一种检测AML患者预后基因突变的试剂盒及其检测方法与流程

本发明属于生物技术检测及试剂盒领域，具体涉及一种检测aml患者预后基因突变的试剂盒及其检测方法。
背景技术：
：急性髓系白血病(acutemyeloidleukemia,aml)是一种造血系统的恶性肿瘤性疾病，以造血细胞的增殖失控，分化停滞，凋亡受阻为特征。aml所表现出的生物学特性是由本身的遗传学异常所引起和决定的，传统的细胞遗传学可以在一半以上的aml患者中发现各类异常核型，这些核型异常可以为我们提供判断患者预后的依据。但是还有接近一半的患者缺乏特征性的核型异常，因而难以对这类患者进行判断。而分子生物学技术则为我们发现微观层面的遗传学异常提供了更宽阔的视野，分子学标记的异常在白血病中也存在很大异质性，不同类型白血病基因异常位点通常有很大差异，随着aml的研究逐渐深入化，越来越多的证据显示，基因突变不仅在aml的发生中发挥极其重要的作用，同时也控制着疾病的进展与结局。因此，发现并验证一些新的生物学标记对于改善其预后具有极其重要的意义，这些分子水平改变的发现，不仅提供了解释aml发病机制的新视角，而且有助于建立新的aml危险分层体系，为临床靶向治疗提供依据。sanger测序法是目前公认的，大多数临床分子诊断项目的金标准，特异性甚至能达到100％，是分子诊断方面的经典技术平台。为了给sanger测序提供可靠的模板，首先必须针对该项目的特点，建立一个稳定可靠的pcr体系。该项目pcr部分在技术环节存在以下两个难点：1.该项目需要提取血液基因组dna，由于临床标本物流运输中存在众多不可控因素，因此临床检验中往往得不到质量优良的全血标本，因此获得的dna质量也会存在较大的样本间差异。2.由于需检测的外显子数目较多，即pcr目的片段过多，导致pcr条件不统一。技术实现要素：针对现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种检测aml患者预后基因突变的试剂盒及其检测方法，该试剂盒可用于检测nras基因、runx1基因、tp53基因和wt1基因序列的突变位点，特异性好，灵敏度高。为了实现上述目的及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：本发明的第一方面，提供一种检测aml患者预后基因突变的试剂盒，所述试剂盒包括：nras基因的pcr扩增引物、runx1基因的pcr扩增引物、tp53基因的pcr扩增引物、wt1基因的pcr扩增引物以及通用测序引物接头。优选地，所述nras基因的pcr扩增引物至少包括核苷酸序列如seqidno.1～4所示的引物。优选地，所述runx1基因的pcr扩增引物至少包括核苷酸序列如seqidno.5～22所示的引物。优选地，所述tp53基因的pcr扩增引物至少包括核苷酸序列如seqidno.23～40所示的引物。优选地，所述wt1基因的pcr扩增引物至少包括核苷酸序列如seqidno.41～44所示的引物。优选地，所述通用测序引物接头至少包括核苷酸序列如seqidno.45～46所示的引物接头。本发明的试剂盒采用pcr检测技术进行nras基因、runx1基因、tp53基因、wt1基因突变位点检测，nras基因的pcr扩增引物、runx1基因的pcr扩增引物、tp53基因的pcr扩增引物、wt1基因的pcr扩增引物以及通用测序引物接头的设计是本发明试剂盒的关键。基于本发明所述试剂盒是采用pcr检测技术来进行检测的，所以试剂盒中还可以包括其他一些pcr所需要的常规试剂，如样本基因组dna提取试剂、pcr扩增反应试剂、测序用试剂。一般地，pcr扩增反应试剂选自premixtaq、ddh2o。由于此类pcr常用试剂均可经市场途径单独购得或者自行配置，因此具体需要将哪些试剂装配入试剂盒，可以根据客户实际需要配置，为方便起见，也可全部装配入试剂盒。本发明的试剂盒，可以是含有独立包装的引物对，也可以是含有配置好的含有引物对的pcr扩增反应试剂。所述pcr扩增反应试剂可自行配置，也可直接以市售的不含引物对的通用pcr反应试剂加入引物对获得。例如，所述试剂盒中还可以含有premixtaq、ddh2o。加入本发明的引物对、待检样本基因组dna提取物即可获得pcr反应体系。优选地，所述试剂盒中还可含有阳性对照。所述阳性对照为临床上已经确诊为aml患者的基因组dna。优选地，所述试剂盒中还可含有阴性对照。所述阴性对照为正常人的样本基因组dna。本发明的第二方面，提供了前述检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：(1)提取样本基因组dna；(2)采用前述nras基因的pcr扩增引物、runx1基因的pcr扩增引物、tp53基因的pcr扩增引物、wt1基因的pcr扩增引物对样本基因组dna进行扩增；(3)对扩增产物添加前述通用测序引物接头后进行测序；(4)对测序结果进行分析。优选地，所述检查方法为非疾病诊断目的的方法。步骤(1)中，提取样品基因组dna为现有技术。