵，所产生的木聚糖酶用于纸浆漂白时可以提高纸张的亮度。纤维化纤维细菌ckmx1产生的木聚糖酶在ph5.0-9.0、温度50-60℃内活性稳定，可以在制浆造纸领域有广泛应用。

随着基因工程技术的不断发展，木聚糖酶基因可以在大肠杆菌、芽孢杆菌、酵母、丝状真菌表达系统中表达。例如，从嗜热裂孢菌克隆了xyna基因并在毕赤酵母x-33中表达，重组酶蛋白在ph6.0-9.0和60-80℃的环境中能维持60％的酶活性，由于其对ph和温度有较高的耐受性，使该酶具有较大的应用潜力。从芽孢杆菌中克隆到的木聚糖酶基因xyn11a，该基因编码366个氨基酸，重组蛋白酶的最适反应温度为55℃。将黑曲霉ia-001的xynb基因进行优化，并克隆到毕赤酵母gs115中，优化后的重组蛋白比野生型酶活性提高了2.8倍，重组后的蛋白可以表达更高的木聚糖酶活。

本发明通过诱变的方法筛选获得木聚糖酶酶活提高的生产菌株，以适应工业化的大规模生产，并促进木聚糖酶的进一步发展。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种里氏木霉(trichodermareesei)突变菌株及其在木聚糖酶生产中的应用。申请人通过紫外诱变的方法筛选获得的突变菌株，能大幅提高木聚糖酶的表达量，可广泛应用于木聚糖酶的生产，降低该酶的成本，有利于木聚糖酶的广泛应用。

本发明一方面提供了一种突变株里氏木霉mu17(trichodermareeseimu17)，已于2017年12月15日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno:m2017797。

本发明一方面提供了所述里氏木霉在生产木聚糖酶中的应用。

本发明还提供了一种生产木聚糖酶的方法，是以所述里氏木霉为发酵菌株。

本发明还提供了一种木聚糖酶，是由所述里氏木霉发酵获得的。

本发明以里氏木霉mu为出发菌株，通过紫外诱变方法筛选获得突变菌株里氏木霉mu17。所述突变菌株摇瓶发酵120h后，其发酵上清液中木聚糖酶酶活达到1500u/ml，较出发菌提高80％，取得了意料不到的技术效果。所述突变菌mu17和出发菌相比在菌落表型上有明显的变化，突变菌mu17的菌落明显变小，菌落直径仅为出发菌的1/2，且菌落更密实，有利于降低发酵菌液粘度，提高发酵过程中的溶氧含量，进而有利于提高生物量，增加外源蛋白的分泌表达量。本发明提供的里氏木霉突变菌株可广泛应用于木聚糖酶的发酵生产，有利于降低该酶的生产成本，促进木聚糖酶的推广与应用。

附图说明

图1为出发菌mu和突变菌mu17菌落形态比较图。

具体实施方式

本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如molecularcloning:alaboratorymanual,3nded.(sambrook,2001)和currentprotocolsinmolecularbiology(ausubel,2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，这并不意味着将本发明限定于所述的任何具体方法、实验方案和试剂，因为它们可以改变。

下面结合具体实施方式对本发明进行详细描述。

实施例1里氏木霉mu的摇瓶发酵及酶活检测

里氏木霉mu(trichodermareeseimu)株是申请人通过将里氏木霉来源的木聚糖酶基因转化入里氏木霉宿主细胞中，构建得到的的用于表达木聚糖酶的里氏木霉工程菌株。申请人一直使用该菌株进行发酵来制备木聚糖酶，但在使用过程中发现该菌株存在着产酶活力降低的问题。因此，申请人以里氏木霉mu株作为出发菌株进行诱变，筛选适应于大规模培养、产酶水平高的突变菌株。

申请人首先将里氏木霉mu接种到新鲜的pda平板(马铃薯200g/l，煮沸20-30min后过滤除渣；葡萄糖2％；琼脂粉1.5％)，30℃培养7d。

吸取5ml无菌水洗脱，获得孢子液，接种50mlmm发酵培养基(1.5％葡萄糖，4％液糖，2.5％玉米浆，0.44％(nh4)2so4，0.09％mgso4，2％kh2po4，0.04％cacl2，0.018％吐温-80，0.018％微量元素，0.018％聚丙二醇-2000)，28℃培养120小时，离心获得发酵上清液。将发酵上清液进行木聚糖酶酶活力测定。结果显示，所述发酵上清液中木聚糖酶酶活为833u/ml。

