本发明涉及分子生物学基因技术领域和医学领域，涉及用分子生物学方法对肌萎缩侧索硬化症（als）相关sod1基因突变进行检测的引物组，特别涉及用iontorrent半导体芯片测序技术对als相关sod1基因突变进行定性、定量检测的相关引物组及其试剂盒。
背景技术：
肌萎缩侧索硬化症（amyotrophiclateralsclerosis，als）也叫运动神经元病（mnd），是一种选择性侵犯上、下运动神经元的致死性神经退行性疾病，以皮质、脑干、脊髓运动神经元进行性死亡导致肌无力、肌萎缩和呼吸肌瘫痪为特征。患者出现进行性加重的肌无力和肌肉萎缩，多在起病后3~10年内因呼吸功能衰竭死亡。als按其起病方式可分为散发性als（sporadicals,sals）和家族性als（familialamyotrophiclateralsclerosis,fals），sals占90%~95%，fals占5%~10%，两者在临床表现上并无明显区。
als多为成人隐袭起病，慢性进行性发展，兼有上下运动神经元受损的症状和体征，表现为肌无力，肌萎缩和锥体束征，一般无感觉障碍以及大小便障碍。
关于als的发病机制有较多理论，其中对sod1基因（铜锌超氧化物岐化酶基因）致病机制研究最多，但具体发病机制尚不清，目前的共识是sod1基因突变导致蛋白毒性功能获得（toxicgainoffunction）而不是功能丧失（lossoffunction）。家族性肌萎缩侧索硬化（familyamyotrophiclateralsclerosis,fals）中有15%~20%的家系是sod1基因突变家系，到目前为止，在fals患者中已发现sod1基因有超过150多个突变位点。
sod1基因定位于21q22.11，基因组dna全长11kb，含有5个外显子，编码一种153个氨基酸的sod1蛋白。该蛋白是一种自由基清除酶，在神经组织、肝脏、红细胞中高表达，主要功能是清除细胞内的超氧自由基。约20%的fals和5%的sals与该基因突变有关，主要为点突变，其中错义突变占绝大多数。
目前检测als相关sod1基因突变位点的方法有pcr-sscp、经典测序等，存在通量低、成本贵等问题，对pcr产物长度也有一定限制。
iontorrent半导体芯片测序技术是新一代的测序技术，它的核心技术是使用半导体技术在化学和数字信息之间建立直接的联系。在半导体芯片的微孔中的微球上固定dna链，随后依次掺入单核苷酸dgtp、dctp、datp、dttp。随着每个碱基的掺入，释放出h+，h+在它们穿过每个孔底部时能被检测到，通过对h+的检测，实时判读碱基。由于其化学测序原理自然简单，无修饰的核苷酸、无激光器或光学检测设备，因而可达到极小的测序偏差和出色的测序覆盖均衡度，一台仪器即可适合各种测序通量需求的科学研究，在较短的时间内获得真实可靠的实验结果。
iontorrent半导体芯片测序技术与传统sanger法及二代测序技术比较，iontorrent技术有以下优势：系统无激光光源，无光学系统，无照相系统；使用无标记的核苷酸及酶进行测序，本底干扰低；通过对h+的检测，可以改善碱基判读准确性；测序通量大、速度快，完成1g通量的测序检测仅需2~3小时，是传统sanger测序方法通量的数千倍以上，同时弥补了已有二代高通量测序方法工作时间过长的缺陷。
目前尚没有报道iontorrent半导体芯片测序技术专门用于als相关sod1基因突变的检测。
技术实现要素：
本发明的目的是为了弥补现有技术的不足，提供针对als相关sod1基因突变的定性、定量检测的方法及其引物。
为解决上述问题，本发明采取以下技术方案：
利用生物信息学知识和相关生物信息学软件，对公开数据库中所能检索到的als相关sod1基因突变区域序列，用primerexpresssoftware5.0软件设计pcr引物。
用于检测sod1基因序列片段1的引物，是由序列表中seqidno:1和seqidno:2组成的引物对。
上游引物：5’-agtagaattaggaaccaggacctcggc-3’seqidno:1；
下游引物：5’-cctcgcaaacaagcctcc-3’seqidno:2。
用于检测sod1基因序列片段2的引物，是由序列表中seqidno:3和seqidno:4组成的引物对。
上游引物：5’-agtagaattactccaacttcgcacttttctta-3’seqidno:3；
下游引物：5’-cagcacagcacaacaccca-3’seqidno:4。
用于检测sod1基因序列片段3的引物，是由序列表中seqidno:5和seqidno:6组成的引物对。
上游引物：5’-agtagaattagggagttttagcagtgtttctttt-3’seqidno:5；
下游引物：5’-gctatcgccattattacaagagtta-3’seqidno:6。
用于检测sod1基因序列片段4的引物，是由序列表中seqidno:7和seqidno:8组成的引物对。
上游引物：5’-agtagaattagccctaatccatctgatgctt-3’seqidno:7；
下游引物：5’-ttatgcttatccttttatgaaaacttac-3’seqidno:8。
用于检测sod1基因序列片段5的引物，是由序列表中seqidno:9和seqidno:10组成的引物对。
上游引物：5’-agtagaattaaagagtgactgcggaactaagg-3’seqidno:9；
下游引物：5’-gggctcagactacatccaagg-3’seqidno:10。
采用多重pcr的方法用上述引物组对待检测样本进行pcr扩增。
将pcr扩增产物进行扩增子文库的构建、isp（ionsphere™particles,ion微球）模板的制备，在iontorrentpgm系统上进行测序，并用软件对相关测序序列进行分析。
本发明利用多重pcr方法结合iontorrent半导体芯片测序技术同时对als相关sod1基因突变进行并行检测，其优势在于通量大，特异性及灵敏度高，结果稳定，重复性好，检测速度快的优点。
具体实施方式
本发明结合具体实施例做进一步说明。应理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。
实施例1、用于als相关sod1基因突变检测的引物组的设计。
利用生物信息学知识和相关生物信息学软件，对公开数据库中所能检索到的als相关sod1基因突变区域序列，用primerexpresssoftware5.0软件设计pcr引物，引物序列为如下。