本发明的第三方面，提供了前述试剂盒在制备aml患者预后基因突变检测产品中的用途。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：使用本发明试剂盒，采用测序技术，对nras基因、runx1基因、tp53基因和wt1基因突变进行检测。可以通过特异性pcr扩增引物、和带荧光标记的ddntp，检测出与aml预后相关的基因突变位点，有利于准确进行aml的危险度划分及分层治疗。附图说明图1a：runx1基因突变型的测序峰图。图1b：tp53基因突变型的测序峰图。图1c：wti基因基因突变型的测序峰图。图1d：nras基因基因突变型的测序峰图。具体实施方式nras基因ras是细胞内重要的原癌基因，ras基因是许多肿瘤细胞信号传导途径的关键，许多肿瘤细胞都有ras基因突变。aml的ras基因突变率约25％，all约6％--20％，cmml的ras突变率也很高。ras基因家族有三个结构类似的成员，即h-ras、k-ras和n-ras，其中和aml发生相关的主要是nras基因，基因全长85kb，其cdna长约2.1kb，编码含495个氨基酸的蛋白，称为p21ras，p21是一种膜结合g蛋白，参与信号传导途径。ras基因激活的方式有3种：基因点突变、基因大量表达、基因插入及转位。其中ras基因被激活是最常见的方式就是点突变，多发生在n端第12、13和61密码子，其中又以第12密码子突变最常见，而且多为ggt突变成gtt。不同突变位点对p21的活化机制不同，第12密码子突变可以减弱p21内在的gtp酶活性，并使细胞凋亡减少、细胞间接触抑制减弱；第61密码子突变可削弱gap对p21的内在gtp酶活性，并可减弱gap与p21结合的稳定性。ras蛋白在白血病的起始和发展过程中起重要的作用。成熟的ras蛋白在胞浆中合成，定位于质膜的内表面。然后被转运和修饰。其修饰发生于具有羟基末端的caax功能域，同时需要膜的协助。修饰的第一阶段是首先去除aax残基，与半胱氨酸的a羟化物接触。后者被膜甲基转移酶甲基乙酰化。然后，cys-186的巯基被法尼基化。第二阶段是位于蛋白(hras的cys-181和cys-184；nras的cys-181)的超变区的半胱氨酸棕榈酰化。然后蛋白被靶向和结合于质膜，并在那里被活化。当ras蛋白接受信号刺激或自身突变活化后主要通过刺激①增殖途径raf/mek/erk②抗凋亡途径p13k/akt两条途径上蛋白磷酸化，它们在体内发挥着一系列重要的生物学效应，一旦这两条途径因为某种原因处于持续激活状态，表现为蛋白的磷酸化，将导致多种恶性疾病(aml)的发生。runx1基因runx1(runt-relatedtranscriptionfactor1)作为重要造血相关转录因子，在造血发育的多个阶段发挥重要作用。runx1是runx家族一员，在哺乳动物发育过程中，runx家族由runx1，runx2，runx3构成，他们都含有128个氨基酸组成的保守序列构成dna结合结构域，不同成员结合相同的dna位点，但在发育过程中发挥不同的作用。以往认为涉及runx1基因白血病的主要发病机制是融合基因的形成，如t(8；21)-amll(runx1)/eto(mtg8)、t(3；21)-runxl/evll和t(12；21)-tel(etv6)/runxl。目前已发现10余种涉及runx1的染色体易位所致的融合基因，尽管每种融合基因致白血病的机制各异，但其所涉及的共同发病机制则都是抑制了野生型runxl基因的活性。然而最近的研究表明runxl基因突变也参与白血病的发生，其单等位基因的突变可造成家族性血小板异常(fpd)，进而使发生急性髓系白血病(aml)的易感性增强，称为fpd/aml。在m0中点突变主要发生在runt区，而在mds-aml中突变主要发生在c-末端。转录调控因子runx1突变在aml及mds患者发生率较高，分别为13.1％和17.5％。runx1基因编码runx1蛋白，与cbfβ相结合形成核心结合因子转录复合体，调控多个造血相关基因表达。目前累及runx1突变主要为2类：①发生在runx1n-末端(常见突变runx1d171n)，主要在rhd结构域，影响runx1与dna结合；②发生在runx1c-末端(常见突变runx1s291fs)，可增强runx1与dna结合，但影响其转录活性mll基因异常是另一种mds及mds/aml常见的遗传学改变。研究表明，mds患者疾病进展时常同时存在mll-ptd及runx1突变，且在原发和继发性aml中，同时存在突变的比例更高。该基因突变检测结合基因芯片的检测，能更好的辅助诊断aml。tp53基因/tp53基因是重要的抑癌基因之一，其编码的蛋白--肿瘤抑制蛋白p53能够使许多基因保持其稳定性，并调节细胞的生长、分化、衰老，避免疾病产生，被称为“基因守护者”。当tp53基因缺失、突变和调节紊乱时，将直接影响p53蛋白的功能和活性，从而导致很多肿瘤的发生；除此之外tp53的基因状态也成为判断淋巴瘤和血液病预后的重要指标。tp53基因通过细胞核中转录依赖的活性(ta)和细胞浆中非转录依赖的活性(tia)两种途径发挥着抑癌的作用。