酶活测定方法

(1)木聚糖酶活单位的定义

在37℃、ph值为5.5的条件下，每分钟从浓度为5mg/ml的木聚糖溶液中释放1μmol还原糖所需要的酶量即为一个酶活力单位u。

(2)酶活测定方法

取2ml浓度为1％的木聚糖底物(ph5.5乙酸-乙酸钠缓冲液配制)，加入到比色管中，37℃平衡10min，再加入2ml经ph5.5乙酸-乙酸钠缓冲液适当稀释并经37℃平衡好的酸性木聚糖酶酶液，混匀于37℃精确保温反应30min。反应结束后，加入5mldns试剂，混匀以终止反应。然后沸水浴煮沸5min，用自来水冷却至室温，加蒸馏水定容至25ml，混匀后，以标准空白样为空白对照，在540nm处测定吸光值ae。

酶活计算公式：

xd＝[(ae－ab)×k+c0]×n×1000/(m×t)

式中：xd为稀释酶液中木聚糖酶的活力，u/ml；ae为酶反应液的吸光度；ab为酶空白液的吸光度；k为标准曲线的斜率；c0为标准曲线的截距；m为木糖的摩尔质量，150.2g/mol；t为酶解反应时间，min；n为酶液稀释倍数；1000为转化因子，1mmol＝1000μmol。

实施例2紫外诱变筛选

申请人以里氏木霉mu为出发菌株，进一步通过紫外诱变的方法筛选木聚糖酶产量提高的突变菌株。

确定致死率：将上述里氏木霉mu接种于pda平板，30℃培养7d。待菌落表面产生大量孢子时，吸取5ml无菌水洗脱，获得孢子液，离心后用无菌水重悬，用血球计数板计数。取一个90mm培养皿，加入5ml稀释好的孢子悬液(浓度约为1×10⁷个/ml)，加入转子并在磁力搅拌器上搅拌使孢子液处于均匀状态。在无菌超净工作台中，用功率为9w的紫外灯于垂直距离20cm的上方照射，分别照射30s、60s、90s、120s、150s、180s，取照射后的孢子液稀释10、100、1000倍，取100ul涂布pda平板，30℃培养2-3d后计数，以未照射的孢子液为对照，计算致死率。其中照射150s时，致死率为98％，选取该照射时间进行后续诱变实验。

诱变筛选：取一个90mm培养皿，加入5ml稀释好的孢子悬液(浓度为1×10⁷个/ml)，加入转子并在磁力搅拌器上搅拌使孢子液处于均匀状态。在无菌超净工作台中，用功率为9w的紫外灯于垂直距离25cm的上方照射，照射150s后，关闭紫外灯管，盖上培养皿上盖，黑暗静止20min。然后把经紫外照射过的孢子悬浮液稀释100倍，取200ul涂布一个pda平板，每批涂布20个pda平板，30℃培养2d。首先对pda平板上长出的菌落进行形态观察，挑选出菌落明显变小的突变菌共34株，分别接种于pda平板，30℃培养7d。每个突变菌菌落用5ml无菌水进行洗脱，获得孢子液；分别接种至50mlmm发酵培养基(1.5％葡萄糖，4％液糖，2.5％玉米浆，0.44％(nh4)2so4，0.09％mgso4，2％kh2po4，0.04％cacl2，0.018％吐温-80，0.018％微量元素，0.018％聚丙二醇-2000)，28℃培养120小时；离心获得发酵上清液。

通过对上述获得的发酵上清液进行木聚糖酶酶活力检测，申请人最终筛选出一株木聚糖酶产量最高的突变菌株，命名为里氏木霉mu17(trichodermareeseimu17)，该菌株发酵上清液中木聚糖酶酶活达到1500u/ml，较出发菌提高80％，取得了意料不到的技术效果。

所述突变菌mu17和出发菌mu相比在菌落表型上有明显的变化(如图1所示)，突变菌mu17的菌落明显变小，菌落直径仅为出发菌的1/2，且菌落更密实，有利于降低发酵菌液粘度，提高发酵过程中的溶氧含量，进而提高生物量，增加外源蛋白的分泌表达量。

申请人已于2017年12月15日将所述突变株里氏木霉mu17(trichodermareeseimu17)保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno:m2017797。