用于检测sod1基因序列片段1的引物，是由序列表中seqidno:1和seqidno:2组成的引物对。
上游引物：5’-agtagaattaggaaccaggacctcggc-3’seqidno:1；
下游引物：5’-cctcgcaaacaagcctcc-3’seqidno:2。
用于检测sod1基因序列片段2的引物，是由序列表中seqidno:3和seqidno:4组成的引物对。
上游引物：5’-agtagaattactccaacttcgcacttttctta-3’seqidno:3；
下游引物：5’-cagcacagcacaacaccca-3’seqidno:4。
用于检测sod1基因序列片段3的引物，是由序列表中seqidno:5和seqidno:6组成的引物对。
上游引物：5’-agtagaattagggagttttagcagtgtttctttt-3’seqidno:5；
下游引物：5’-gctatcgccattattacaagagtta-3’seqidno:6。
用于检测sod1基因序列片段4的引物，是由序列表中seqidno:7和seqidno:8组成的引物对。
上游引物：5’-agtagaattagccctaatccatctgatgctt-3’seqidno:7；
下游引物：5’-ttatgcttatccttttatgaaaacttac-3’seqidno:8。
用于检测sod1基因序列片段5的引物，是由序列表中seqidno:9和seqidno:10组成的引物对。
上游引物：5’-agtagaattaaagagtgactgcggaactaagg-3’seqidno:9；
下游引物：5’-gggctcagactacatccaagg-3’seqidno:10。
每个检测序列片段的上游引物5’端均包含一段用于识别样本信息的barcode序列5’-agtagaatta-3’。
实施例2、als相关sod1基因突变的检测。
1）样本基因组dna的获取
用细胞裂解法提取口腔黏膜脱落细胞中的dna，悬浮于1ml生理盐水中，2000×g离心10min；弃上清，每管加1ml生理盐水重复洗涤1次，再2000×g离心10min；弃上清，每管加400μl细胞裂解缓冲液（10mmol/ltris-hcl,ph8.0;0.1moledta,ph8.0;0.5%sds），放在50℃水浴中温育30min；然后冷却至室温，加等体积的酚—氯仿—异戊醇（体积比25:24:1），混匀，5000×g离心10min；转移上层水相到另一离心管中，重复抽提1次；再转移上层水相到另一eppendorf管中，加1/10体积的3mnaac(ph5.2)，混匀；加入2.5倍体积的95%冷乙醇，混匀，-20℃沉淀dna30min；10000×g离心15min，弃上清；加1ml70%冷乙醇清洗沉淀，10000×g离心15min，弃上清；37℃温箱30min烘干；将dna沉淀溶于20μlte缓冲液中，加1μlrna酶，37℃30min，置于-20℃保存。
2）pcr的扩增和测序
以步骤1）提取的样本基因组dna为模板，在实施例1所述引物的引导下，进行多重pcr扩增（95℃5min;95℃15s，60℃1min，共40个循环），获得的扩增产物依次进行扩增子文库的构建，isp（ionsphere™particles,ion微球）模板的制备，以及芯片上样和在iontorrentpgm系统上进行测序。
3）分析并获得结论
用igv2.0软件对测序结果进行分析，统计以下五个sod1基因片段的读序结果，根据检测结果对每个突变位点进行判断其为野生型或突变性，如为野生型，则结果提示为“突变阴性”，如为突变型，则结果提示为“突变阳性”。
如在所有检测位点中存在“突变阳性”结果，则本次检测的结论为：“该受检者所检sod1基因中检出×××（突变位点）突变，提示肌萎缩侧索硬化症als”。
如在所有检测位点中均为“突变阴性”结果，则本次检测的结论为：“该受检者所检sod1基因中未检出突变”。
检测样本一个，检测结果及结论见下表。
序列表
<110>上海联吉医学检验所有限公司
<120>als相关sod1基因突变的检测方法及其引物组
<160>10
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>27
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
agtagaattaggaaccaggacctcggc27
<210>2
<211>18
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
cctcgcaaacaagcctcc18
<210>3
<211>32
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
agtagaattactccaacttcgcacttttctta32
<210>4
<211>19
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>4
cagcacagcacaacaccca19
<210>5
<211>34
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>5
agtagaattagggagttttagcagtgtttctttt34
<210>6
<211>25
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>6
gctatcgccattattacaagagtta25
<210>7
<211>31
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>7
agtagaattagccctaatccatctgatgctt31
<210>8
<211>28
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>8
ttatgcttatccttttatgaaaacttac28
<210>9
<211>32
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>9
agtagaattaaagagtgactgcggaactaagg32
<210>10
<211>21
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>10
gggctcagactacatccaagg21