tp53通过转录依赖的功能调节基因的转录，影响细胞周期、dna修复、凋亡、信号传导、转录和代谢；通过非转录依赖的功能诱导凋亡和自吞噬。tp53基因的突变和调节异常会导致很多肿瘤的发生。虽然在血液病和淋巴瘤中，tp53缺失和突变的频率没有其它肿瘤高，但是tp53基因编码区的缺失、重排和突变将使得其编码的p53蛋白的表达、稳定性和活性紊乱，tp53基因的状态已成为判断血液病和淋巴瘤预后的重要指标。另一方面，克服tp53异常也成为疾病治疗的一个新靶点。tp53位于染色体的17q13.1，长19144个核苷酸，其中2586个核苷酸转录成tp53的mrna，包括第1和第2外显子的5，非转录区(utr)，第11外显子的3’非转录区(utr)和第2-11外显子的编码区(～20kb)，编码由393aa组成的p53蛋白。p53蛋白的dna结合区(dbd)是tp53基因发挥转录依赖活性和非转录依赖活性最重要的一个区域，所以tp53的突变很多都发生在编码dbd的第4～8外显子区域。tp53正常功能的丧失主要通过基因突变。突变可引起两方面的改变：(1)突变体失去与特异位点的结合能力。野生型p53以四聚体形式与特异位点结合，反式激活下游生长抑制基因的表达。在一些肿瘤中，单一或两个p53位点的丧失使形成四聚体的比例下降，无义突变造成p53翻译中断，c端酸性结构域的缺失影响四聚体形成；最常见的是错义突变后野生型与突变型形成更稳定的四聚体，减弱内源野生型p53的负调控作用，从而引起细胞恶变。(2)突变改变了p53的球形构象。例如，一些突变体可与热休克蛋白结合，一些突变引起213～217肽段的暴露，另外一些则引起酸性激活结构域的改变，这些突变均提示p53的微小改变可引起远离突变位点区段甚至整个蛋白构象的改变。基因异常不仅是aml的发病机制之一，同时也是aml患者重要的预后因素。tp53基因的改变与年龄、基因异常的复杂性、特殊染色体异常、单一核型有关，并且预示预后较差。有文献报道p53功能缺失与化疗如阿糖胞苷抵抗相关。近年来又发现tp53的改变与临床上诱导化疗抵抗密切相关。51％携带p53基因突变的ck-aml患者治疗后有复发，而未有tp53基因异常的ck-aml患者复发率仅35％。携带有tp53基因突变的ck-aml患者的中位生存时间只有4.14个月，而无tp53基因突变的ck-aml患者的中位生存时间为10.97个月。因此tp53的突变应该作为临床常规检测用以指导临床用药和提示预后。wt1基因wt1基因位于定位于11p13，编码含429个氨基酸的蛋白质。该蛋白由dna结合区的羧基端与转录活性调节区的氨基末端构成。king-underwoodl首次报道了aml存在wt1基因突变，并认为该突变与aml发生有关。随后的研究证实，目前约有10-15％的aml患者存在wt1基因突变。近年来wt1(wilms’tumorsusceptibilitygene)基因在肿瘤发生中的作用受到重视，但其确切作用及作用机制仍不清楚。wt1基因最初被当做抑癌基因发现在wilms瘤，位于11p13，是一种调控肾脏发育的转录因子。该基因在正常脑组织、胎盘、脾脏及造血组织均有表达。wt1基因可调节与生长分化有关的一些生长因子：wt1基因不是一单纯的抑癌基因，同时具有癌基因的功能。2004年hosen等报道wt1基因相关功能更倾向于一种转录激活因子，能特异识别并与靶基因dna结合，起调节转录作用。胡绍燕等利用实时定量逆转录聚合(rq-rt-pcr)反应技术检测急性髓系白血病病人骨髓细胞中wt1基因表达水平较正常人明显升高，wt1基因与急性髓系白血病的长生存及无病生存有关，提示wt1基因可能参与了急性髓系白血病的发病过程，考虑把wt1基因作为判断急性髓系白血病预后的指标及检测微小残留病的标记。wt1基因长约50kb，含10个外显子，编码区约1300bp，其5’端编码其它转录因子的调节区，3’端为锌指保守序列高度同源区。结构中较重要的是2个外显子是随机组合的剪接外显子：剪接变体i和剪接变体ⅱ。剪接变体i位于外显子5，编码17个氨基酸插入锌指结构和调控区，称为wt1+17aa/wt1-17aa；剪接变体ⅱ位于外显子9与外显子10之间，由编码3个氨基酸(赖氨酸-苏氨酸-丝氨酸)插入第3和第4锌指区之间，称为wt1+kts/wt1-kts。wt1基因功能的丧失可导致细胞过度生长增值、肿瘤发生。基因功能改变的主要机制是点突变或部分缺失。点突变是wt1功能丧失的最常见原因，主要包括移码突变、无义突变、错义突变。部分缺失是wt1失活的另一种机制。有研究证实破坏wt1蛋白功能会促进造血细胞增殖和抑制细胞分化，也有研究显示wt1突变的存在是正常核型aml患者预后不良的影响因素，已有的研究发现外显子7、8、9、10是突变的热点，hollinkih等进一步报道wt1基因突变主要集中在外显子。然而，dammf等最新报道有些wt1突变，如snprs16754可能是一个独立的判断预后的有利标记。wt1基因表达水平增高或wt1基因突变与aml患者的临床预后和治疗效果密切相关。因此，本发明提供一种检测aml患者预后基因突变的试剂盒，所述试剂盒包括nras基因的pcr扩增引物、runx1基因的pcr扩增引物、tp53基因的pcr扩增引物以及通用测序引物接头。在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本
技术领域：
技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本
技术领域：
的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。实施例1检测aml患者预后基因突变的试剂盒的制备本发明的试剂盒包括nras基因的pcr扩增引物、runx1基因的pcr扩增引物、tp53基因的pcr扩增引物、wt1基因的pcr扩增引物以及通用测序引物接头，其核苷酸序列详见下表1所示：表1实施例2检测aml患者预后基因突变的试剂盒的应用1.样本抽提操作步骤：(1)采集待测血液样本，置于1.5ml离心管中，加500μlbufferap1到所述1.5ml离心管中；(2)加200-250μl抗凝全血到bufferap1中，盖紧离心管盖子，旋涡振荡10s；(3)加100μlbufferap2，旋涡振荡10s，白色沉淀和深红色裂解液充分混匀成灰褐红色；(4)12,000×g离心10min；(5)将制备管置于2ml离心管中，将步骤(4)中的上清液加入到制备管中，12,000×g离心1min；(6)弃滤液，将制备管置回到原2ml离心管中，加700μlbufferw1a，室温放置2min12,000×g离心30s；(7)弃滤液，将制备管置回到原2ml离心管中，加800μl已加无水乙醇的bufferw2，12,000×g离心1min；(8)(可选步骤)将制备管置回到原2ml离心管中，加500μlbufferw2到制备管中，12,000×g离心1min；(9)弃滤液，将制备管置回原2ml离心管，12,000×g离心2min；(10)将制备管置于另一洁净的1.5ml离心管中，开盖室温放置1min，在制备管膜中央加80-200μlbufferte，室温静置1min。12,000×g离心1min洗脱基因组dna。由此提取获得样本基因组dna。2.实验过程(1)采用实施例1试剂盒中的nras基因的pcr扩增引物、runx1基因的pcr扩增引物、tp53基因的pcr扩增引物、wt1基因的pcr扩增引物共22对扩增引物对分别配制pcr反应试剂共22种，每对扩增引物对对应于一种pcr反应试剂，所述扩增试剂如下表2所示：表2试剂名称用量(ul)premixtaq10引物对中的上游引物(5um)1引物对中的下游引物(5um)1ddh2o6具体地，nras-2-f和nras-2-r所对应的pcr反应试剂如表3所示：表3试剂名称用量(ul)premixtaq10nras-2-f(5um)1nras-2-r(5um)1ddh2o6以此类推，其他各pcr反应试剂中，除了引物对与表3中不同以外，其他组分均相同。将上述22种pcr反应试剂分别至于对应的pcr反应管中，每个反应管中放置一种pcr反应试剂20ul，共获得22种pcr反应管。(2)将上述步骤1中获得的每一种样本基因组dna都分为22份，每份的体积为2μl，然后分别加入到22种pcr反应管中，每一种样本对应获得22个样本反应管；将同一种阳性对照(所述阳性对照为临床上已经确诊为aml患者的基因组dna)分为22份，每份的体积为2μl，然后分别加入到22种pcr反应管中，同一种阳性对照对应获得22个阳性对照反应管；将同一种阴性对照(所述阴性对照为正常人的样本基因组dna)分为22份，每份的体积为2μl，然后分别加入到22种pcr反应管中，同一种阴性对照对应获得22个阴性对照反应管；(3)将各个样本反应管、阳性对照反应管、阴性对照反应管，分别各自混匀，低速离心数秒，进行pcr扩增：含有nras基因的pcr扩增引物的反应管以及含有runx1基因的扩增引物的反应管，进行pcr扩增时，pcr反应条件，见下表4：表4含有tp53基因的pcr扩增引物的反应管以及含有wt1基因的扩增引物的反应管，进行pcr扩增时，pcr反应条件，见下表5：表53.sanger测序的具体步骤如下：3.1测序pcr：3.1.1试剂配制：按下表6进行，冰上操作，分装后保存在-20℃冰箱。bigdye体系：表6表7酶纯化体系：原料1x需要体积量(ul/管)cip0.1ul-exoi0.5ul-去离子水1.4ul-3.2pcr产物纯化3.2.1取出分装好的纯化反应液，在管壁上标好相应的编号。3.2.2取9ulpcr产物加入相应编号的管中，混匀(注意不能产生气泡)。3.2.3将混匀样品按照如下反应条件上pcr仪，进行酶纯化扩增。3.2.4纯化好的样品用于下一步测序反应，如当日不用放冷冻保存。3.3测序反应3.3.1每个样品做正反两个反应，在相应的薄壁管上写好标记。3.3.2每反应体系5ul，bigdye混合液和5p引物固定加1ul，模板一般加2ul，最大量为3ul(根据pcr产物电泳结果调整)，用水补足5ul。3.3.3先加相应量的水，然后加入相应的1ul测序引物接头(m13-f和m13-r)加到水里，再在管壁的不同地方加1ul的bigdye混合液，最后加入模板。3.3.4盖上管盖低速短暂离心，涡旋器混匀，再次低速短暂离心。3.3.5按照如下反应条件上pcr仪，进行测序反应。3.4.测序反应后乙醇纯化，上机。3.4.1将扩增完的pcr产物进行短暂离心。在每管一侧贴壁加入2ul的125mmedta，然后在管的另一侧贴壁加入15ul无水乙醇，涡旋混匀。3.4.2用板式离心机，4000rpm，离心30min，然后300rpm倒置瞬时离心，除掉上清。3.4.3加入50ul的20℃预冷75乙醇，涡旋混匀，4000rpm、4℃离心15min。3.4.4300rpm倒置瞬时离心，除掉上清，然后放置于室温，15min，挥发完乙醇。3.4.5乙醇完全挥发后，每管加入水和hi-ditm各5ul，充分涡旋振荡1min.，短暂离心后静置15min.使测序产物完全溶解。3.4.6将hi-ditm溶解产物转移至96孔板的相应位置中。放至pcr扩增仪上，95℃预变性5min.，迅速转移至冰盒上4℃冷却5min。至3500测序仪上机测序并分析。数据分析：应用sequencinganalysis软件进行序列比对分析。将测序得到的序列与ncbi中检索到的标准序列进行比对，确认样本的基因序列。4.临床标本比对：前期临床标本检测已确定突变位点的样本30例，本发明试剂盒检测结果符合率90％。溶解温度(tm)也是pcr中一个很重要的参数，对于设定pcr退火温度是必须的，合适的退火温度能够有效的减少非特异性结合，还能保证目的序列有效退火。所以在保证特异性的情况下，设计引物的tm值尽量接近，使pcr的退火温度可以保持一致，从而达到pcr条件的统一。因此，使用本发明试剂盒，采用测序技术，对nras基因、runx1基因、tp53基因和wt1基因突变进行检测。可以通过特异性pcr扩增引物、和带荧光标记的ddntp，检测出与aml预后相关的基因突变位点，有利于准确进行aml的危险度划分及分层治疗。此外，由于本发明采用了特殊的通用测序引物接头，测序引物接头不能等同于pcr扩增引物，测序引物接头要求要更严格一些，测序引物要求3，端必须要完全配对，不能含有混合碱基，而且长度20bp左右，gc含量在50％-60％之间；另外，由于需检测的外显子数目较多，即sanger测序时所需引物较多，在测序反应时会造成工作量较大，同时也增加了错误率的发生，给实验造成了很大的不便，本发明通过在特异性pcr扩增引物5，端加上特殊测序通用引物接头，通过对比发现，加上所述测序通用引物之后，在sanger测序时比不加所述测序引物接头可节约15min-30min的时间，同时可以大大降低由非通用测序引物造成的错误率，从而显著提高工作效率。上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属
技术领域：
中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。序列表<110>上海新培晶医学检验所有限公司<120>一种检测aml患者预后基因突变的试剂盒及其检测方法<130>176816<160>46<170>siposequencelisting1.0<210>2<211>43<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2gtaaaacgacggccagtggttttcatttccattgattatagaa43<210>3<211>33<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3ggaaacagctatgaccatgtcagcgggctacca33<210>3<211>35<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3gtaaaacgacggccagtgggcagaaatgggcttga35<210>4<211>44<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4ggaaacagctatgaccatgctgtagaggttaatatccgcaaatg44<210>5<211>38<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5gtaaaacgacggccagtgatgtagggctagaggggtga38<210>6<211>39<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6ggaaacagctatgaccatgacaggcaaagctgagcaaaa39<210>7<211>38<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7gtaaaacgacggccagtgccacgtgcataaggaacagt38<210>8<211>39<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8ggaaacagctatgaccatgtggaatcagcagaaacagcc39<210>9<211>38<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9gtaaaacgacggccagtgaaaggcccctgaacgtgtat38<210>10<211>39<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10ggaaacagctatgaccatgaaagctgagacgagtgcctc39<210>11<211>40<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>11gtaaaacgacggccagtgtcattgctattcctctgcaacc40<210>12<211>39<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>12ggaaacagctatgaccatgtgtgggtttgttgccatgaa39<210>13<211>38<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>13gtaaaacgacggccagtggccaaaattccgggagtgtt38<210>14<211>39<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>14ggaaacagctatgaccatgggtccctgagtataccagcc39<210>15<211>38<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>15gtaaaacgacggccagtggacagtggccccaaattcag38<210>16<211>39<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>16ggaaacagctatgaccatgctgttggttcgaggcctttc39<210>17<211>39<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>17gtaaaacgacggccagtgtgaacaagggccactcatttc39<210>18<211>39<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>18ggaaacagctatgaccatgccaactccttcatgcacctc39<210>19<211>38<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>19gtaaaacgacggccagtgctaggcggtatcatcctggg38<210>20<211>39<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>20ggaaacagctatgaccatgatggagaactggtaggagcc39<210>21<211>39<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>21gtaaaacgacggccagtgccctcctaccacctgtactac39<210>22<211>39<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>22ggaaacagctatgaccatgttgtcgcgaacaggaggccc39<210>23<211>39<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>23gtaaaacgacggccagtgagcagccattcttttcctgct39<210>24<211>40<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>24ggaaacagctatgaccatgattttcgcttcccacaggtct40<210>25<211>39<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>25gtaaaacgacggccagtgccccctctgagtcaggaaaca39<210>26<211>40<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>26ggaaacagctatgaccatgaggaagccaaagggtgaagag40<210>27<211>38<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>27gtaaaacgacggccagtggaggtgtagacgccaactct38<210>28<211>39<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>28ggaaacagctatgaccatgatcagtgaggaatcagaggc39<210>29<211>41<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>29gtaaaacgacggccagtgccatgagcgctgctcagatagcg41<210>30<211>43<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>30ggaaacagctatgaccatgtactgctcacctggagggccactg43<210>31<211>38<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>31gtaaaacgacggccagtgttgccacaggtctccccaag38<210>32<211>39<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>32ggaaacagctatgaccatgccggggatgtgatgagaggt39<210>33<211>38<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>33gtaaaacgacggccagtgccagaaaggacaagggtggt38<210>34<211>40<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>34ggaaacagctatgaccatgatctgaggcataactgcaccc40<210>35<211>38<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>35gtaaaacgacggccagtgccaagggtgcagttatgcct38<210>36<211>39<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>36ggaaacagctatgaccatgagctacaaccaggagccatt39<210>37<211>41<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>37gtaaaacgacggccagtgtacttacttctccccctcctctg41<210>38<211>39<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>38ggaaacagctatgaccatgagatggggtcagctgccttt39<210>39<211>38<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>39gtaaaacgacggccagtgggcccttcaaagcattggtc38<210>40<211>40<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>40ggaaacagctatgaccatgtctcccaaacatccctcacag40<210>41<211>38<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>41gtaaaacgacggccagtgcatggggatctggagtgtga38<210>42<211>39<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>42ggaaacagctatgaccatgtcagaatgcaaaatggcccc39<210>43<211>42<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>43gtaaaacgacggccagtgtgcagacattgcaggcatggcagg42<210>44<211>43<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>44ggaaacagctatgaccatggcactattccttctctcaactgag43<210>45<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>45gtaaaacgacggccagtg18<210>46<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>46ggaaacagctatgaccatg19当前第1页12